細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

この交配アッセイの全体的な目標は、機能的なタイプ4の分泌複合体の状況下でプラスミドトランスファーに影響を与える能力に対する共役型トランスファー遺伝子内の突然変異の影響を評価することです。この方法では、細菌の結合において機能的なタイプ4の分泌系を組み立てる際に、トランスファータンパク質間で発生するタンパク質間相互作用の領域を特定するなど、タンパク質特異的な疑問を投げかけることができます。この手法では、大きなコンジュガティブプラスミド上の遺伝子が相同組換えによってノックアウトされます。

遺伝子機能は、より小さなプラスミドのノックアウトに標的遺伝子を提供することによって評価されます。一般的に、この手順を成功させるには組織とセットアップが重要であるため、この方法に不慣れな個人は苦労します。解釈可能な結果を得るためには、適切な実験準備が必要です。

このプロトコールは、テキストプロトコールに記載されているように、消化されたpBAD33プラスミドの調製から開始します。各消化物をアガロースゲルで分析します。UVキャビネットと滅菌カミソリを使用して、カテーテル配列に対応する2.8キロのベースバンドをゲルから切り取ります。

DNAの紫外線曝露を最小限に抑えるために迅速に作業します。メーカーのプロトコルに従って、ゲル抽出キットを使用して、切り取ったゲルスライスからDNAを抽出します。抽出したキャットカセットをポリメラーゼ連鎖反応またはPCRで増幅します。

滅菌PCRチューブで反応混合物を調製します。相同組換えのためには、標的遺伝子配列と相同なオーバーハングを含むプライマーを使用してください。テンプレートDNAを二重蒸留水に置き換えることを除いて、同じコンポーネントを持つネガティブコントロールを設定します。

また、PCR反応で機能することが証明されているテンプレートDNAとプライマーを使用して、ポジティブコントロールをセットアップします。ピペッティングですべての反応内容物を穏やかに混合します。次に、テキストプロトコルに記載されているPCRパラメータを使用して、抽出した猫カセットを増幅します。

各反応をわずか5マイクロリットル使用して、アガロースゲル電気泳動による増幅の正しいサイズを確認します。PCRアンプリコンを、メーカーのプロトコールに適合するPCR精製キットを用いて精製します。300ナノグラムの増幅された猫用カセットを50マイクロリットルの電気コンピテントDY330R細胞に加え、氷上にpOX38-Tcプラスミドを留置します。

ピペットで優しく上下させて混ぜます。未修飾のpBAD33プラスミドをポジティブコントロールとして使用して、このステップを繰り返します。次に、細胞を予冷した1mmエレクトロポレーションキュベットに移します。

エレクトロポレーターを使用して、1.8キロボルトで5.5ミリ秒の時定数でセルをエレクトロポレーションします。パルスを印加した直後に、細胞を1ミリリットルのSOC培地で希釈し、新しいマイクロチューブに移します。細胞を摂氏32度で2時間インキュベートします。

次に、各サンプルの100マイクロリットルを、1ミリリットルあたり10マイクログラムのテトラサイクリンと1ミリリットルあたり20マイクログラムのクロラムフェニコールを含む寒天プレートにアリコートします。滅菌スプレッダーを使用して、アリコートをプレート上に広げます。プレートを逆さまにして摂氏32度で一晩インキュベートします。

翌日、成功した組換え体を選択します。細胞に導入された猫カセットは、目的の遺伝子と相同組換えを受け、pOX38-Tcクロラムフェニコールノックアウトクローンを作成します。300ナノグラムのpK184遺伝子またはpK184遺伝子変異プラスミドを、前回と同様にpOX38-Tcクロラムフェニコールノックアウトプラスミドを有する50マイクロリットルの電気全能DY330R細胞に分離します。

XK1200ドナー細胞を生成するには、共役交配を行い、続いてエレクトロポレーションを行い、テキストプロトコルに記載されているように、クロラムフェニコールノックアウトとPK184プラスミドの両方をハーポアするXK1200細胞を生成します。これらのXK1200ドナー細胞を、クロラムフェニコールとカナマイシンを含む20ミリリットルの滅菌LBで一晩培養します。また、グリセロールストックまたは寒天プレート上の単一コロニーからの細胞を使用して、50ミリリットルのLBに50マイクログラムのストレプトマイシンを含むMC4100レシピエント細胞を調製します。

200rpmで振とうしながら、摂氏37度で培養物を成長させます。グルコースを最終濃度100ミリモルまで、すべてのドナー細胞に加えます。翌日、各一晩培養物から70分の1の希釈液を、同じ抗生物質を含む2ミリリットルの滅菌LBで別々に作ります。

細胞を摂氏37度で中対数期まで成長させ、200rpmで振とうします。細胞培養物を遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄します。次に、細胞ペレットを冷たい滅菌LBで一度洗浄して抗生物質を取り除きます。

前と同じように2回目の遠心分離を行った後、細胞を2ミリリットルの冷たく滅菌 LB.In に懸濁し、100マイクロリットルのドナー細胞と100マイクロリットルのレシピエント細胞を800マイクロリットルの滅菌LB培地に分注し、総容量1ミリリットルにします。細胞を振らずに摂氏37度で1時間交配させます。1時間後、細胞を30秒間ボルテックスして、交配ペアを乱します。

次に、細胞を氷上に10分間置き、それ以上の交配を防ぎます。ミッドログ培養物と新鮮な滅菌LBを使用して、ドナー細胞とレシピエント細胞の1および100万から1および1000万までの6つの段階希釈液を調製します。ナラジキシン酸、クロラムフェニコール、カナマイシンを含む寒天プレートの2つの半分のそれぞれに、XK1200ドナー細胞の各希釈液の10マイクロリットルのアリコートを見つけます。

ストレプトマイシンを含む寒天プレート上のレシピエントMC4100細胞の希釈についてスポッティングを繰り返します。次に、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。次に、ボルテックス混合物と新鮮な滅菌LBを使用して、トランスコンジュガントの6希釈液を調製します。

pOX38-TCクロラムフェニコールノックアウトブを保有するトランスコンジュガントMC4100細胞に選択し、ストレプトマイシンとクロラムフェニコールを含む寒天プレートの各半分に各希釈の10マイクロリットルアリコートをスポッティングします。両方の重複する混合物について繰り返します。次に、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。

それぞれのプレート上の各ドナー、レシピエント、およびトランスコンジュガント細胞について、同じ希釈スポッティングからのコロニー数をカウントすることにより、嵌合効率を計算します。また、レシピエントコロニーをカウントして、その希釈率でレシピエントよりも多くのトランスコンジュガントに起因するバイアスをテストします。交配効率は、トランスコンジュガントコロニーの数をドナーコロニーの数で割った値に100を掛けて、ドナー細胞100個あたりの効率値を求めます。

4型分泌系gene-tra-FがpOX38-Tcプラスミドからノックアウトされると、pOX38-TcトラFクロラムフェニコールノックアウトプラスミドのドナー細胞からレシピエント細胞への結合転写が失われます。しかし、PK184 traFプラスミドとドナー細胞によりtraF遺伝子をtransで提供すると、pOX38-TcのtraFクロラムフェニコールノックアウトプラスミドの結合転写の回復が観察される。traFとPK184プラスミドの希釈変異体をドナー細胞に与えると、pOX38-TcのtraFクロラムフェニコールノックアウトプラスミドの結合転写の損失が観察されます。

抱合体転移の喪失は、共役型4分泌系内のタンパク質間相互作用に重要なタンパク質の領域を示しています。この領域は、転写の効率に影響を与える点突然変異によって、より詳細に調べることができます。一度習得すると、このテクニックは予想される成長時間で1営業日で実行できます。

このプロトコルは、ここで示すもの以外の細胞で行うことができます。この時点で重要な点は、ドナー細胞とレシピエント細胞が目的のプラスミドを保有していないことです。そのため、ノックアウトプラスミドを追加しても、相反する結果が得られません。

この手順を試みる際には、ドナー細胞、レシピエント細胞、およびトランスコンジュゲート細胞に異なる増殖条件と抗生物質があるため、非常に整理整頓することが重要です。この手順に続いて、結晶学、NMR、質量分析などの他の方法を実行して、目的のタンパク質の詳細な構造的および機能的画像を取得できます。