透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

この手順の全体的な目標は、高解像度の呼吸測定を使用してミトコンドリアの酸素消費量を測定することです。この方法は、次のようなミトコンドリア機能障害に関連する症候群や疾患の主要な質問に答えるのに役立ちます。敗血症、多様な神経疾患、加齢性疾患。この技術の主な利点は、感度が高く、無傷または透過処理された細胞などの少数の生体サンプルを用いた結合阻害剤滴定実験で基質を実行できることです。

この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるSandra Nansozです。手順を開始する前に、ポーラログラフ式酸素センサーを空気校正し、呼吸緩衝液中の細胞を1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞濃度に再懸濁し、オキシグラフの1つのチャンバー内の呼吸媒体を2.1ミリリットルの細胞懸濁液に交換します。ストッパーでチャンバーを閉じ、チャンバー内の磁気攪拌バーを毎分700回転に設定します。

次に、安定した酸素フラックス信号が得られるまで、細胞呼吸を5〜10分間記録します。次に、注射器を使用して、チタン注入ポートからオキシグラフチャンバーに2マイクロリットルのロテノンを注入し、さらに5〜10分間細胞呼吸を記録します。安定した酸素フラックス信号が得られたら、20マイクロリットルの1モルコハク酸を注入し、続いて10マイクロリットルの0.5モルADPを注入します。

次に、2ミリモルジギトニンの2マイクロリットルの2つの容量を注入し、各注入後2〜5分間の細胞呼吸を記録し、続いて酸素フラックス信号が最大レベルに達するまで2〜4マイクロリットルの2ミリモルジギトニンを段階的に注入し、さらにジギトニンを注入しても呼吸数が増加しません。ミトコンドリア外膜の完全性を評価するには、今示したようにオキシグラフチャンバーを準備し、細胞を透過化するために8ミリモルのジギトニンを2マイクロリットル注入します。5分後、20マイクロリットルの1モルコハク酸を注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間細胞呼吸を記録します。

次に、10マイクロリットルの0.5モルADPを注入して、複雑な2を刺激し、酸素消費量の増加を誘発します。安定したフラックスシグナルが得られたら、5マイクロリットルの4ミリモルシトクロムcを注入し、続いてリガマイシン1ミリリットルあたり4ミリグラムの1マイクロリットルを注入します。肝臓肝細胞癌細胞のADP刺激呼吸を測定するには、今示したようにオイグラフチャンバーを準備し、酸素チャンバーに2マイクロリットルの8ミリモルジギトニンを注入して細胞を透過処理し、続いて12.5マイクロリットルの0.8モルマラードと10マイクロリットルの2モルグルタミン酸を注入します。

安定した酸素フラックスが達成されたら、10マイクロリットルの0.5モルADPを注入して酸素消費量を増やし、続いて2マイクロリットルの0.2ミリモルロテノンと20マイクロリットルの1モルコハク酸を注入します。次に、5ミリモルのアンチマイシンを2マイクロリットル注入し、細胞呼吸を記録します。信号が減少して安定したら、2.5マイクロリットルの0.8ミリモルエスコルベートを注入し、続いてすぐに2.5マイクロリットルの0.2ミリモルTMPDを注入し、酸素フラックス信号が増加して安定するまで細胞呼吸を記録します。

次に、1モルのアザイトナトリウムを10マイクロリットルをオキシグラフチャンバーに注入し、酸素フラックス信号が減少して安定するまで細胞吸引を記録します。無傷の細胞の酸素消費量を測定するには、先ほど示したようにオキシグラフチャンバーを準備し、1ミリリットルあたり4ミリグラムの1マイクロリットルを注入し、続いて0.2ミリモルのFCCPを1マイクロリットルまたは3マイクロリットル注入します。次に、酸素フラックス信号が最大レベルに達するまで0.2〜1ミリモルのFCCPを1〜3マイクロリットル注入することにより、FCCPを0.1〜0.3マイクロモルステップで滴定します。

次に、0.2ミリモルのロテノンを2マイクロリットルと5ミリモルのアンチマイシンAを2マイクロリットル注入し、酸素フラックス信号が減少して安定するまで呼吸を記録します。ジギトニンが存在しないと、細胞呼吸は非常に低く、ミトコンドリア基質とADPの存在下では、無傷の非透過性細胞の呼吸は刺激されません。しかし、ジギトニンを段階的に添加すると、細胞の原形質膜が透過化され、ミトコンドリア呼吸が増加すると、完全に透過化され、コハク酸とADPが細胞内に入ります。

しかし、ジギトニンを過剰に使用すると、ミトコンドリアの外膜の完全性が損なわれ、複合体が依存状態3呼吸に減少する可能性があります。ジギトニン処理細胞では、シトクロムcは依存性状態3呼吸への複合体増強を示さず、シトクロムcがミトコンドリア外膜からのシトクロムcの損失はなく、シトクロムcが非常に高用量のジギトニンで処理された細胞の呼吸を増強するにもかかわらず、ミトコンドリアの完全性が維持されることを示している。ジギトニン透過後のミトコンドリア複合体活性の外因性基質の添加は、ミトコンドリア呼吸鎖複合体1、2、および4の最大呼吸数の増加を誘発します。

呼吸レベルの低下の発生は、前の実験からのミトコンドリア阻害剤によるオキシグラフチャンバーの汚染が原因である可能性があります。.アリギマイシンの存在下とFCCPの逐次添加により、細胞の最大非結合呼吸数が観察されます。これらのテクニックを習得すると、適切に実行すれば、これらのテクニックはいずれも1時間以内に完了できます。

この手順を試みる際には、各実験後にオキシグラフチャンバーとストッパーを広範囲に洗浄することを覚えておくことが非常に重要です。この手順に続いて、呼吸数の変化がミトコンドリア基質の不足によるものなのか、ATPシンテート活性の低下によるものなのかなどの追加の質問に答えるために、細胞ATP含有量の測定などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、バイオネジェティクスの分野の研究者が、後天性および遺伝性のミトコンドリア病、酸化ストレス、皮膚灌流障害、無傷または透過化された細胞または繊維および単離されたミトコンドリアの老化などの分野でミトコンドリア機能を探求する道を開きました。

このビデオを見た後、高解像度呼吸測定を使用して、透過処理された細胞と無傷の細胞でミトコンドリアの機能を支援する方法について十分に理解できるはずです。アンチマイシンa、ロテノン、イオジドナトリウム、FCCP、アリコマイシンの取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、手袋や白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。