単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

このビデオの目的は、ミトコンドリア透過性遷移を特徴付ける手順を説明することです。マウスの心臓から分離されたミトコンドリアの開口部が悪い。まず、ミトコンドリアはマウスの心臓から単離されます。

示差遠心分離法を使用して、分離されたミトコンドリアの品質は、コンピューターに接続された酸素熱酸素電極を使用して評価され、呼吸制御比を測定し、ミトコンドリア膜の完全性が評価されます。次に、spectro fluoro metric instrumentationを使用して、カルシウムの取り扱い、ミトコンドリア膜電位、ミトコンドリア体積の同時測定を使用して、透過性遷移を決定します。開口部が悪い。

その結果、カルシウムの保持能力とミトコンドリアの透過性遷移に違いが見られました。単離されたミトコンドリアの感度の低下、ミトコンドリア透過性遷移の開放。細孔は、ミトコンドリアの生理学と解剖学のいくつかのレベルでの変化を伴う複雑な現象です。

既存の方法に対するこの手法の主な利点は、複数のパラメータを同時に測定することで、カルシウム、動員または腫脹などの個々のパラメータのみの測定よりも現象のより包括的な画像を提供することです手順を開始する前に、ミトコンドリア分離バッファーを解凍し、pH(7.4)を確認します。次に、使用するすべてのバッファー、ディッシュ、チューブを氷の上に置きます。ミトコンドリア単離プロトコルのすべてのステップは、氷上で実行する必要があることに注意してください。

安楽死させたマウスの心臓をペトリ皿に置き、冷たいミトコンドリアで血液を洗い流します。分離バッファー。次に、ブレードを使用して心臓を新しいペトリ皿に移し、脂肪と心房を取り除き、均質な製品が得られるまで心臓をミンチにします。

みじん切りにした心臓を50ミリリットルの円錐管に移します。10ミリリットルのミトコンドリア分離バッファーを0.1ミリグラム/ミリリットルのトリプシンで加え、サンプルを氷上で10分間分解します。トリプシンの使用は単離されたミトコンドリアの収量を増加させ、ミトコンドリア調製間で一定に保つ必要があることに注意してください。

ただし、トリプシンの非存在下で得られた調製物で単離されたミトコンドリアの機能をテストして、酵素がイオンに干渉しないことを確認することをお勧めします。インキュベーション後、0.1%脂肪酸を含まないBS、a、および5ミリグラムのトリプシン阻害剤を含むミトコンドリア分離バッファーを10ミリリットル加え、チューブを数回反転させて混合し、トリプシンを中和するために、消化された組織を低速から中速で回収する。摂氏4度の1分間の遠心分離。

Resusをスピンした後、0.1%脂肪酸を含まないBSAを含む8ミリリットルのミトコンドリア分離バッファーに組織を懸濁し、サンプルを氷上に保ちます。テフロン乳棒を備えた電動ダンスホモジナイザーを使用して、1、200〜1、400 RPMで4〜6回のパスでサンプルを均質化します。ホモジネートを15ミリリットルのコニカルチューブに移し、Gの800倍で摂氏4度の10分間遠心分離します。

核と組織の破片をペレット化します。スピン後、ミトコンドリアを含む仰臥位をマイクロ遠心チューブに回収し、Gの8,000倍で摂氏4度の15分間遠心分離します。スピン後、ペレットの上に白い層ができます。

真空システムを使用して、ミトコンドリアペレットの上の白い層を慎重に吸引し、取り除きます。次に、1ミリリットルのミトコンドリアにミトコンドリアが含まれている残りの暗いペレットを再懸濁します。分離バッファー。

次に、ミトコンドリアをGの8,000倍で摂氏4度の10分間遠心分離します。仰臥位を廃棄し、ミトコンドリアペレットを再懸濁します。150マイクロリットルのミトコンドリアでは、分離バッファー、ミトコンドリアを氷上に保ちます。

単離されたミトコンドリアの呼吸は、コンピューターに接続された酸素熱酸素電極で測定され、酸素によって制御されます。プラスソフトウェアである酸素電極は、実験当日に校正する必要があります。最終濃度1マイクロモルのロテノンを含む2ミリリットルのミトコンドリア呼吸緩衝液を酸素チャンバーに加え、チャンバーをシールして酸素信号の記録を開始します。

システムによって記録され、コンピューター画面に表示される信号は、酸素サームチャンバー内の酸素濃度に比例します。酸素信号が安定したら、250マイクログラムのミトコンドリアを追加し、1分間の基礎呼吸を記録します。この時点での呼吸は、ミトコンドリアが内因性基質上を熱望しているため、非常に低いはずです。

これが状態1の呼吸です。コハク酸を最終濃度5ミリモルまで追加して、複合体2でミトコンドリア呼吸を開始し、信号を1分間記録します。酸素消費量は、状態2回の呼吸中に増加するはずです。

状態呼吸を誘発するには、DPを最終濃度150マイクロモルに加えます。この時点で、酸化的リン酸化によるTP合成により、酸素消費量は増加するはずです。呼吸が遅くなるまで信号を記録し、DP消費と状態4呼吸レコードへの移行を示します。

状態4、少なくとも1分間呼吸します。CCCPを最終濃度1マイクロモルに添加し、シグナルを1分間記録します。この時点で、非結合呼吸が最大になるはずです。

状態3の酸素消費率を除して呼吸制御比を計算します。呼吸は、状態4中の酸素消費率により、目標RCRの呼吸は4より大きいべきである。次に、ミトコンドリア膜の完全性を評価するために、ミトコンドリアの新しいサンプルで、最終濃度1ミリモルにDPを添加することにより、状態3呼吸を誘発します。

次に、酸素消費量を1分間記録し、10マイクロモルのシトクロムCを加えて、酸素消費量を2〜3分間記録します。シトクロムCは、良好なミトコンドリア調製物中の無傷のミトコンドリア膜に対して不透過性であるため、呼吸の増加はなく、または非常にわずかに増加します。呼吸の増加は、ミトコンドリア膜が壊れているか損傷していることを示しています。

ミトコンドリア透過性遷移ポート開口部のマルチパラメータ測定のための機器は、Felix GXプログラムによって制御される量子マスターデュアル発光分光蛍光計コンピュータで構成されています。Felix GXプログラムを使用して、マルチディ取得プロトコルを作成し、カルシウムミトコンドリア膜電位と比率メトリック染料の膨潤の測定パラメータを入力し、ForerとJC 1は、使い捨ての4面メスACRLベテミックス1ミリリットルのミトコンドリアアッセイ緩衝液で、比率とJC1比率の派生トレースを生成します。 5ミリモルのコハク酸と800ナノモル。FFの場合は、250マイクログラムのミトコンドリアを加え、サンプルを分光蛍光計のサンプルコンパートメントに入れます。

1分後に蛍光シグナルの記録を開始し、取得を一時停止し、500ナノモルJCを1つ追加してから、取得を再開します。JC1比シグナルは、活性ミトコンドリアによるダイインの取り込みを示すために増加するはずです。JC one信号がプラトーに達するまで録音を続けます。

通常5分以内に、塩化カルシウムを最終濃度20マイクロモルまで加えます。Fluor FF比シグナルの瞬間的な増加は、アッセイバッファー中のカルシウム存在の増加を表し、その後、ミトコンドリアのカルシウム取り込みにより徐々に減少することを表しています。JCの1比シグナルは、わずかなミトコンドリア膜の脱分極を示す短い一時的な減少を示すはずです。

ER FF比シグナルが基礎レベルに戻ったら、通常は1〜1.5分以内にさらに20マイクロモルの塩化カルシウムで、ミトコンドリアがカルシウムを蓄積できなくなり、アッセイバッファーにカルシウムを放出し始めるまで、一定の間隔でパルスを続けます。ミトコンドリア透過性遷移ポートの開口部は、カルシウム放出によるURA FF比シグナルの同時増加によって可視化されます。膜電位崩壊によるJC1シグナル比の減少、およびC56黒6Jマウスから単離されたミトコンドリアのミトコンドリア腫脹による光散乱の減少。

このビデオに示すように、コハク酸とDPの存在下での状態3呼吸と、DP消費後の状態4呼吸では、ここに示すように、DP添加により酸化的リン酸化により酸素消費量が増加し、酸素消費量が遅くなると、酸素消費量が測定されました。すべてのDPが消費されると、分離されたミトコンドリアのアンカップリングに対する応答は、CCCPの存在下でのCCCPの添加によって測定されます。酸素消費率は、分離されたミトコンドリアの膜の完全性を評価するために、状態3呼吸中よりも高くなっています。

酸素消費量は、コハク酸およびDPの存在下で測定され、シトクロムの添加後、ここで見られる C.As、シトクロムCの添加はDPおよびコハク酸に対して酸素消費量を有意に増加させないことを示す、無傷のミトコンドリア膜がシトクロムCに対して透過性ではないことを示し、ミトコンドリアの透過性遷移、ミトコンドリアのカルシウム保持能力の指標として孤立した心臓ミトコンドリアにおける開口不良を評価する。ミトコンドリア透過性遷移。開口不良は、20マイクロモルの逐次追加によって引き起こされました。

塩化カルシウム、余分なミトコンドリアカルシウム、および膜電位は、比率メトリック指標で測定されました。緑色のトレースとして示されたURA FFと赤色トレースとして示されたJCのミトコンドリアの膨潤は、ブラックトレースで示される525ナノメートルでの光散乱を記録することにより測定されました。JC oneおよび腫脹シグナルの特異性は、ここで見られるように、微生物毒素エチンの1ミリリットルあたり1マイクロモル、CCCPおよび5マイクログラムでテストされ、ミトコンドリアによるカルシウムの取り込みは、ミトコンドリア膜のわずかな脱分極を伴います。

カルシウムを4回パルスした後、ミトコンドリア透過性遷移プールの開口部は、カルシウム放出を示すURA FFの増加として見られます。JCの1の減少は膜電位の崩壊を示し、ミトコンドリアマトリックスの体積の増加を示しており、これは光散乱の減少としてミトコンドリアの透過性遷移ポート開口部の特異性を確認するための膨潤のマーカーとして見られます。この図に示されているように、ミトコンドリア透過性遷移PO成分シクロフィリン D.As に結合するシクロスポリンAの存在下でも同じ測定が行われ、1マイクロモルのサイクリストボーリングAの存在下では、対照サンプルと比較してミトコンドリア透過性遷移POを開くために必要な塩化カルシウムパルスの数が増加します。

このビデオを見れば、孤立した心臓ミトコンドリアにおけるミトコンドリア透過性遷移ポートの開口部を評価する方法について十分に理解できるはずです。この手順の最も難しい側面は、良質の単離ミトコンドリアを得ることです。したがって、ミトコンドリアをさらなる実験に使用する前に、品質管理測定を行うことが重要です。