単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

このビデオの目的は、マウス心臓から単離したミトコンドリアにおけるミトコンドリア透過性転移孔の開口特性を評価する手順について説明することです。まず、マウス心臓からミトコンドリアを単離します。

分画遠心法を用いて単離したミトコンドリアの品質を、コンピューターに接続した酸素電極を用いて呼吸制御比を測定し、ミトコンドリア膜の完全性を評価することで判定します。その後、分光蛍光計を用いて、カルシウムハンドリング、ミトコンドリア膜電位、およびミトコンドリア体積を同時に測定し、透過性転移孔の開口を判定します。

得られたデータは、カルシウム保持能およびミトコンドリア透過性遷移における差異を示しました。単離ミトコンドリアの感度低下や、ミトコンドリア透過性遷移孔の開口は、ミトコンドリアの生理機能および解剖学的構造における複数のレベルでの変化を伴う複雑な現象です。

本手法の既存手法に対する主な利点は、複数のパラメータを同時に測定することで、カルシウム、動員、または腫脹などの個別のパラメータのみを測定する場合よりも、現象をより包括的に把握できることです。手順を開始する前に、ミトコンドリア単離バッファーを融解し、pHが7.4であることを確認してください。次に、使用するすべてのバッファー、ディッシュ、およびチューブを氷上に配置します。ミトコンドリア単離プロトコルのすべてのステップは、必ず氷上で行わなければならないことに注意してください。

安楽死させたマウスの心臓をペトリ皿に置き、冷たいミトコンドリア単離緩衝液で血液を洗い流します。次に、ブレードを用いて心臓を新しいペトリ皿に移し、脂肪と心房を除去した後、均質な状態になるまで心臓を細切にします。

刻んだ心臓を50 milliliterのコニカルチューブに移します。0.1 milligram per milliliterのtrypsinを含むミトコンドリア分離バッファーを10 milliliters加え、氷上で10分間消化させます。trypsinの使用は分離ミトコンドリアの収量を増加させるため、ミトコンドリア調製間で一定に保つ必要があります。

ただし、酵素がイオンに干渉しないことを確認するため、トリプシンを用いずに調製した分離ミトコンドリアで機能性をテストすることを推奨します。インキュベーション後、0.1%脂肪酸フリーBSAおよび5 mgのトリプシンインヒビターを含むミトコンドリア分離バッファーを10 mL加え、チューブを数回反転させて混ぜ合わせます。トリプシンを中和するため、消化した組織を4 °Cで1分間、低〜中速で遠心分離して回収します。

遠心分離後に再懸濁し、サンプルを氷上に保持したまま、0.1%脂肪酸フリーBSA含有ミトコンドリア分離バッファー 8 mLに組織を懸濁させます。テフロン製ペッスルを備えた電動Dounceホモジナイザーを用い、1,200～1,400 RPMで4～6回パスしてサンプルをホモジナイズします。ホモジネートを15 mLコニカルチューブに移し、4 °Cで800 ×g、10分間遠心分離します。

核と組織残渣をペレット化します。遠心分離後、ミトコンドリアを含む上清をマイクロ遠心チューブに回収し、4 °Cで8,000 ×g、15分間遠心分離します。遠心後、ペレットの上層に白い層が形成されます。

真空吸引システムを用いて、ミトコンドリアペレット上部の白い層を慎重に吸引し、除去します。その後、ミトコンドリアを含む残りの色の濃いペレットを、1 mLのミトコンドリア単離バッファーで再懸濁します。

次に、ミトコンドリアを4 °Cで8,000 ×gで10分間遠心分離します。上清を捨て、ミトコンドリアペレットを150 µLのミトコンドリア単離バッファーで再懸濁し、氷上で保持します。

分離ミトコンドリアの呼吸能は、コンピュータに接続されoxy.The plusソフトウェアで制御された酸素電極を用いて測定します。酸素電極は実験当日に校正する必要があります。最終濃度1 µMのrotenoneを含むミトコンドリア呼吸緩衝液2 mLをoxyチャンバーに加え、チャンバーを密閉して酸素信号の記録を開始します。

システムによって記録され、コンピュータ画面に表示される信号は、oxy thermチャンバー内の酸素濃度に比例します。酸素信号が安定したら、250 µgのミトコンドリアを加え、1分間、基礎呼吸を記録します。この時点での呼吸速度は、ミトコンドリアが内因性基質を利用して呼吸しているため、非常に低くなるはずです。

これはステート1呼吸です。コハク酸を最終濃度 5 mM となるように添加して複合体IIでのミトコンドリア呼吸を開始させ、1分間信号を記録します。ステート2呼吸の間、酸素消費量は増加します。

状態呼吸を誘導するために、最終濃度が150 micromolarとなるようにDPを添加します。この時点で、酸化リン酸化によるTP合成により酸素消費量が増加するはずです。DPが消費され、状態4呼吸への移行を示すまで、呼吸速度が低下するまで信号を記録します。

状態4（基質レベル呼吸）を少なくとも1分間維持します。CCCPを最終濃度1 µMになるように添加し、1分間信号を記録します。この時点で、脱共役呼吸が最大になります。

ステート3呼吸時の酸素消費率を、ステート4呼吸時の酸素消費率で除して呼吸制御比（RCR）を算出します。目標とするRCRは4より大きい値である必要があります。次に、ミトコンドリア膜の完全性を評価するため、新しいミトコンドリア試料にDPを最終濃度1 mMとなるように添加し、ステート3呼吸を誘導します。

その後、酸素消費量を1分間記録し、10 µMのシトクロムCを添加して、さらに2〜3分間酸素消費量を記録します。良好なミトコンドリア調製物では、シトクロムCは完全なミトコンドリア膜を透過しないため、呼吸量の増加は見られないか、あるいはごくわずかな増加に留まります。呼吸量が増加した場合は、ミトコンドリア膜の破断または損傷を示しています。

ミトコンドリア透過性移行孔開口のマルチパラメーター測定に使用する装置は、Felix GXプログラムでコンピュータ制御されるQuantum Masterデュアルエミッション分光蛍光光度計で構成されています。Felix GXプログラムを用いてマルチディテクション取得プロトコルを作成し、レシオメトリック染料であるForerおよびJC-1を用いたカルシウム濃度、ミトコンドリア膜電位、および膨潤の測定パラメータを入力します。Forer比およびJC-1比の誘導トレースを生成します。使い捨ての4面メアクリルプレートに、最終濃度が1 µM rotenone、5 mM succinate、および800 nMのミトコンドリアアッセイバッファーを1 mL混合します。FFに対し、250 µgのミトコンドリアを添加し、サンプルを分光蛍光光度計のサンプルコンパートメントに設置します。

1分後に蛍光信号の記録を開始し、一度取得を停止して500 nanomolarのJC-1を添加し、その後再び取得を再開します。JC-1の比率信号は、活性化ミトコンドリアによる色素の取り込みを示すため、上昇するはずです。JC-1の信号がプラトーに達するまで記録を継続してください。

通常5分以内に、塩化カルシウムを最終濃度20 µMになるように添加します。これにより、アッセイバッファー中のカルシウム存在量の増加を示すFluor FF比信号の即時的な上昇が見られ、その後、ミトコンドリアによるカルシウム取り込みにより徐々に減少します。JC-1比信号は、軽度のミトコンドリア膜脱分極を示す短時間の過渡的な減少を示すはずです。

ER FF比のシグナルが基底レベルに戻ったとき（通常、別の20 µMの塩化カルシウム添加後1〜1.5分以内）、ミトコンドリアがカルシウムを蓄積できなくなり、アッセイバッファー中へカルシウムを放出し始めるまで、固定の間隔でパルス投与を継続します。ミトコンドリア透過性移行孔の開口は、カルシウム放出に伴うURA FF比シグナルの同時上昇によって可視化されます。また、膜電位の崩壊によるJC-1シグナル比の低下、およびC56 black 6Jマウスから単離したミトコンドリアの膨潤による光散乱の低下が観察されます。

このビデオに示されているように、次にコハク酸とADPが存在する状態3呼吸における酸素消費量と、ここに示すようにADP消費後の状態4呼吸における酸素消費量を測定しました。ADPの添加により、酸化的なリン酸化によって酸素消費量が増加し、その後酸素消費速度が低下します。すべてのADPが消費されると、CCCP存在下でCCCPを添加することにより、分立ミトコンドリアの脱共役に対する反応を測定します。分立ミトコンドリアの膜完全性を評価するため、酸素消費速度が状態3呼吸時よりも高くなることを確認します。

コハク酸およびDPの存在下で酸素消費量を測定し、その後シトクロムCを添加しました。ここで示されているように、シトクロムCの添加による酸素消費量はDPおよびコハク酸存在下と比較して有意に増加しておらず、これは損傷のないミトコンドリア膜がシトクロムCに対して不透過性であることを示しています。ミトコンドリア透過性移行（mPT）を評価するため、分離心臓ミトコンドリアにおけるmPTポアの開口をミトコンドリアカルシウム保持能の指標として測定しました。mPTポアの開口は、20 µMを逐次添加することで誘発されました。

塩化カルシウム、ミトコンドリア外カルシウム、および膜電位をレシオメトリック指示薬を用いて測定しました。緑色のトレースで示されているのがURA FF、赤色のトレースがJC-1です。ミトコンドリアの膨潤は、525 nmでの光散乱を記録することで測定し、黒色のトレースで示しています。JC-1および膨潤信号の特異性を、1 µMのCCCPおよび5 µg/mLの微生物毒素エチニウムで検証しました。ここで確認できるように、ミトコンドリアによるカルシウム取り込みに伴い、ミトコンドリア膜のわずかな脱分極が生じています。

4回のカルシウムパルスの後、ミトコンドリア透過性移行孔の開口は、カルシウム放出を示すURA FFの増加として観察されます。また、膜電位の崩壊を示すJC-1の減少と、ミトコンドリアマトリックス体積の増加（腫脹のマーカーとしての光散乱の減少として観察される）により、ミトコンドリア透過性移行孔開口の特異性が検証されます。同様の測定を、ミトコンドリア透過性移行孔の構成成分であるシクロフィリンDに結合するシクロスポリンAの存在下で行いました。この図に示されているように、1 µMのシクロスポリンAが存在すると、コントロールサンプルと比較して、ミトコンドリア透過性移行孔を開口させるために必要な塩化カルシウムパルスの数が増加します。

このビデオを視聴することで、単離した心臓ミトコンドリアにおけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口を評価する方法について、十分に理解することができます。この手順において最も困難な点は、高品質な単離ミトコンドリアを得ることです。したがって、ミトコンドリアをさらに実験に使用する前に、品質管理測定を行うことが重要です。