Name: 細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学ぶ細菌接合における転写タンパク質の配列特異的分析法。相同組換えによる遺伝子ノックアウトと交配アッセイを用いて、プラスミド伝達能とタンパク質間相互作用領域を評価する実験手法です。

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この研究は、自然科学からディスカバリーグラント＆カナダのエンジニアリング評議会（NSERC）によってサポートされていました。

<ol><li>Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+islands+in+pathogenic+and+environmental+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).</li>
<li>Furuya, E. Y., Lowy, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial-resistant+bacteria+in+the+community+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).</li>
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<li>Cooper, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+Speeds+Adaptation+by+Reducing+Competition+between+Beneficial+Mutations+in+Populations+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli.</a> PLoS Biol. Barton, N. H. 5 (9), 225(2007).</li>
<li>Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+antibiotic+resistance+propagation+by+inhibiting+the+conjugative+DNA+relaxase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).</li>
<li>Carattoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+and+the+spread+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plasmids and the spread of resistance.</a> Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).</li>
<li>Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShala%2C+A+%22Handbook+of+Clinical+Nanomedicine%3A+Nanoparticles%2C+Imaging%2C+Therapy+and+Clinical+Applications%22">Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications</a>. Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. , Pan Sanford Publishing. Singapore. 657-686 (2016).</li>
<li>Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+systems+in+bacterial-host+associations%2C+and+their+description+in+the+Gene+Ontology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology.</a> BMC Microbiol. 9 (1), Suppl 1 2(2009).</li>
<li>Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+diversity+of+prokaryotic+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).</li>
<li>Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F+factor+conjugation+is+a+true+type+IV+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">F factor conjugation is a true type IV secretion system.</a> FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).</li>
<li>Lederberg, J., Tatum, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Recombination+in+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gene Recombination in Escherichia Coli.</a> Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).</li>
<li>Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+Plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mobility of Plasmids.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).</li>
<li>Willetts, N., Skurray, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Conjugation+System+of+F-Like+Plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The Conjugation System of F-Like Plasmids.</a> Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).</li>
<li>Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+sequence+and+gene+products+of+the+transfer+region+of+the+F+sex+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor.</a> Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).</li>
<li>Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+exclusion+in+F-like+plasmids+requires+intact+TraG+in+the+donor+that+recognizes+its+cognate+TraS+in+the+recipient%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient.</a> Microbiology. 153, Pt 2 442-451 (2007).</li>
<li>Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+Architecture%2C+and+Function+of+Bacterial+Type+Iv+Secretion+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).</li>
<li>Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+secretion%3A+the+Agrobacterium+VirB%2FD4+and+related+conjugation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+-+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems.</a> Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).</li>
<li>Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a, Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+bacterial+type+IV+secretion+lexicon%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The expanding bacterial type IV secretion lexicon.</a> Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).</li>
<li>Christie, P. J., Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+dynamic+properties+of+bacterial+Type+IV+secretion+systems+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review).</a> Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).</li>
<li>Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+secretion%3A+Intercellular+transfer+of+macromolecules+by+systems+ancestrally+related+to+conjugation+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines.</a> Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).</li>
<li>Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+structure+of+the+bacterial+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems.</a> Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).</li>
<li>Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion toolkit.</a> EMBO Rep. 9, 735(2008).</li>
<li>Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Regulation+of+the+Type+VI+Secretion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Regulation of the Type VI Secretion System.</a> Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).</li>
<li>Chandran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+outer+membrane+complex+of+a+type+IV+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system.</a> Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).</li>
<li>Rivera-Calzada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+bacterial+type+IV+secretion+core+complex+at+subnanometre+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution.</a> EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).</li>
<li>Waksman, G., Fronzes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+bacterial+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems.</a> Trends Biochem Sci. 35, 691(2010).</li>
<li>Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+biology+of+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The structural biology of type IV secretion systems.</a> Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).</li>
<li>Kaplan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+a+cell-embedded+megadalton+protein+complex+by+DNP-supported+solid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR.</a> Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).</li>
<li>Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+sex-factor-affinity+site+in+E.+coli+as+gamma+delta%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, Pt 1 135-140 (1981).</li>
<li>Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+pilus+in+recipient+cell+recognition+during+bacterial+conjugation+mediated+by+F-like+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids.</a> Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).</li>
<li>Jobling, M. G., Holmes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+vectors+with+the+pl5a+replicon%2C+kanamycin+resistance%2C+inducible+lacZ%CE%B1+and+pUC18+or+pUC19+multiple+cloning+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites.</a> Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315(1990).</li>
<li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+regulation%2C+modulation%2C+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+P%28BAD%29+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter.</a> J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).</li>
<li>Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+Mutational+Analysis+of+Conjugative+Transfer+Region+1+%28Tra1%29+from+the+IncHI1+Plasmid+R27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27.</a> J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).</li>
<li>Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Like+Type+IV+Secretion+Systems+Encode+Proteins+with+Thioredoxin+Folds+That+Are+Putative+DsbC+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues.</a> J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).</li>
<li>Hazes, B., Frost, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+systems+biology+approach+to+study+type+II%2FIV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems.</a> Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).</li>
<li>Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDX-MS+and+deletion+analysis+of+the+type+4+secretion+system+protein+TraF+from+the+Escherichia+coli+F+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid.</a> FEBS Lett. Tsolis, R. 590 (3), 376-386 (2016).</li>
<li>Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+protein+nanotubes%3A+Learning+from+nature%27s+nanotech+examples%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature's nanotech examples.</a> Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).</li>
<li>Harris, R. L., Silverman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tra+proteins+characteristic+of+F-like+type+IV+secretion+systems+constitute+an+interaction+group+by+yeast+two-hybrid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis.</a> J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).</li>
<li>Moore, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+F-Plasmid+Conjugative+Transfer+Gene+traU%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU.</a> J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).</li>
<li>Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+pilus+in+recipient+cell+recognition+during+bacterial+conjugation+mediated+by+F-like+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids.</a> Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).</li>
<li>Klimke, W. A., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+role+of+the+transfer+gene%2C+traN%2C+of+the+F+and+R100-1+plasmids+in+mating+pair+stabilization+during+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation.</a> J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).</li>
<li>Jiang, W., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas%3A+New+Tools+for+Genetic+Manipulations+from+Bacterial+Immunity+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).</li>
<li>Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+bacterial+conjugation+by+plasmids+from+marine+environments+visualized+by+gfp+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression.</a> Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

細菌接合プロセスは、細菌は、抗生物質耐性マーカーの普及など厳しい環境での成長のための進化上の利点を提供する遺伝子を広げることができる手段を提供します。接合性プラスミドの多くは非常に大きいので、接合プラスミド自体に標的遺伝子の突然変異によって転写装置の組み立てに関与するタンパク質上の12機能的研究は扱いにくいです。本明細書で詳細なプロトコルは、一つにはより容易に、より小さく扱い発現プラスミド（ 図1）を使用することによって、目的の標的遺伝子を評価することができる手段を提供します。我々は、Fプラスミド媒介性の結合を研究するためにFプラスミドの誘導体pOX38-TC（ 表1）を使用します 。他の接合性プラスミドはここで詳述プロトコルと適切な派生プラスミドを使用して研究することができます。概説交配アッセイは、いくつかのmodificatiとフロストや同僚、42から適応されていますアドオン。以前の研究では、pOX38-TCΔgene:: Cmを構築物の8,33,42作成は、適切な制...

ミクロ生物レベルでの遺伝子やタンパク質の転送は、細菌の生存と発展だけでなく、感染の過程において中心的な役割を果たしています。細菌の間、または細菌と細胞間のDNAの交換は、形質転換、接合またはベクターの形質導入によって達成することができます。 1,2結合は、複雑な高分子システムがドナーとレシピエント細胞を接続することによりDNAの転移がドナー・制御された様式で発生し、 大腸菌などのグラム陰性菌間の共役中にその中の形質転換および形質導入と比較してユニークです。結合はまた、細菌細胞は、ホストシステムの中での遺伝子、タンパク質または化学物質を注入するために、宿主細胞と相互作用する最も直接的な方法です。 図3は、かなり頻繁に、このような薬剤の転送は、進化と適応をホストするために発病し、発癌に至るまで、ホスト上の顕著な効果を持っています。その接合recombinatioが示されていますnは環境ストレスの条件下で高い突然変異率を持つ細菌に適応3倍の速度を増加させます。 4さらに、結合は、はるかに菌株における抗生物質耐性遺伝子が拡散され、それを通して、最も一般的な経路です。 5,6 微生物は細胞膜を横切る巨大分子の転送をサポートするために特殊な分泌系を進化させてきました。 T1SS、T2SS、T3SS、T4SS、T5SS、T6SS、T7SS、ならびに秒（分泌）およびTat（2-アルギニン転座）：記載されているグラム陰性菌における分泌系（のTSS）の9種類が現在あります経路。分泌系の7,8各タイプは、さらに、異なるサブタイプに起因するタンパク質の多様性と異なる細菌株で、関与する経路の特殊性への必要性を分割されています。例えば、IV型分泌系（T4SS）で、TiおよびCAGシステムはF-プラスミド、R27 Aに対し、エフェクター輸送を促進しますND pKM101 T4SSsは、接合性プラスミドの伝達を促進します。生物はその構成タンパク質からそれぞれの分泌系を組み立てると、受信者またはその周囲の環境と細胞内容を共有するメカニズムの7,9,10詳細な理解は、病原性微生物やプロセスに対抗するための目標と戦略の開発における重要な因子であります携帯感染。 レーダーバーグ＆テイタムによって大腸菌での最初の同定細菌接合に続いて、モバイルおよび接合性プラスミドの11多数同定され、特徴付けられています。 12このようなモバイルプラスミドは、かなりの範囲は（1から200以上のキロベース（キロバイト）まで）のサイズであることを示す、しかしすべてのモバイルプラスミドは、それによって、プラスミドの伝達を可能にする転送（oriTを）の原点を認識しrelaxaseを、含まれています。機能T4SSの組み立てだけでなく、タイプの接合プラスミドさらにエンコード遺伝子IV結合タンパク質。 12例えば、 大腸菌の100キロバイトFプラスミドは33.3 kBの転送（TRA）領域内のすべての接合の遺伝子をコードしています。 13ペア形成（MPF）、DNA転移と除外機能を交配線毛形成を促進する全てのタンパク質、接合性プラスミドの転送中にFプラスミドエンコードのTRA領域における遺伝子。 10,14,15は、知識の重要な身体は、接合T4SSsのために利用可能である、しかし、唯一のより最近利用可能になってきている共役タンパク質との複合体の構造研究を詳述しました。 16から28 接合プロセスの包括的なビューを組み立てるためには、接合伝達タンパク質の変異分析に詳細な構造研究のカップリングが必要です。これは、接合交配アッセイを介して達成することができます。 Fプラスミドは、TRA領域内にコードされる各タンパク質は、F媒介コにおいて役割を果たすnjugation;従って、転写遺伝子のノックアウト/欠失は、細胞の接合容量（ 図1）を廃止します。小さい携帯プラスミドは、標準的な削除の手続きをより助長しているが、このようなFのようなより大きな接合プラスミドのために、遺伝子ノックアウトは、より容易に標的遺伝子は明確な抗生物質耐性遺伝子を伝えるものに交換され、相同組換えを介して達成されます。現在のプロトコルでは、我々は55キロバイトFプラスミドの誘導体pOX38-TCでクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）と利益の伝達遺伝子を置き換えるために、相同組換えを利用します。 29,30、得られたノックアウトプラスミド、pOX38-TCΔgene:: Cmが、増殖培地中のクロラムフェニコール（CM）の存在に対する抵抗性を促進します。 pOX38-TCΔgene:: Cmとを保有するドナー細胞は交配アッセイの使用を介して観察されるように接合DNA転送/交配に影響を与えることができません。 pOX38-TCΔgene:: Cmをドナー細胞と正常RECIPの接合効率ientは廃止され、より多くの場合、減少またはます。 pOX38-TCΔgene:: Cmをプラスミドの接合伝達を標的に転送遺伝子を保有する小型の回復プラスミドを経由して復元することができます。この回復プラスミドは、プラスミドpK184（pK184遺伝子）、31または限り、そのプラスミドが適切細胞（細胞質またはペリプラズム）内の正しい場所に遺伝子を標的として誘導性の発現を提供するものとして、構成的発現を提供するものであることができます。したがって、この新しいドナー間の交配アッセイ（pOX38-TCΔgene:: Cmを+ pK184遺伝子のプラスミドを有します） そして、レシピエント細胞は、接合効率はほぼその正常ドナー・レシピエントの交配アッセイのに復元することが期待されます。このシステムは、CM曲庇:: pK184-遺伝子構築物（欠失または点変異）の一連の生成を介してとpOX38-TCΔgeneの交配能力を回復するために各構築物の能力を試験するノックアウト遺伝子の機能を調べるために1を可能にしますドナー細胞秒。

<table><tbody><tr><td>GeneJet プラスミド ミニプレップキット</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet ゲル抽出キット</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0692</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet PCR 精製キット</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0702</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>Broad Range DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0303A</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td>・<td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター</td><td>エッペンドルフ</td><td>4309000027</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーション・キュベット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>FB101</td><td>キュベットには 1mm のギャップがあります。</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA ポリメラーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td></td><td></td><td>Final Concentrations</td></tr><tr><td>Chloramphenicol (Cm)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP904-100</td><td>20 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>カナマイシン (Km)</td><td>バイオベーシック株式会社</td><td>DB0286</td><td>50 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>ナリジクス酸 (Nal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878-25G</td><td>10 & micro;g/mL</td></tr><tr><td>リファンピシン (Rif)</td><td>Calbiochem</td><td>557303</td><td>20 &g/mL</td></tr><tr><td>テトラサイクリン (Tc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td>10 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>ストレプトマイシン (Sm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td>50 &micro;グラム/mL</td></tr></tbody></table>

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

細菌の結合による遺伝物質の移動は、特定の移動タンパク質によって形成された複合体を介して行われるプロセスです。大腸菌では、これらの転写タンパク質が、交配ペア形成またはDNA転写複合体として知られるDNA転写機構を構成し、結合プラスミド輸送を促進します。この論文の目的は、一連の欠失および/または点突然変異を交配アッセイと組み合わせて使用し、結合に関与する特定の転写タンパク質の役割を決定するために使用できる方法を提供することです。標的遺伝子は、結合型プラスミド上でノックアウトされ、次いで、標的遺伝子を有する小さなリカバリープラスミドを用いてトランスで提供されます。リカバリープラスミド上の標的遺伝子に影響を与える変異は、変異遺伝子を保有するドナー細胞の交配効率の変化をもたらす標的タンパク質の機能的側面に関する情報を明らかにすることができます。交配効率の変化は、結合DNA転写を促進する上での特定の転写タンパク質またはその中の領域の役割と重要性についての洞察を提供します。この嵌合アッセイを詳細な三次元構造研究と組み合わせることで、結合性トランスファータンパク質の機能を包括的に理解できるだけでなく、タンパク質間相互作用の領域を同定し、特性評価する手段を提供することができます。

Fプラスミド駆動型細菌接合プロセスは、線毛の合成と接合DNAの転送を容易にするT4SSを組み立てるF-プラスミドのTRA領域内に伝達タンパク質を伴う協調プロセスです。タンパク質TRAF（GenBankアクセッション番号BAA97961、UniProtのID P14497）は、接合F線毛形成に必要とされます。 10,14,35 -それは、触媒CXXCモチーフを持っていませんが、37タンパク質は、C末端チオレドキシン様ドメインが含まれています。それは、そのN末端ドメインを介してTraHタンパク質と相互作用すると予測されているが35,38、39地域は他にあまりない37は 、タンパク質の構造的特徴について知られている、そのC末端ドメインよりも、よりダイナミックであることが示されました。構造研究と併せてTRAFタンパク質の機能的側面を評価するために、我々はまず、相同経由pOX38-TCにTRAF遺伝子をノックアウト...

ここでは、プラスミド結合に関与する目的の遺伝子をノックアウトするプロトコルを提示し、その後、交配アッセイを使用してその不在の影響を分析します。遺伝子の機能は、欠失または点突然変異を使用して、その配列の特定の領域にさらに調査されます。

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

この交配アッセイの全体的な目標は、機能的なタイプ4の分泌複合体の状況下でプラスミドトランスファーに影響を与える能力に対する共役型トランスファー遺伝子内の突然変異の影響を評価することです。この方法では、細菌の結合において機能的なタイプ4の分泌系を組み立てる際に、トランスファータンパク質間で発生するタンパク質間相互作用の領域を特定するなど、タンパク質特異的な疑問を投げかけることができます。この手法では、大きなコンジュガティブプラスミド上の遺伝子が相同組換えによってノックアウトされます。遺伝子機能は、より小さなプラスミドのノックアウトに標的遺伝子を提供することによって評価されます。一般的に、この手順を成功させるには組織とセットアップが重要であるため、この方法に不慣れな個人は苦労します。解釈可能な結果を得るためには、適切な実験準備が必要です。このプロトコールは、テキストプロトコールに記載されているように、消化されたpBAD33プラスミドの調製から開始します。各消化物をアガロースゲルで分析します。UVキャビネットと滅菌カミソリを使用して、カテーテル配列に対応する2.8キロのベースバンドをゲルから切り取ります。DNAの紫外線曝露を最小限に抑えるために迅速に作業します。メーカーのプロトコルに従って、ゲル抽出キットを使用して、切り取ったゲルスライスからDNAを抽出します。抽出したキャットカセットをポリメラーゼ連鎖反応またはPCRで増幅します。滅菌PCRチューブで反応混合物を調製します。相同組換えのためには、標的遺伝子配列と相同なオーバーハングを含むプライマーを使用してください。テンプレートDNAを二重蒸留水に置き換えることを除いて、同じコンポーネントを持つネガティブコントロールを設定します。また、PCR反応で機能することが証明されているテンプレートDNAとプライマーを使用して、ポジティブコントロールをセットアップします。ピペッティングですべての反応内容物を穏やかに混合します。次に、テキストプロトコルに記載されているPCRパラメータを使用して、抽出した猫カセットを増幅します。各反応をわずか5マイクロリットル使用して、アガロースゲル電気泳動による増幅の正しいサイズを確認します。PCRアンプリコンを、メーカーのプロトコールに適合するPCR精製キットを用いて精製します。300ナノグラムの増幅された猫用カセットを50マイクロリットルの電気コンピテントDY330R細胞に加え、氷上にpOX38-Tcプラスミドを留置します。ピペットで優しく上下させて混ぜます。未修飾のpBAD33プラスミドをポジティブコントロールとして使用して、このステップを繰り返します。次に、細胞を予冷した1mmエレクトロポレーションキュベットに移します。エレクトロポレーターを使用して、1.8キロボルトで5.5ミリ秒の時定数でセルをエレクトロポレーションします。パルスを印加した直後に、細胞を1ミリリットルのSOC培地で希釈し、新しいマイクロチューブに移します。細胞を摂氏32度で2時間インキュベートします。次に、各サンプルの100マイクロリットルを、1ミリリットルあたり10マイクログラムのテトラサイクリンと1ミリリットルあたり20マイクログラムのクロラムフェニコールを含む寒天プレートにアリコートします。滅菌スプレッダーを使用して、アリコートをプレート上に広げます。プレートを逆さまにして摂氏32度で一晩インキュベートします。翌日、成功した組換え体を選択します。細胞に導入された猫カセットは、目的の遺伝子と相同組換えを受け、pOX38-Tcクロラムフェニコールノックアウトクローンを作成します。300ナノグラムのpK184遺伝子またはpK184遺伝子変異プラスミドを、前回と同様にpOX38-Tcクロラムフェニコールノックアウトプラスミドを有する50マイクロリットルの電気全能DY330R細胞に分離します。XK1200ドナー細胞を生成するには、共役交配を行い、続いてエレクトロポレーションを行い、テキストプロトコルに記載されているように、クロラムフェニコールノックアウトとPK184プラスミドの両方をハーポアするXK1200細胞を生成します。これらのXK1200ドナー細胞を、クロラムフェニコールとカナマイシンを含む20ミリリットルの滅菌LBで一晩培養します。また、グリセロールストックまたは寒天プレート上の単一コロニーからの細胞を使用して、50ミリリットルのLBに50マイクログラムのストレプトマイシンを含むMC4100レシピエント細胞を調製します。200rpmで振とうしながら、摂氏37度で培養物を成長させます。グルコースを最終濃度100ミリモルまで、すべてのドナー細胞に加えます。翌日、各一晩培養物から70分の1の希釈液を、同じ抗生物質を含む2ミリリットルの滅菌LBで別々に作ります。細胞を摂氏37度で中対数期まで成長させ、200rpmで振とうします。細胞培養物を遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄します。次に、細胞ペレットを冷たい滅菌LBで一度洗浄して抗生物質を取り除きます。前と同じように2回目の遠心分離を行った後、細胞を2ミリリットルの冷たく滅菌 LB.In に懸濁し、100マイクロリットルのドナー細胞と100マイクロリットルのレシピエント細胞を800マイクロリットルの滅菌LB培地に分注し、総容量1ミリリットルにします。細胞を振らずに摂氏37度で1時間交配させます。1時間後、細胞を30秒間ボルテックスして、交配ペアを乱します。次に、細胞を氷上に10分間置き、それ以上の交配を防ぎます。ミッドログ培養物と新鮮な滅菌LBを使用して、ドナー細胞とレシピエント細胞の1および100万から1および1000万までの6つの段階希釈液を調製します。ナラジキシン酸、クロラムフェニコール、カナマイシンを含む寒天プレートの2つの半分のそれぞれに、XK1200ドナー細胞の各希釈液の10マイクロリットルのアリコートを見つけます。ストレプトマイシンを含む寒天プレート上のレシピエントMC4100細胞の希釈についてスポッティングを繰り返します。次に、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。次に、ボルテックス混合物と新鮮な滅菌LBを使用して、トランスコンジュガントの6希釈液を調製します。pOX38-TCクロラムフェニコールノックアウトブを保有するトランスコンジュガントMC4100細胞に選択し、ストレプトマイシンとクロラムフェニコールを含む寒天プレートの各半分に各希釈の10マイクロリットルアリコートをスポッティングします。両方の重複する混合物について繰り返します。次に、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。それぞれのプレート上の各ドナー、レシピエント、およびトランスコンジュガント細胞について、同じ希釈スポッティングからのコロニー数をカウントすることにより、嵌合効率を計算します。また、レシピエントコロニーをカウントして、その希釈率でレシピエントよりも多くのトランスコンジュガントに起因するバイアスをテストします。交配効率は、トランスコンジュガントコロニーの数をドナーコロニーの数で割った値に100を掛けて、ドナー細胞100個あたりの効率値を求めます。4型分泌系gene-tra-FがpOX38-Tcプラスミドからノックアウトされると、pOX38-TcトラFクロラムフェニコールノックアウトプラスミドのドナー細胞からレシピエント細胞への結合転写が失われます。しかし、PK184 traFプラスミドとドナー細胞によりtraF遺伝子をtransで提供すると、pOX38-TcのtraFクロラムフェニコールノックアウトプラスミドの結合転写の回復が観察される。traFとPK184プラスミドの希釈変異体をドナー細胞に与えると、pOX38-TcのtraFクロラムフェニコールノックアウトプラスミドの結合転写の損失が観察されます。抱合体転移の喪失は、共役型4分泌系内のタンパク質間相互作用に重要なタンパク質の領域を示しています。この領域は、転写の効率に影響を与える点突然変異によって、より詳細に調べることができます。一度習得すると、このテクニックは予想される成長時間で1営業日で実行できます。このプロトコルは、ここで示すもの以外の細胞で行うことができます。この時点で重要な点は、ドナー細胞とレシピエント細胞が目的のプラスミドを保有していないことです。そのため、ノックアウトプラスミドを追加しても、相反する結果が得られません。この手順を試みる際には、ドナー細胞、レシピエント細胞、およびトランスコンジュゲート細胞に異なる増殖条件と抗生物質があるため、非常に整理整頓することが重要です。この手順に続いて、結晶学、NMR、質量分析などの他の方法を実行して、目的のタンパク質の詳細な構造的および機能的画像を取得できます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

既製のアクセプター株、と呼ばれる着陸パッド株に興味のある外来DNAを統合するための迅速かつ効率的な方法が記載されている。メソッドは、ΦC31インテグラーゼの結合と表現を通して、与えられた菌株の人工着陸パッドの座にDNAカセットの部位特異的に統合することができます。...

サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

出典: Erdogan、F.、et al.、 細菌の接合に関与するトランスファータンパク質の配列特異的分析のための共役交配アッセイ。 J. Vis. 経験。 (2017年)このビデオでは、レスキュープラスミドを使用してドナーからレシピエント大 腸菌...

大腸菌におけるFプラスミド転移と二重抗生物質選択

ここでは接合、形質導入、および黄色ブドウ球菌における自然形質転換のin vitroでの調査のための3つの異なるプロトコルを記述します。...

で水平遺伝子伝達の研究のための方法論<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

さまざまな条件の下で様々 な細菌クェン DNA...

細菌の活用頻度の高解像度の比較

ここでは、i)CyanoGateモジュラークローニングツールキットを用いて自己複製ベクターを組み立てる方法を記述するプロトコルを提示し、ii)結合によりシアノバクテリア宿主にベクターを導入し、iii)を用いてトランスジェニックシアノバクテリア株を特徴付ける。プレートリーダーまたはフローサイトメトリー。...

シアノゲートモジュラークローニングツールキットを用いたコンジュゲーションによるシアノバクテリアの遺伝子改変

Gram陰性細菌における飽和トランスポゾン変異ライブラリーの生成方法と、その後のDNAアンプリコンライブラリーのハイスループットシーケンシングの調製方法について述べる。一例として、ESKAPE病原体...

高スループットシーケンシングのためのグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成

ここでは、特定の糖転移酵素または糖転移酵素を含む領域における アエロモナ...

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

コンジュゲーションは、プラスミドDNAを2つの異なる細胞に動員することにより、遺伝子の水平伝播を媒介し、有益な遺伝子の拡散を促進します。この研究では、接合プラスミド、ドナー、およびレシピエントの鑑別マーカーを使用してトランスコンジュゲーションを検出することに基づいて、接合プラスミド転移を効率的に検出するために広く使用されている方法について説明しています。...

大腸菌における天然接合プラスミドを介した遺伝子水平伝播の検出

この原稿では、細菌の転写を標的とする抗菌剤の転写と阻害活性を機能的に調べるためのプロトコールについて記載します。...

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

ここでは、比較的短い時間枠内で、木の二次幹組織における遺伝子およびプロモーターコンストラクトの中スループットから高スループットの機能特性評価を容易にするプロトコルを提示します。効率的で使いやすく、さまざまな樹種に広く適用できます。...

木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターを研究するための誘導性体細胞セクター分析（ISSA）の使用とセカンダリステム開発

学ぶ細菌接合における転写タンパク質の配列特異的分析法。相同組換えによる遺伝子ノックアウトと交配アッセイを用いて、プラスミド伝達能とタンパク質間相互作用領域を評価する実験手法です。

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

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