Name: で水平遺伝子伝達の研究のための方法論黄色ブドウ球菌 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶStaphylococcus aureusにおける水平遺伝子伝達の方法論。接合、形質転換、自然形質導入の3つの経路を用いて、抗生物質耐性遺伝子の伝播メカニズムを解明します。

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この研究は、武田科学振興財団、ファイザー学術貢献、日本学術振興会外国人研究者特別研究員(FC)の支援を受けました。

注：この作業で使用した株および材料は、それぞれ、 表1および材料の表に記載されています。伝送実験では、N315および陽性デリバティブCFR COLはCFR遺伝子（N315-45とCOL-45）のドナーとして使用しました。これらの株は、以前に（下記参照）を、標準的なコンジュゲーションプロトコルに従って、ドナーとして臨床CFR陽性ブドウ表皮株 （ST2）を用いて、結合することによって得ました。この株はpSCFS7のようなプラスミド7にCFR遺伝子を抱いて。 1.共役フィルター交配法を用いました注：CFR遺伝子（N315-45）7（CM R）を有する黄色ブドウ球菌 N315株をドナーとして使用しました。 COL 8またはMU50 9株（テトR、CmをS）をレシピエントとして使用しました。ダブル-クロラムフェニコールの32 mg / Lで加えたテトラサイクリン8ミリグラム/ Lの存在下で増殖することができる耐性コロニー（テトR、のCm R）の推定上のトランス接合体とみなされ、コロニーPCRによってCFRの存在を決定し、決定するために分析しました。受信者の感受性プロファイル。 <ol><li> いくつかの変更を使用して、以前に記載されたプロトコル10以下の結合を実行します。 <ol><li> 37℃で振盪しながら、トリプシン大豆培養液（それぞれ32 mg / Lのクロラムフェニコールと無い場合、）（TSB）培地中のドナーとレシピエントの一晩培養物を5mLを準備します。 </li><li>新鮮なTSB培地を用いて、1（OD 600 = 1.0）に一晩培養の光学密度（OD 600）を調整します。受信者の文化（COLまたはMU50）の0.5 mLでドナー文化（N315-45）の0.5ミリリットルを混ぜます。混合物に1mlのPBSを追加します。 </li><li> 0.45μmのフィルター膜USIに細菌の混合物を転送します真空ポンプシステムをngの。 </li><li>ヒツジ血液寒天プレート上でフィルター膜を置きます。 1日間37℃でインキュベートします。 注：このステップでは、濃縮された培地は、二重耐性細胞の増殖を可能にするために必要です。 </li><li>プレートからフィルター膜を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlに懸濁します。渦はよくメンブレン上に接続されているすべての細菌を収集します。 </li><li>新鮮なTSBを使用して、細菌懸濁液の連続10倍希釈液を作ります。プレート32 mg / Lのクロラムフェニコールおよびトランス接合の選択のための8 mg / Lのテトラサイクリンを補充したTSB寒天（TSA）プレート上で0-10 -4希釈した試料100μlの。受信者の合計数をカウントするだけでは8 mg / LのテトラサイクリンとTSAプレート上にプレート希釈懸濁液（10 -5〜10 -6）の100μLを。 18-24時間、37℃で培養します。 </li><li> CFの存在のための二重耐性コロニー（推定上のトランス）を分析コロニーPCR 7およびそれらの感受性プロファイル（アンチバイオグラム）によるr遺伝子。 </li><li>標準微量希釈法またはディスク拡散法11に従って、適切な抗生物質の最小発育阻止濃度（MIC）を測定することにより、アンチバイオグラムを決定します。トランス接合体の感受性プロファイルは、クロラムフェニコール（およびCFR遺伝子によって影響を受ける他の化合物）を除いて、受信者に同一である必要があります。この決意は、ドナー株によって開発されたテトラサイクリン耐性を排除することが不可欠です。 </li></ol></li></ol> 2.ファージ形質導入注： サイフォウィルス科に属するバクテリオMR83a（実験室株）を形質導入実験に用いました。 N315-45は、ファージ感染CFRドナーとして使用しました。 N315、COL、またはMU50株レシピエントとして使用しました。 CFRの買収は、ABにより決定しました32 mg / Lのクロラムフェニコールの存在下で増殖するレシピエント株のility。この条件の下で成長するコロニーは（コロニーPCRによって）CFRの存在を決定し、潜在的な汚染を排除するために感受性プロフィールを決定するために分析しました。 <ol><li> ドナー上のファージ増幅 <ol><li> （180 rpm）し振とうしながら37℃で3.6 mMののCa 2+（NBCaCl 2）を補充した栄養ブロス5mlにN315-45の一晩培養物を準備します。 注：カルシウムはファージ感染のために必要とされます。 材料表を参照してください。他社からの栄養ブロスは、カルシウム沈殿などの問題を、持っているかもしれません。 </li><li> 50ミリリットルのガラスフラスコまたはガラスバイアル中NBCaCl 2の10 mLの最終体積で千：一晩培養物1を希釈することにより継代培養を準備します。 （180 rpm）し振とうしながら37℃で1時間、細菌を成長させます。 </li><li> NBCaCl 2メディで希釈したファージMR83aのシリーズを用意ええと（10 -2、10 -3、10 -4、10 -5、10 -6）。細菌培養物に希釈したファージの20μlのを追加します。また、細菌細胞の成長のための陽性対照として、翌日のファージ力価を決定するために使用できるファージ感染、ない対照培養物を調製します。 </li><li>一晩穏やかに振盪（100 rpm）しながら37℃で培養を成長させます。 注：感染ファージが過剰でない場合に、細胞がある程度成長します。その後、彼らは溶菌サイクルを通じてによるファージ増幅に溶解段階に入ります。ファージと文化は透明性の明確な速度が表示されますしながら、ファージのない文化は、完全な成長が表示されます。 </li><li>追加されたファージの最高希釈で1または2透明な培養バイアルを選択します。 </li><li> 15ml遠心チューブに培養液を移します。クロロホルム250μlを添加し、チューブを反転させることにより十分に混合します。 </li><li> 5000でチューブを遠心<em&gt; 4℃で20分間XG。 </li><li>新鮮なチューブに上清を移し、使用するまで4℃で保管してください。 注：ファージは、少なくとも数ヶ月間安定であるが、長すぎるためのファージ調製物を貯蔵することは力価及び形質導入効率を低下させます。 </li></ol></li><li> ファージ力価（ファージプラークアッセイ）を測定 <ol><li>栄養ブロス寒天（1.5％寒天）培地を準備。 55℃の水浴中で暖かいを保ちます。 3.6 mMの最終濃度を培地にオートクレーブし、0.5MのCaCl 2溶液を加えます。 90ミリメートルペトリ皿（NBCaCl 2板）にそれを注ぎます。 </li><li>振盪しながら37℃でNBCaCl 2 5ml中のN315の一晩培養物を準備します。これは、上述した対照培養（ステップ2.1.3）で置換することができます。 </li><li> NBCaCl 2の200μlの中に一晩培養物の10μlを添加して、均一にNBCaCl 2プレートの上に広げました。時の表面拡散を停止プレートは、液体で覆われています。プレートが乾燥してみましょう。 </li><li>シリアル1:10希釈を行います（10 -5 -10から-10）NBCaCl 2培地を使用して、先に調製したファージ（ステップ2.1.8）の。 </li><li>スポット細菌で覆われたプレート上に各ファージ希釈液を3μl。 </li><li> 30℃で一晩プレートをインキュベートします。 </li><li>プラーク数をカウントし、以下の式を用いてファージ力価を計算します。プラーク形成単位（PFU）/ミリリットル=プラークの数のx希釈倍率/スポッティングボリューム（3×10 -3ミリリットル） </li></ol></li><li> ファージ形質導入 注：前のステップ（2.1.8）で調製したファージプールは、 黄色ブドウ球菌株にCFR遺伝子の導入をテストするために使用されます。この実験では、N315、COL、またはMU50をレシピエントとして使用されている株。 <ol><li> （180 rpm）し振とうしながら37℃でNBCaCl 2の5ミリリットルでN315、COL、またはMU50の一晩培養物を準備します。 </li><li>トンを希釈彼は10 9 PFU / mLの〜にNBCaCl 2中のファージ。 </li><li> 50ミリリットルのガラスバイアルでは、一晩培養物500μlを、新鮮なNBCaCl 2500μlの、およびファージの1ミリリットル（〜10 9 PFU / mlで）混ぜます。感染の期待多重度（MOI）を、穏やかに30分間（100 rpm）し振とうしながら37℃で1インキュベート混合物を超えてはなりません。 注記：直前ファージの添加（内因性制限酵素を不活性化するために2分間52°C）にレシピエント細胞の熱処理が効率12を増大させることができます。 </li><li> 20％のNa 3 -クエン酸塩の50μLを加えます。 37℃で30分間穏やかに振盪続けます。 注：のNa 3 -クエン酸塩はカルシウムの適度なキレート剤として作用します。 </li><li>溶融したブレインハートインフュージョン（BHI）寒天（1.5％寒天）培地を調製し、55℃の水浴に保管してください。 </li><li> 32 mg / Lのchlorampを補っ暖かいBHI寒天の50ミリリットルを追加し、100ミリリットルのフラスコに細菌ファージ混合物を移しhenicol、よく混ぜます。 90ミリメートルペトリ皿に混合物を注ぎます。 注：この方法は、増殖するコロニー（推定形質導入）の少数の検出を可能にします。 </li><li> 24〜48時間、37℃でプレートをインキュベートします。 </li><li>また、32 mg / Lのクロラムフェニコールを補充した新しいBHI寒天プレート上にコロニーを転送することにより、抵抗のために生成されたコロニー（形質導入）をテストします。コロニーPCR 7によるCFR遺伝子の存在を確認してください。 </li></ol></li></ol> 3.自然変換注： 黄色ブドウ球菌の自然形質転換アッセイは我々の以前の研究2に記載の方法に従って行いました。 N315誘導体、N2-2.1 2,7は 、レシピエントとして使用しました。この株では、 ため息座は構成的に発現ため息2になるように複製されました。 DETのためため息を発現する能力変異体を単離する方法についてailed手順は、前の説明2を参照してください。転送する耐性マーカーは、クロラムフェニコールでない場合、以前に2記載されているように、PRIT-ため息（CM R）は 、ため息を発現させることができます。精製されたプラスミドまたはCFRからの全DNAの抽出は、 黄色ブドウ球菌 COL-45 7形質転換のためのドナーDNAとして使用さ-acquired。 <ol><li> ドナーDNAの調製 <ol><li> TSBの50 mLを含む300ミリリットルのフラスコ中で37℃で振盪しながら一晩COL-45を養う32 mg / Lのクロラムフェニコールを補充しました。文化大腸菌 HST04運ぶpHY300 プラスミド（テト R）は、対照実験のためにプラスミドを抽出します。 注：HST04（ ダム- / DCM - ）は、DNAが遺伝子13をメチ欠いています。 DNAメチラーゼと他の従来の株も使用することができますDNAのメチル化状態は、変換効率に影響を与えないので、dは、DNA供与体を調製しました。代替的に、 黄色ブドウ球菌 COL株から精製pT181のプラスミドはまた、形質転換アッセイ2の陽性対照として使用することができます。 </li><li>遠心分離（4℃で10分間、8000×gで ）によって細胞を収集します。 </li><li>全DNAを精製し、プラスミドDNA抽出キットまたは従来のDNA精製法を用いてプラスミドを抽出します。 </li><li>分析計によって精製されたDNAを定量化し、使用するまで4℃で保管してください。 注：形質転換試験、古い通常一週間以内の新鮮なDNA調製物を使用してください。古いDNA調製物は、形質転換の効率を低下させます。 </li></ol></li><li> 形質転換試験 <ol><li>文化振とうしながら37℃で一晩TSB 5ml中の受容細胞（N2-2.1）。 </li><li> 1.5ミリリットルチューブに一晩培養の0.5ミリリットルを転送します。 Precipi遠心分離（4℃、1分間10,000×gで ）によって細胞をテート。 </li><li> 50mlのチューブ内CS2培地10mLで細胞を一時停止します。 注：CS2媒体（材料表に培地組成を参照）、黄色ブドウ球菌 2の自然形質転換のための能力を誘発する完全合成培地です。例えばTSBまたはBHIなどの他の標準的な実験用培地は、形質転換2、13には適していません。 </li><li>後期指数期（約8時間）まで（180 rpm）し振とうしながら37℃で細菌を成長させます。 </li><li>遠心分離（4℃で5分間、5,000×gで ）により細胞を収穫。 </li><li>新鮮CS2培地10mlに細胞を再懸濁。 </li><li>細胞懸濁液に精製されたプラスミドまたはゲノムDNA（ステップ3.1.4）の10μgのを追加します。 37°Cと2.5時間、180rpmで振盪します。 注：DNAと短いインキュベーション時間（&lt;2.5時間）下TRANSFになりますormation周波数。 </li><li>遠心分離（5000×gで 5分間4℃で）によって細胞を収集します。 </li><li> BHI培地10ml中で細胞を再懸濁します。 32 mg / Lのクロラムフェニコール（または対照実験では5 mg / Lのテトラサイクリン）との溶融BHI寒天（55°C）サプリメントの90ミリリットルで細胞懸濁液を混ぜます。 90ミリメートルペトリ皿に混合物を注ぎます。迅速クールと寒天を固化させます。 </li><li> 2日間37℃で培養します。 </li><li>その抵抗特性を確認するために、適切な抗生物質を含む新しいBHI寒天プレートに（楊枝を使って）コロニーを転送することによって生成されたコロニー（形質転換体）を複製します。コロニーPCR 7によって取得された耐性遺伝子（CFRまたはtetM）を確認してください。 </li></ol></li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

<html>この作品は、黄色ブドウ球菌における遺伝的決定のHGTを研究するために、3つの主要な方法について説明します。形質導入および結合は数十年にわたって研究されてきたが、自然形質転換の存在はごく最近の2を認識しました。このように、 黄色ブドウ球菌は、HGTの3メジャーモードのすべてが装備され、それらのすべてのテストは遺伝的決定の可能普及経路を明確にするために必要とされます。この作業の目的は、完全なプロトコルをコンパイルすると、以前に発表された研究7で使用される方法論に関する実用的な情報を提供することです。結合および形質導入プロトコルが利用可能であるが、これは、詳細な形質転換プロトコルが記述された最初の論文です。 フィルタ交配法を用いてコンジュゲーションは、簡単な技術であり、異なる細菌種に接合伝達の研究に適用することができます= &quot;外部参照&quot;&gt; <su...

黄色ブドウ球菌は自然に人間や動物の皮膚や鼻腔に生息する共生グラム陽性細菌です。この細菌種は、病院や医療現場における院内感染の主な原因です。また、別の抗菌化合物に対する耐性を開発する能力は、世界的な懸念にこの細菌によって引き起こされる感染症の管理を行っています。 耐性表現型の拡散に関与する2つの主要な経路が知られている：耐性遺伝子型のクローン普及および細菌プール間の遺伝的決定の普及を。 黄色ブドウ球菌 、異なる抗生物質耐性遺伝子（ならびに病原性決定因子）の場合には、モバイル遺伝要素（MGES 1）に関連することが見出されています。 黄色ブドウ球菌のゲノムにおけるこれらの要素の存在は、世代の取得及び譲渡ことを示しています細菌集団内エティックな材料は、 黄色ブドウ球菌の適応と進化のための重要な役割を果たし得ます。 形質転換、抱合、およびファージ形質導入：遺伝物質は、グラム陽性細菌にHGTの三周知の機構を介して交換することができます。形質転換は、遊離DNAの取り込みを伴います。能力段階：外来DNAを取得するには、細菌細胞は、特別な生理的相を開発する必要があります。この段階に到達すると、コンピテント細胞は、細胞質中にDNAを輸送する新しい遺伝的決定を取得することが可能です。 黄色ブドウ球菌の場合には、天然の形質転換の存在は、最近2を実証されています。これに伴い、当社グループは、その構成的発現がreachin可能な黄色ブドウ球菌をレンダリングする方法を開発の能力段階で、オンため息因子の発現の関連性（不可解な二次転写シグマ因子）に光を当てるしています自然変換2により耐性表現型の獲得を可能にするグラム能力段階、。 結合は、別の（受信者）に1生細胞（ドナー）からのDNAの送信を伴うプロセスです。どちらの細胞は、DNAが、そのようなチューブや毛穴などの特殊な構造によって保護された状態で交換することができるように、直接接触していなければなりません。この方法によるDNAの導入は、接合機械を必要とします。 黄色ブドウ球菌では、プロトタイプ接合プラスミドは、接合オペロンTRAA 3を保有PGO1、です。 ファージ形質導入は、バクテリオファージ感染を介して細胞への細胞からのDNAの移動を伴う、代わりにウイルスDNAのファージキャプシドに、細菌DNAのパッキングを意味します。 黄色ブドウ球菌分離株のほとんどは、バクテリオファージ1によって溶原化されています。ストレス条件に、プロファージは、細菌GENOMから切り出すことができますeおよび溶菌サイクルへの移行。 これらは、 黄色ブドウ球菌におけるDNAの伝送のための3つのよく知られた機構です。病原性島4の転送中にいくつかのような「擬似変換」などの追加の転送メカニズム、2およびファージのようなシステムがあります。最近、一つのグループは、「ナノチューブ」は、隣接するセル5,6の間（プラスミドDNAなど）は、細胞材料の転写に関与しているが、フォローアップ研究は、これまで、他のグループから出現していないことを報告しました。 接合、形質導入、および自然変換：この作品は、3つの主要な移動経路をアドレス指定することにより、黄色ブドウ球菌にHGTを勉強するために必要な方法論を提供します。これらの方法論を用いて得られた結果は、間のCFR遺伝子（クロラムフェニコール/フロルフェニコール耐性）の送信を研究するために使用されました黄色ブドウ球菌は7菌株 。これらの3つの技術は、黄色ブドウ球菌におけるMGE伝送の調査のための多目的なツールです。

<table><tbody><tr><td>トリプシン大豆ブロス(TSB)&nbsp;</td><td>ベクトン・ディキンソン&nbsp;</td><td></td><td></td>211825</tr><tr><td>Brain Heart Infusion(BHI)</td><td>ベクトン・ディキンソン&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>211059 栄養液 2号</td><td>オキソイド</td><td>CM0067</td><td></td></tr><tr><td>羊血寒天培</td>地 <td>栄研化学工業(株)</td><td>E-MR96</td><td>トリプシン性大豆寒天培地に5%(v / v)羊の血液を添加したものメーカーによる&nbsp;</td></tr><tr><td>寒天粉末</td><td>和光純薬工業</td><td>010-08725</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム(クエン酸三ナトリウム二水和物)</td><td>和光純薬工業</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>セルロース エステル グリッド 0.45 &mu;L HAWG</td><td>フィルターMerck Milipore</td><td>HAWG 02500</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilterプラスミドMIDIキット</td><td>QIAGEN</td><td>12243</td><td></td></tr></tbody></table>

で水平遺伝子伝達の研究のための方法論<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

主要な日和見ヒト病原体黄色ブドウ球菌の1つの重要な特徴は、急速に抗生物質に対する耐性を獲得するその並外れた能力です。ゲノム研究は、 黄色ブドウ球菌は、水平遺伝子伝達（HGT）は、黄色ブドウ球菌の進化に重要な役割を果たしていることを示唆し、モバイル遺伝的要素に位置し、多くの病原性と抵抗性遺伝子を有することを明らかにしました。しかし、 黄色ブドウ球菌にHGTを研究するために使用される方法の完全かつ詳細な説明はまだ、不足している、特に自然変換について、最近、この細菌で報告されています。抱合、ファージ形質導入、および自然変換：この作品は、 黄色ブドウ球菌におけるHGTのin vitroでの研究のために有用である3つのプロトコルについて説明します。この目的にフェニコールを与える、CFR遺伝子（クロラムフェニコール/フロルフェニコール耐性）、リンコサミド、オキサゾリジノン、プレウロムチリン、およびストレプトA（PhLOPSA）表現型ース間オン抵抗使用しました。 黄色ブドウ球菌は、他の株に遺伝物質を転送するを通じてメカニズムを理解することは、耐性の急速な買収を理解するために不可欠であるとサーベイランスプログラムで報告普及のモードを明確にすることや、今後さらに拡散モードを予測するのに役立ちます。

ここで示される結果は、以前に公開されている（出版社の許可を得て参照7から適応）。私たちは、HGTの三つのメカニズムを調査することにより、 黄色ブドウ球菌株で15、低レベルのリネゾリド耐性とPhLOPSA耐性表現型14の発現を引き起こすCFR遺伝子の潜在的な伝送経路を検討しました。 図1は、接合アッセイにおいて得られた結果を示します。コンジュゲーションプロトコルは、異なる接合ドナー同じ接合ベクターを使用して同様の結果を与え、種間の伝送（A）と同様に、イントラ種伝送（B）に有用です。コンジュゲーションの効率は、レシピエント細胞のトランス接合のNº（コロニー形成単位、またはCFU / ml）の/Nº（CFU / ml）のよう...

ここでは接合、形質導入、および黄色ブドウ球菌における自然形質転換のin vitroでの調査のための3つの異なるプロトコルを記述します。

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

この手順の全体的な目標は、3つの主要な伝達経路に対処することにより、黄色ブドウ球菌のDNAの水平伝播を研究するための詳細な方法論を提供することです。コンジュゲーション、形質導入、および自然な形質転換。この方法は、ヒト病原体黄色ブドウ球菌における抗生物質耐性遺伝子の水平移動に関するものです。ここで紹介する技術の主な利点は、最近発見された自然な遺伝的形質転換を含む、3つの主要な移行モードをテストできることです。実験を開始するには、トリプシン大豆ブロスにドナーとレシピエントの細菌を5ミリリットルの一晩培養します。または、クロラムフェニコール1リットルあたり32ミリグラムの有無にかかわらず、TSB培地。摂氏37度で振る。翌日、一晩培養した光学濃度を新鮮なTSB培地で光学濃度に調整します。0.5ミリリットルのドナー培養物と0.5ミリリットルのレシピエント培養物を混合します。そして、1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水、またはPBSを混合物に加えます。次に、真空ポンプシステムを使用して、細菌の混合物を0.45マイクロメートルのフィルター膜に移します。フィルターメンブレンを羊の血液寒天プレートに置きます。プレートを摂氏37度で1日インキュベートします。プレートからフィルター膜を取り出し、10ミリリットルのPBSに懸濁します。混合物を約1分間ボルテックスして、メンブレンに付着したすべてのバクテリアを収集します。細菌懸濁液を新鮮なTSBで連続10倍希釈します。TSB寒天上に0、10、4希釈サンプルの100マイクロリットルをプレートします。または、トランスコンジュガントを選択するために、クロラムフェニコール1リットルあたり32ミリグラムとテトラサイクリン1リットルあたり8ミリグラムを補充したTSAプレート。希釈した懸濁液100マイクロリットルをTSAプレートにプレート化し、テトラサイクリンのみで1リットルあたり8ミリグラムでプレート化します。受信者の総数をカウントします。インキュベーション後、コロニーPCRによるCFR遺伝子の存在とその感受性プロファイルについて、二重耐性コロニーを分析します。標準的な微量希釈法または椎間板拡散法に従って、適切な抗生物質の最小阻害濃度(MIC)を測定することにより、アンチバイオグラムを決定します。トランスコンジュガントの感受性プロファイルは、レシピエントと同一でなければなりません。ただし、クロラムフェニコールやCFR遺伝子の影響を受ける他の化合物は除きます。ドナー株によって発症したテトラサイクリン耐性を除外すること。3.6ミリモルのカルシウムを補給した5ミリリットルの栄養ブロスでN315-45の一晩培養を準備します。一晩の培養物を50ミリリットルのガラスバイアルで10ミリリットルの最終容量で1,000に希釈することにより、継代培養を準備します。摂氏37度で1時間、1分間に180回転を振ってバクテリアを増殖させます。次に、NB塩化カルシウム培地で希釈したファージMR83aのシリーズを調製します。希釈したファージを20マイクロリットルを細菌培養物に加えます。ファージ感染のないコントロール培養物を調製し、細菌細胞増殖のポジティブコントロールとして機能します。次に、毎分100回転で一晩中穏やかに振とうしながら、摂氏37度で培養物を成長させます。翌日、添加したファージの希釈度が最も高い透明化した培養バイアルを1つまたは2つ選択します。培養物を15ミリリットルの遠心分離管に移します。チューブに250マイクロリットルのクロロホルムを加え、それらを反転させて培養物を完全に混合します。培養物をGの5, 000倍で4°Cで20分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移し、使用するまで摂氏4度で保管します。.栄養スープ寒天培地を準備し、摂氏55度の水浴で保温します。オートクレーブ処理した0.5モルの塩化カルシウム溶液を培地に加え、最終濃度3.6ミリモルにします。90ミリメートルのシャーレNB塩化カルシウムプレートに注ぎます。5ミリリットルのNB塩化カルシウムにN315を37°Cで振とうしながら一晩培養します。翌日、10マイクロリットルのオーバーナイト培養物を200マイクロリットルのNB塩化カルシウムに加え、NB塩化カルシウムプレートに均等に広げます。プレートの表面が液体で覆われている場合は、広がりを止めます。その後、プレートを5分間乾かします。NB塩化カルシウム培地を使用して、以前に調製したファージの1〜10希釈を連続して行います。各ファージ希釈液の3マイクロリットルを、バクテリアで覆われたプレートにスポットします。プレートを摂氏30度で一晩インキュベートします。翌朝、プラーク番号を数え、次の式を使用してファージ力価を計算します。N315、COL、またはMU50を、摂氏37度の5ミリリットルのNB塩化カルシウムに一晩培養し、毎分180回転で振とうします。一晩培養した後、NB塩化カルシウムでファージを109 PFU/mLに希釈します。50ミリリットルのガラスバイアルに、500マイクロリットルの一晩培養、500マイクロリットルの新鮮なNB塩化カルシウム、および1ミリリットルのファージ109PFU/1ミリリットルを混合します。混合物を摂氏37度でインキュベートし、毎分100回転で30分間穏やかに振とうします。インキュベーション後、50マイクロリットルの20%クエン酸三ナトリウムを培養物に加えます。37°Cで30分間、穏やかに振とう続けます。溶かした脳内心臓注入液またはBHI寒天培地を調製し、摂氏55度の水浴に保持し、寒天培地をクロラムフェニコール1リットルあたり32ミリグラムで処理します。次に、細菌ファージ混合物を100ミリリットルのフラスコに移します。50ミリリットルの温かいBHI寒天に32ミリグラム/リットルのクロラムフェニコールを加え、よく混ぜます。混合物を90ミリメートルのシャーレに注ぎます。プレートを摂氏37度でインキュベートします。生成されたコロニーである形質導入剤の耐性をさらに試験するには、コロニーを1リットルあたり32ミリグラムのクロラムフェニコールを補充した新しいBHI寒天プレートに移します。コロニーPCRによりCFR遺伝子の存在を確認します。レシピエント細胞を、5ミリリットルのTSB中で摂氏37度で振とうしながら一晩培養します。翌朝、0.5ミリリットルの一晩培養物を1.5ミリリットルのチューブに移します。遠心分離により細胞を沈殿させます。次に、50ミリリットルのチューブに10ミリリットルのCS2培地で細胞を懸濁します。次に、摂氏37度でバクテリアを増殖させ、毎分180回転で振とうし、指数関数後期まで8時間持続します。遠心分離により細胞を回収します。上清を捨て、細胞を10ミリリットルの新鮮なCS2培地に再懸濁します。10 μgの精製プラスミドまたはゲノムDNAを細胞懸濁液に加えます。毎分180回転で培養物を振る。次に、遠心分離によって細胞を回収します。細胞を10ミリリットルのBHI培地に再懸濁します。細胞懸濁液を90ミリリットルの溶融BHI寒天サプリメントと混合します クロラムフェニコール1リットルあたり32ミリグラム、および対照実験ではテトラサイクリン1リットルあたり5マイクログラム。90mmのシャーレに注ぎ、素早く冷まして寒天を固めます。適切な抗生物質を含むプレートにつまようじを使用してコロニーを複製し、その耐性特性を確認します。この結合プロトコルは、表皮ブドウ球菌がCFRドナーとして使用された種内伝播に有用です。そして、黄色ブドウ球菌N315株をレシピエントとして使用した。種間伝達に使用されるプロトコルは、異なる共役ドナーで同じ共役ベクトルを使用して同様の結果をもたらします。これは、自然変換の詳細が記述された最初の論文です。提供された方法論は、研究者が抗生物質耐性の伝播と拡散、およびヒト病原体黄色ブドウ球菌の主要な決定要因を研究するのに役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Cafini、F.、 et.al。 黄色ブドウ球菌における水平遺伝子導入の研究のための方法論 J. Vis. 経験。 (2017年)このビデオは、自然な形質転換による黄色 ブドウ球菌...

黄色ブドウ球菌におけるコンピテンス誘導DNA取り込み

ここでは、プラスミド結合に関与する目的の遺伝子をノックアウトするプロトコルを提示し、その後、交配アッセイを使用してその不在の影響を分析します。遺伝子の機能は、欠失または点突然変異を使用して、その配列の特定の領域にさらに調査されます。...

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

さまざまな条件の下で様々 な細菌クェン DNA...

細菌の活用頻度の高解像度の比較

ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。...

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

この分析計算プラットフォームは、細菌集団ゲノミクスに関心のある微生物学者、生態学者、疫学者に実用的なガイダンスを提供します。具体的には、ここで提示された研究は、i)階層遺伝子型の系統発生誘導マッピングを実行する方法を示した。ii)遺伝子型の周波数ベースの分析;iii)親族関係とクローン性分析iv)系統鑑別補助遺伝子座の同定。...

細菌集団における階層遺伝子型とアクセサリゲノム遺伝子座のヒューリスティックマイニング

コンジュゲーションは、プラスミドDNAを2つの異なる細胞に動員することにより、遺伝子の水平伝播を媒介し、有益な遺伝子の拡散を促進します。この研究では、接合プラスミド、ドナー、およびレシピエントの鑑別マーカーを使用してトランスコンジュゲーションを検出することに基づいて、接合プラスミド転移を効率的に検出するために広く使用されている方法について説明しています。...

大腸菌における天然接合プラスミドを介した遺伝子水平伝播の検出

この原稿では、 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌の抗生物質の生存を評価するための包括的なプロトコルを提供し、プラスミドを 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌...

緑 膿菌 および 黄色ブドウ球 菌の不均一な表現型のタイムラプス落射蛍光顕微鏡イメージング

ドリップ流反応器と回転するディスクの原子炉とオープンシステムの流れのバイオフィルムを利用するためのプロトコルを詳細に表示されます。...

用ドリップ流れと回転円板の原子炉の使用黄色ブドウ球菌バイオフィルム分析

マウスの皮膚および軟部組織感染症のモデルは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）およびホストの免疫応答の病原性の機能を評価するために利用されている。ここで、我々は、皮膚および軟部組織感染症のための皮下感染モデルを発表した。...

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の皮下感染

メチシリン耐性による実験的ラットの心内膜炎モデル...

メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;（MRSA）ラットにおける

学ぶStaphylococcus aureusにおける水平遺伝子伝達の方法論。接合、形質転換、自然形質導入の3つの経路を用いて、抗生物質耐性遺伝子の伝播メカニズムを解明します。

で水平遺伝子伝達の研究のための方法論

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