Name: 単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: 学ぶマウス心臓単離ミトコンドリアにおける透水性遷移孔開口のマルチパラメータ測定法。分光蛍光法を用いてカルシウム取り込み、膜電位、体積変化を同時測定し、ミトコンドリア機能と細胞生存に関する重要な知見を得る。

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1。マウスの心臓からミトコンドリアの単離<ol><li>心臓がミトコンドリア単離するためには、あなたの地元の施設内動物のケアと使用委員会によって承認された手順に従って、マウスを麻酔し、生け贄に捧げる。 </li></ol> 注：ミトコンドリア単離プロトコルのすべてのステップは、氷上で行う必要があります。氷冷緩衝液及び予冷ペトリ皿、ファルコンチューブ、エッペンドルフチューブを使用しています。プロトコルで指定されたボリュームは2マウスの心臓を含むサンプル用です。 <ol start="2"><li> 、心を取り除く冷たいミトコンドリア単離緩衝液（300 mMスクロース、10mMのNa-HEPES、200μMのEDTA、pH7.4）に置き、血を洗い流す。 </li></ol> 注：最適な結果を得るためには、ミトコンドリアの緩衝液のpHをKOHと酢酸で調整する必要があります。 <ol start="3"><li>冷たいペトリ皿の上に置いて心が、脂肪と心房を削除して、取得するまで、ブレードを使用して細かくミンチ均質な製品をING。 </li><li> 50mlのFalconチューブにみじん切りにした心を移し、0.1 mg / mlのトリプシンを用いてミトコンドリア単離緩衝液10mlを加え、サンプルを氷上で10分間消化することができます。 </li></ol> 注：分離手順中にトリプシンが単離されたミトコンドリアの収率を増加させ、ミトコンドリアの準備の間に一定に保つ必要があります。我々は、単離された調剤のミトコンドリアの機能をテストすると、酵素が機能を妨害しないことを保証するためにトリプシンの不在であることをお勧めします。 <ol start="5"><li> 0.1パーセント脂肪酸フリーBSAおよび5 mgのトリプシンインヒビター（大豆）とミトコンドリア単離緩衝液10mlを加え、トリプシンを中和するためにチューブを転倒数回混ぜる。 </li></ol> 注：ミトコンドリア単離緩衝液を予め用意することができ、-20℃で保存することができます解凍時のpHをチェックしてください。トリプシン、トリプシンインヒビターまたはBSAがなければなりません実験当日のミトコンドリア分離バッファへdded。 <ol start="6"><li> 4℃で1分のために低〜中速の遠心分離によって消化された組織を回復</li><li>再懸濁し、0.1パーセント脂肪酸フリーBSAで8ミリリットルミトコンドリア単離緩衝液における組織とテフロン乳棒（1,200-14,00 rpmで4月6日経過）と電動ダウンスホモジナイザーを用いてホモジナイズする。ホモジナイズしながらサンプルを氷上に保つ。 </li><li> 4℃で10分間800xgで15mlファルコンチューブと遠心分離機にホモジネート転送℃でペレット核や組織片へ。 </li><li> 4時15分、℃、8,000 xgでエッペンドルフチュー​​ブと遠心分離機にミトコンドリアを含む上清を回収</li><li>慎重に上部白層を除去し、1mlのミトコンドリア分離バッファ内のミトコンドリアを含む残りの濃いペレットを洗浄する。 </li><li> 4℃で15分間8000xgで遠心℃、 150μlのミトコンドリアイゾラ清と再懸ミトコンドリアペレットを捨てるるバッファ。さらなるアッセイのための氷の上でミトコンドリア保つ。 </li></ol> 注：機能アッセイ時の最良の結果を得るためには、分離の4時間以内にミトコンドリアを使用しています。 <ol start="12"><li>ブラッドフォードアッセイを用いてミトコンドリアタンパク質を定量化する。 </li></ol> 2。単離されたミトコンドリアの品質管理 2.1。呼吸調節率（RCR）の測定<ol><li>最大酸素ラインを確立するために空気飽和水でOxytherm酸素電極を校正します。酸素の安定レベルはゼロ酸素ラインを確立するために、新たに調製し、10mMの亜硫酸ナトリウム溶液100μlを加えたとき。 30℃で測定を実行</li><li>チャンバーを密閉、Oxytherm室に1μMのロテノンで2mlミトコンドリア呼吸Bufferを（125のKCl、20mMのHEPES、3mMのMgCl 2、400μMのEGTA、300μMのDTT、5mMのKH 2 PO 4、pH7.2）に追加とスタートrecor鼎。 </li><li>酸素信号が安定していれば、1分間250μgのミトコンドリアとレコード基底呼吸を追加します。ミトコンドリアは内在性基質（状態1呼吸）で呼吸するされるこの時点で呼吸が非常に低くなければならない。 </li><li> 5mMのコハク酸と1分間記録信号を追加します。酸素消費量は、状態2呼吸の間に増加する必要があります。 </li><li> 150μMのADPを追加することで、状態3呼吸を誘導する。この時点で、酸素消費量で酸化的リン酸化によるATP合成のために増加する必要があります。記録信号呼吸がADP消費と4呼吸の状態への遷移を示して、遅くまで。少なくとも1分間レコードの状態4呼吸。 </li><li> 1μMのCCCPと1分間記録信号を追加します。切り離さ呼吸は最大でなければならない。 </li></ol> 注：ミトコンドリアの呼吸にCCCPの効果は用量依存性である：CCCPの高濃度の酸素消費量を抑制することができるので、慎重にトンでなければなりませんitrated。 <ol start="7"><li>状態4呼吸時の酸素消費率で状態3呼吸時の酸素消費速度を分割することによって呼吸調節率（RCR）を計算します。ターゲットRCRは≥4でなければなりません。 </li></ol> 2.2。ミトコンドリア膜の完全性の評価（ シトクロム c 試験 ） <ol><li>徹底的に70％エタノールと水との手順を繰り返し2.1.2 -2.1.4とOxytherm室を洗う。 </li><li> 1mMのADPおよび1分間のレコード酸素消費量を追加します。 </li><li> 10μMのシトクロムcを追加します。シトクロムcが無傷ミトコンドリアの膜に不浸透性であるので、呼吸の増加が故障または破損してミトコンドリア膜を示しています。 </li></ol> 3。ミトコンドリア透過性遷移孔の開口部の測定<ol><li> mtPTP開口部のマルチパラメータ測定用の蛍光分光光度計を設定します。 FelixGxプログラムを使用して、新しいハードウェア構成（クアンタマスター着実STAを作成TE）は、光源、励起分光器、試料室および励起分光器（ 図4）に対して90°と270°に位置する2つの検出器を含む。最大時間分解能を達成するために、両方の発光分光器（90°、270°）に無効とサンプルコンパートメントで90°と270°での発光フィルタは、ハードウェア構成のメニューで有効にする必要があります。このステップでは、発光波長のモータ制御を削除し、特定の波長で各単色光分光器を修正します。発光分光器が無効になっていない場合は、各検出器は波長と重複測定の両方の間でサイクルが記録されます。 </li><li>マルチ染料タイプを使用して新しい取得プロトコルを作成し、次の染料のように入力します。 <ul><li>フラ（高Ca + +）：励起340 nmで発光525 nmの（検出器1） </li><li>フラ（低Ca + +）：励起は380nm、発光525nmの（検出器1） </li><li> JC1（集約）：励起543 nmの、放出595nmの（検出器2） </li><li> JC1（モノマー）：励起498 nmであり、放出52​​5nmの（検出器1） </li><li>腫れ：励起525 nmであり、放出52​​5nmの（検出器1） </li></ul></li><li> 37℃に1 nmの励起および発光スリットと温度を設定</li><li>フラとJC-1のレシオメトリック信号を得るために、2つの派生トレースを生成：フラ（高Ca + +）/フラ（低Ca + +）とJC1（集計）/ JC1（モノマー）。 </li><li>それぞれ手動で、検出器1と2から525 nmと595 nmの発光波長を調整します。 </li><li> 1μMのロテノン、5mMのコハク酸、800 nMの使い捨ての4面でフラFFで1ミリリットルミトコンドリアアッセイ緩衝液（120mMのKCl、10mMのNaCl、1mMのKH 2 PO 4、20mMのHEPES-トリス、pH 7.2）を混ぜてメタクリレートキュベット。サンプルコンパートメントに250μgのミトコンドリアと場所のサンプルを追加します。マグネチックスターラーの電源がオンになっていることを確認します。 </li><li>記録を開始します。 1分後、買収を一時停止し、500nMのJC-1を追加してから再起動cquisition。 JC-1の比信号は、アクティブなミトコンドリアによる色素の取り込みを示し、増加する必要があります。 JC-1は信号がプラトー（通常は5分以内）に達するまで、記録を続けます。 </li><li> 20μMのCaCl 2を追加します。フラのFF比信号の瞬間的増加はミトコンドリアCa 2 +取り込みに起因する漸進的な減少が続いアッセイ緩衝液中で増加したCa 2 +の存在によって観察されるべきである。 JC-1の比信号はわずかミトコンドリア膜の脱分極を示す簡潔な一時的減少を示すべきである。 </li><li>基礎レベルの前に別のCaCl 2のパルス（1〜1.5分）のほかにフラFFの比信号が戻るまで待ちます。ミトコンドリアのCa 2を蓄積できなくなるまで、一定の間隔で脈打つ続ける+と+アッセイバッファーへのCa 2を放出し始める。 mtPTP開口部はCa 2 +放出、膜poteに起因するJC-1の信号比が減少したことにより、フラFFの比率信号の同時増加によって可視化されるntial崩壊、ミトコンドリアの膨張に起因する光散乱が減少します（ 図5）。 </li><li> mtPTP活性化に続いて、1mMのEGTA、1μMCCCP及び5μg/ mlのアラメチシンでそれぞれフラFF、JC-1や腫れ信号の特異性を確認します。 </li><li>シクロフィリンD阻害剤シクロスポリン（サイクロフィリンDはmtPTPのコンポーネントである）を1μMの存在下で3.9 - mtPTP開口部の特異性を確認するには、手順3.6を繰り返します。シクロスポリンの存在下では、mtPTPを開くと、対照試料（ 図6）よりもはるかに多くのCaCl 2のパルスを必要とします。 </li></ol> 4。代表的な結果 図2は、単離ミトコンドリアマウス心臓の典型的な呼吸制御を示しています。状態3呼吸はコハク酸でミトコンドリア呼吸するにADPを添加することによって達成され、substraに関して有意に増加した酸素消費量によって特徴付けられる単独でTE。追加されたADPの枯渇は、酸素消費量が低下し、事前のADP添加達成率に匹敵し、その間状態4呼吸を開始する。 RCRは状態4呼吸のそれによって状態3呼吸のための酸素消費速度を割ることによって得られる。 シトクロム c試験は、アッセイミトコンドリア外膜の完全性を目的に使用されます。 シトクロム cコハク酸とADP、観察される呼吸においてさらなる増加にミトコンドリアが呼吸するに追加されたときに、無傷のミトコンドリア外膜（ 図3）を示す。 ミトコンドリア単離心臓でmtPTP開口するための代表的なイメージは、 図4に示されている。この場合mtPTP開口部は1.5分間隔で4 CaCl 2のパルス（20μMずつ）を添加することによって引き起こされた。 mtPTP開口部は、ミトコンドリアCa 2 +のほぼ同時リリース+（フラのFF比信号の増加）、mitochondの崩壊によって明らかであるリアル膜電位（JC-1の比信号の減少）と増加したミトコンドリアの体積（腫れ信号の減少）。 mtPTPのシクロフィリンD成分に結合する、追加されたとき、シクロスポリン、mtPTP開口部は7 CaCl 2のパルスの代わりに4（ 図5）が必要です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" /> 図1：ミトコンドリア単離心臓用のマルチパラメータミトコンドリア透過性遷移孔の開口プロトコルのフロー· ​​チャート。心臓はマウスから採取され、ミトコンドリアは、差動遠心分離により分離されています。ミトコンドリアの調製物を定性的にシトクロム cの存在下で呼吸調節率およびミトコンドリア膜無傷のポーラログラフ測定によって評価されます。単離されたミトコンドリアにおけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部は、シーケンシャルCACによってトリガされます2リットルの追加およびCa 2 +のミトコンドリアマトリックスのミトコンドリア膜電位の崩壊や腫れからの放出を監視することにより、蛍光分光光度計を用いて測定される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" /> 図2の測定 ミトコンドリア単離心臓の呼吸調節率（RCR）。ミトコンドリア単離心臓の酸素消費量は状態3コハク酸とADPの存在下で、呼吸、およびADP消費後の状態4呼吸時の間に測定される。脱共役剤に単離されたミトコンドリアの応答はCCCPの添加により測定されます。グラフ上の数字は、nmol /分/ mgタンパク質の単離されたミトコンドリアによる酸素消費の料金です。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" /> 図3測定<html>ミトコンドリア単離心臓の膜完全性のリーメント。ミトコンドリア膜の完全性は、コハク酸とADPの存在下およびシトクロム cの添加後に分離したミトコンドリアの酸素消費量を測定することによって決定される。グラフ上の数字は、nmol /分/ mgタンパク質の単離されたミトコンドリアによる酸素消費の料金です。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" /> mtPTP開口部のマルチパラメータ測定については、 図4。光度計のハードウェア構成。蛍光分光光度計のハードウェア構成は、光源、励起モノクロメータ、試料室および525 nmと595 nmで一定の発光波長を持つ2つの検出器を含む。検出器1はフラFFのハイとローのCa 2 +、JC-1モノマー、腫れ信号の信号検出に使用されます。検出器2は、JC-1は集約信号を測定します。 jove_content &quot;のfo：キープtogether.withinページ=&quot; always &quot;を&gt; <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" /> 図5ミトコンドリア単離心臓でmtPTP開口のマルチパラメータ測定。 mtPTP開口部は、20μMのCaCl 2およびミトコンドリア、ミトコンドリア膜電位の崩壊からのCa 2 +放出をすることによって特徴付けられ、ミトコンドリアマトリックス容積（腫れ）が増加したの逐次付加によって引き起こされました。ミトコンドリア外のCa 2 +および膜電位は、レシオメトリック指標フラFF（緑のトレース）とJC-1（赤線）を用いて測定した。ミトコンドリアの膨潤が525ナノメートル（黒いトレース）での光散乱を記録することにより測定した。 JC-1や腫れ信号の特異性は、1μMのCCCP及び5μg/ mlのアラメチシン（微生物毒素）でテストされています。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" /> 図6マルチシクロスポリンAシクロスポリン（1μM）の存在下でミトコンドリア単離心臓でmtPTP開口部のパラメータ測定は、単離ミトコンドリア中心にmtPTPを開くのに必要なCaCl 2のパルス数を増加させます。

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここで紹介するプロトコルはミトコンドリア単離心臓（ 図1および図4）に透過性遷移孔の開口部を評価するために必要な実験手順を説明します。マウス心臓ミトコンドリアを単離するための手順を、それらの整合性と機能性を確保呼吸のコントロールは、ミトコンドリアのパラメータが中に監視mtPTP開口部とその測定に用いる染料、蛍光分光計測器のセットアップ、およびmtPTP開口部の特性評価。このプロトコルで用いられる蛍光分光光度計は、同時に、これらの3つのパラメータの迅速な測定を可能にします。しかし、基本的なプロトコルは減少時間分解能を持つとはいえ、他の市販の機器を用いて使用することができる。非レシオメトリック色素を採用することもできますが、Ca 2 +およびミトコンドリア膜電位5の両方の定量的尺度を許可していません。 AmtPTP開口部を測定する時のCa 2 +を蓄積して膜電位を維持するために、両方の能力をしっかりと相互に関係しているからです。良...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T3030 </td></tr><tr><td>トリプシンインヒビター（大豆） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T9128 </td></tr><tr><td>ヒドロ亜硫酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 71699 </td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R8875 </td></tr><tr><td> シトクロム c </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C7752 </td></tr><tr><td>アラメチシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C2759 </td></tr><tr><td>シクロスポリン</td><td>カルビオケム</td><td> 239835 </td></tr><tr><td>フラFF </td><td>インビトロジェン</td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;TD&gt; JC-1 </td><td>インビトロジェン</td><td> T3168 </td></tr><tr><td>テフロン乳棒15mlで組織グラインダーポッターエルベージェム</td><td>ウィートンインダストリーズ</td><td></td></tr><tr><td>オーバーヘッドスターラー</td><td>ウィートンインダストリーズ</td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm（温度制御された酸素極） </td><td> Hansatechインスツルメンツ</td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80デュアルエミッション蛍光分光光度計</td><td>フォトンテクノロジーインターナショナル、Inc。 </td><td></td></tr></tbody></table>

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

ミトコンドリア透過性遷移孔（mtPTP）が1.5 kDaのより小さい分子量を有する溶質を輸送するためにミトコンドリア内膜で形成し、非特定のチャンネルです。細孔の決定的な分子的同一性が議論中であるが、そのようなシクロフィリンD、VDACとANTのようなタンパク質は、形成をmtPTPに貢献します。細胞死におけるmtPTP開口部の関 ​​与は十分に1を確立されている間、累積証拠はmtPTPは、ミトコンドリアのCa 2 +恒常性2、バイオエナジェティックスと3シグナル伝達レドックス中に生理的な役割を果たしていることを示しています。 mtPTP開口部はマトリックスのCa 2 +が、その活性は、酸化ストレスなどのいくつかの他の要因によって変調することができ、アデニンヌクレオチド枯渇、Piの高濃度、ミトコンドリア膜の脱分極や脱共役、および長鎖脂肪酸酸4。 インビトロ 、mtPTPによってトリガされる開口部は、ACHすることができますCa 2 +の外因性の追加（カルシウム保持能力）を介してミトコンドリアのマトリックス内のCa 2 +濃度を増加させることによりieved。 のCa 2 +レベルのミトコンドリア内部の特定のしきい値に達したときに、mtPTPが開き、のCa 2 +放出を容易にする 、プロトン駆動力の損失、膜電位が崩壊し、最終的に破裂につながるミトコンドリアマトリックス容積（腫れ）の増加ミトコンドリア外膜およびオルガネラ機能の不可逆的な損失。 ここでは、単離ミトコンドリアマウス心臓におけるmtPTP開口部の総合的な特性評価を可能にする蛍光分析について説明します。ミトコンドリアのCa 2 +ハンドリング（取り込みと放出は、Ca 2によって測定されたアッセイ培地中+濃度）、ミトコンドリア膜電位、及びmitocho：アッセイはmtPTP開口部が発生したときに変更されている3つのミトコンドリアのパラメータの同時測定を含むndrialボリューム。アッセイ培地とミトコンドリア膜電位のCa 2 +測定を採用染料はフラFF、膜透過性は、Ca 2 +の存在下で励起波長のシフトを受けるレシオメトリックインジケータ、JC-1は、カチオン性であり、それぞれ、低域と高膜電位でグリーンモノマー又は赤凝集体を形成レシオメトリックインジケータ。ミトコンドリアの体積の変化はミトコンドリア懸濁液による光散乱を記録することによって測定されます。高品質で機能的なミトコンドリアがmtPTP開アッセイに必要とされるため、我々はまた、無傷ミトコンドリア、高度に結合されており、機能的な孤立した心を得るために必要な手順について説明します。

単離ミトコンドリアマウス心臓におけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を測定するための分光蛍光プロトコルがここに提示されます。アッセイは、ミトコンドリアCaの同時測定を含む<sup&gt; 2 +</sup&gt;ハンドリング、ミトコンドリア膜電位およびミトコンドリアボリューム。ミトコンドリアは、高品質で機能的な心臓を取得するための手順も記載されている。

ミトコンドリア透過性転移孔（mtPTP）は、ミトコンドリア内膜に形成される非特異的なチャネルであり、以下の溶質を輸送します。

このビデオの目的は、マウス心臓から単離したミトコンドリアにおけるミトコンドリア透過性転移孔の開口特性を評価する手順について説明することです。まず、マウス心臓からミトコンドリアを単離します。分画遠心法を用いて単離したミトコンドリアの品質を、コンピューターに接続した酸素電極を用いて呼吸制御比を測定し、ミトコンドリア膜の完全性を評価することで判定します。その後、分光蛍光計を用いて、カルシウムハンドリング、ミトコンドリア膜電位、およびミトコンドリア体積を同時に測定し、透過性転移孔の開口を判定します。得られたデータは、カルシウム保持能およびミトコンドリア透過性遷移における差異を示しました。単離ミトコンドリアの感度低下や、ミトコンドリア透過性遷移孔の開口は、ミトコンドリアの生理機能および解剖学的構造における複数のレベルでの変化を伴う複雑な現象です。本手法の既存手法に対する主な利点は、複数のパラメータを同時に測定することで、カルシウム、動員、または腫脹などの個別のパラメータのみを測定する場合よりも、現象をより包括的に把握できることです。手順を開始する前に、ミトコンドリア単離バッファーを融解し、pHが7.4であることを確認してください。次に、使用するすべてのバッファー、ディッシュ、およびチューブを氷上に配置します。ミトコンドリア単離プロトコルのすべてのステップは、必ず氷上で行わなければならないことに注意してください。安楽死させたマウスの心臓をペトリ皿に置き、冷たいミトコンドリア単離緩衝液で血液を洗い流します。次に、ブレードを用いて心臓を新しいペトリ皿に移し、脂肪と心房を除去した後、均質な状態になるまで心臓を細切にします。刻んだ心臓を50 milliliterのコニカルチューブに移します。0.1 milligram per milliliterのtrypsinを含むミトコンドリア分離バッファーを10 milliliters加え、氷上で10分間消化させます。trypsinの使用は分離ミトコンドリアの収量を増加させるため、ミトコンドリア調製間で一定に保つ必要があります。ただし、酵素がイオンに干渉しないことを確認するため、トリプシンを用いずに調製した分離ミトコンドリアで機能性をテストすることを推奨します。インキュベーション後、0.1%脂肪酸フリーBSAおよび5 mgのトリプシンインヒビターを含むミトコンドリア分離バッファーを10 mL加え、チューブを数回反転させて混ぜ合わせます。トリプシンを中和するため、消化した組織を4 °Cで1分間、低〜中速で遠心分離して回収します。遠心分離後に再懸濁し、サンプルを氷上に保持したまま、0.1%脂肪酸フリーBSA含有ミトコンドリア分離バッファー 8 mLに組織を懸濁させます。テフロン製ペッスルを備えた電動Dounceホモジナイザーを用い、1,200～1,400 RPMで4～6回パスしてサンプルをホモジナイズします。ホモジネートを15 mLコニカルチューブに移し、4 °Cで800 ×g、10分間遠心分離します。核と組織残渣をペレット化します。遠心分離後、ミトコンドリアを含む上清をマイクロ遠心チューブに回収し、4 °Cで8,000 ×g、15分間遠心分離します。遠心後、ペレットの上層に白い層が形成されます。真空吸引システムを用いて、ミトコンドリアペレット上部の白い層を慎重に吸引し、除去します。その後、ミトコンドリアを含む残りの色の濃いペレットを、1 mLのミトコンドリア単離バッファーで再懸濁します。次に、ミトコンドリアを4 °Cで8,000 ×gで10分間遠心分離します。上清を捨て、ミトコンドリアペレットを150 µLのミトコンドリア単離バッファーで再懸濁し、氷上で保持します。分離ミトコンドリアの呼吸能は、コンピュータに接続されoxy.The plusソフトウェアで制御された酸素電極を用いて測定します。酸素電極は実験当日に校正する必要があります。最終濃度1 µMのrotenoneを含むミトコンドリア呼吸緩衝液2 mLをoxyチャンバーに加え、チャンバーを密閉して酸素信号の記録を開始します。システムによって記録され、コンピュータ画面に表示される信号は、oxy thermチャンバー内の酸素濃度に比例します。酸素信号が安定したら、250 µgのミトコンドリアを加え、1分間、基礎呼吸を記録します。この時点での呼吸速度は、ミトコンドリアが内因性基質を利用して呼吸しているため、非常に低くなるはずです。これはステート1呼吸です。コハク酸を最終濃度 5 mM となるように添加して複合体IIでのミトコンドリア呼吸を開始させ、1分間信号を記録します。ステート2呼吸の間、酸素消費量は増加します。状態呼吸を誘導するために、最終濃度が150 micromolarとなるようにDPを添加します。この時点で、酸化リン酸化によるTP合成により酸素消費量が増加するはずです。DPが消費され、状態4呼吸への移行を示すまで、呼吸速度が低下するまで信号を記録します。状態4（基質レベル呼吸）を少なくとも1分間維持します。CCCPを最終濃度1 µMになるように添加し、1分間信号を記録します。この時点で、脱共役呼吸が最大になります。ステート3呼吸時の酸素消費率を、ステート4呼吸時の酸素消費率で除して呼吸制御比（RCR）を算出します。目標とするRCRは4より大きい値である必要があります。次に、ミトコンドリア膜の完全性を評価するため、新しいミトコンドリア試料にDPを最終濃度1 mMとなるように添加し、ステート3呼吸を誘導します。その後、酸素消費量を1分間記録し、10 µMのシトクロムCを添加して、さらに2〜3分間酸素消費量を記録します。良好なミトコンドリア調製物では、シトクロムCは完全なミトコンドリア膜を透過しないため、呼吸量の増加は見られないか、あるいはごくわずかな増加に留まります。呼吸量が増加した場合は、ミトコンドリア膜の破断または損傷を示しています。ミトコンドリア透過性移行孔開口のマルチパラメーター測定に使用する装置は、Felix GXプログラムでコンピュータ制御されるQuantum Masterデュアルエミッション分光蛍光光度計で構成されています。Felix GXプログラムを用いてマルチディテクション取得プロトコルを作成し、レシオメトリック染料であるForerおよびJC-1を用いたカルシウム濃度、ミトコンドリア膜電位、および膨潤の測定パラメータを入力します。Forer比およびJC-1比の誘導トレースを生成します。使い捨ての4面メアクリルプレートに、最終濃度が1 µM rotenone、5 mM succinate、および800 nMのミトコンドリアアッセイバッファーを1 mL混合します。FFに対し、250 µgのミトコンドリアを添加し、サンプルを分光蛍光光度計のサンプルコンパートメントに設置します。1分後に蛍光信号の記録を開始し、一度取得を停止して500 nanomolarのJC-1を添加し、その後再び取得を再開します。JC-1の比率信号は、活性化ミトコンドリアによる色素の取り込みを示すため、上昇するはずです。JC-1の信号がプラトーに達するまで記録を継続してください。通常5分以内に、塩化カルシウムを最終濃度20 µMになるように添加します。これにより、アッセイバッファー中のカルシウム存在量の増加を示すFluor FF比信号の即時的な上昇が見られ、その後、ミトコンドリアによるカルシウム取り込みにより徐々に減少します。JC-1比信号は、軽度のミトコンドリア膜脱分極を示す短時間の過渡的な減少を示すはずです。ER FF比のシグナルが基底レベルに戻ったとき（通常、別の20 µMの塩化カルシウム添加後1〜1.5分以内）、ミトコンドリアがカルシウムを蓄積できなくなり、アッセイバッファー中へカルシウムを放出し始めるまで、固定の間隔でパルス投与を継続します。ミトコンドリア透過性移行孔の開口は、カルシウム放出に伴うURA FF比シグナルの同時上昇によって可視化されます。また、膜電位の崩壊によるJC-1シグナル比の低下、およびC56 black 6Jマウスから単離したミトコンドリアの膨潤による光散乱の低下が観察されます。このビデオに示されているように、次にコハク酸とADPが存在する状態3呼吸における酸素消費量と、ここに示すようにADP消費後の状態4呼吸における酸素消費量を測定しました。ADPの添加により、酸化的なリン酸化によって酸素消費量が増加し、その後酸素消費速度が低下します。すべてのADPが消費されると、CCCP存在下でCCCPを添加することにより、分立ミトコンドリアの脱共役に対する反応を測定します。分立ミトコンドリアの膜完全性を評価するため、酸素消費速度が状態3呼吸時よりも高くなることを確認します。コハク酸およびDPの存在下で酸素消費量を測定し、その後シトクロムCを添加しました。ここで示されているように、シトクロムCの添加による酸素消費量はDPおよびコハク酸存在下と比較して有意に増加しておらず、これは損傷のないミトコンドリア膜がシトクロムCに対して不透過性であることを示しています。ミトコンドリア透過性移行（mPT）を評価するため、分離心臓ミトコンドリアにおけるmPTポアの開口をミトコンドリアカルシウム保持能の指標として測定しました。mPTポアの開口は、20 µMを逐次添加することで誘発されました。塩化カルシウム、ミトコンドリア外カルシウム、および膜電位をレシオメトリック指示薬を用いて測定しました。緑色のトレースで示されているのがURA FF、赤色のトレースがJC-1です。ミトコンドリアの膨潤は、525 nmでの光散乱を記録することで測定し、黒色のトレースで示しています。JC-1および膨潤信号の特異性を、1 µMのCCCPおよび5 µg/mLの微生物毒素エチニウムで検証しました。ここで確認できるように、ミトコンドリアによるカルシウム取り込みに伴い、ミトコンドリア膜のわずかな脱分極が生じています。4回のカルシウムパルスの後、ミトコンドリア透過性移行孔の開口は、カルシウム放出を示すURA FFの増加として観察されます。また、膜電位の崩壊を示すJC-1の減少と、ミトコンドリアマトリックス体積の増加（腫脹のマーカーとしての光散乱の減少として観察される）により、ミトコンドリア透過性移行孔開口の特異性が検証されます。同様の測定を、ミトコンドリア透過性移行孔の構成成分であるシクロフィリンDに結合するシクロスポリンAの存在下で行いました。この図に示されているように、1 µMのシクロスポリンAが存在すると、コントロールサンプルと比較して、ミトコンドリア透過性移行孔を開口させるために必要な塩化カルシウムパルスの数が増加します。このビデオを視聴することで、単離した心臓ミトコンドリアにおけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口を評価する方法について、十分に理解することができます。この手順において最も困難な点は、高品質な単離ミトコンドリアを得ることです。したがって、ミトコンドリアをさらに実験に使用する前に、品質管理測定を行うことが重要です。

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JoVE Journal

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