Hypoparathyroidマウスを作成するための2つのテクニック：副甲状腺GFP腺およびジフテリア毒素媒介副甲状腺アブレーションを使用して

この手順の全体的な目標は、後天性副甲状腺機能低下症の 2 つのマウス モデルを生成し、使いやすく、安定した表現型を生成し、甲状腺機能を損なわないようにすることです。これら2つのモデルの主な利点は、蛍光ガイド下手術またはジフテリア毒素受容体のPTH特異的発現により、マウスの副甲状腺の正確な除去を可能にし、隣接する甲状腺に干渉することなく細胞を選択的に標的化して破壊できることです。私たちのマウスモデルが副甲状腺機能低下症の分野における重要な質問に答えることができることを願っています。

例えば、PTHアナログ療法は、尿中カルシウム排泄を増加させることなく、正常な血清カルシウムレベルを維持するのに役立ちますか?これらのモデルは、副甲状腺機能低下症における他の臨床上の問題を研究するためにも使用できます。例えば、骨の強度は副甲状腺機能低下症の影響を受けますか、また治療によって変化しますか?

このような質問は、患者では答えるのが難しいですが、これらのマウスモデルを使用して対処することができます。8〜10週齢のマウスに麻酔をかけることから始め、承認されたプロトコルに従って副甲状腺でGFPを特異的に発現させます。動物を仰臥位に置き、つま先をつまむ、つま先をつまむ、離脱反射、または他の手段がないことにより、適切な麻酔の深さを確保します。

腹側頸部を伸ばし、毛皮を剃って手術の準備をします。剃った皮膚をポビドンヨード消毒パッドで消毒し、承認されたプロトコルに従って外科用スクラブとアルコールリンスを使用して切開部位を準備します。次に、手術部位の汚染を減らすために、動物を滅菌外科用ドレープで覆います。

外科用メスで縦2センチの切開部を切開した後、湾曲した鋸歯状の鉗子を使用して筋膜を解剖し、唾液腺を横に押します。次に、解剖顕微鏡で手術部位を見ながら、鋭利な鉗子の先端を使用して気管傍筋を切断して分離し、気管を露出させます。気管の隣にある甲状腺の左右の葉を特定します。

次に、光源を蛍光灯に切り替えて、2つの緑色の蛍光副甲状腺を視覚化します。げっ歯類は通常、副甲状腺を2つしか持っていません。両側の甲状腺の隣にある2つの副甲状腺を特定できない場合は、異所性に位置する副甲状腺が疑われ、気管に沿ってそれらを慎重に検索する必要があります。

次に、外科用鉗子とハサミを使用して緑色の副甲状腺を慎重に取り除き、気管に沿って慎重にチェックして、すべての緑色の組織が除去されていることを確認します。止血には滅菌ガーゼを使用してください。中断された縫合糸で気管傍筋を閉じます。

ハルステッド縫合糸で皮膚の切開を閉じます。術後の動物を体温回復のために、温熱パッド上の別のケージに入れます。マウスが目を覚ましたら、ペレットチャウとゼラチンフードを入れた水をケージの床に置きます。

術後2時間の観察期間を経て、マウスを動物施設に戻します。副甲状腺摘出術の3日後、血液ガスシステム、カルシウム、pH分析装置などの分析装置を使用して、10マイクロリットルの尾血のイオン化カルシウムを分析します。副甲状腺摘出術が成功した場合、血液イオン化カルシウムは、偽の手術を受けた対照マウスの標準偏差のマイナス 2 標準偏差以下になります。

ジフテリア毒素粉末を滅菌生理食塩水で0.5マイクログラム/ミリリットルの濃度に希釈することにより、ジフテリア毒素溶液を調製することから始めます。滅菌フィルター溶液とアロコート。体重1キログラムあたり5マイクログラムのジフテリア毒素を8〜10週齢のマウスに注射し、副甲状腺でジフテリア毒素受容体を特異的に発現させます。

ジフテリア毒素の2回目の注射の3日後、以前と同様に、10マイクロリットルの尾血を分析してイオン化カルシウムを探します。以下は、副甲状腺に特異的にGFPを発現するマウスの副甲状腺のさまざまな位置の代表的な画像です。マウスには2つまたは3つの緑色の副甲状腺がありました。

ほとんどの副甲状腺は、甲状腺の上縁近くまたは下縁の近くに位置していました。まれに、一部の副甲状腺が異所性に位置していました。私たちのマウスモデルの利点の1つは、甲状腺が無傷のままであることです。

この図は、副甲状腺摘出術の3ヵ月後のGFP-PTXマウスのTSH値を示しています。この図は、T4 の測定値を示しています。GFP-PTXマウスは、対照マウスと差のないTSH濃度とT4濃度を示しました。

この画像は、GFP-PTXマウスの血中カルシウム濃度とPTH濃度を示しています。この画像は、PTHcre-iDTRマウスにジフテリア毒素を注入したマウスの血中カルシウム濃度とPTH濃度を示しています。GFP-PTXマウスとDTを注入したPTHcre-iDTRマウスは、ともに安定した低カルシウム血症を示し、3ヶ月間の観察期間でPTH値が低下しました。

一度習得すると、GFPガイド下副甲状腺切除術は、全手順で約20分で行うことができます。ジフテリア毒素の1回の注射は、適切に行われれば1分もかかりません。この手順の後、これらのマウスは副甲状腺機能低下症を発症し、前臨床疾患モデルとして使用できます。

副甲状腺機能低下症の治療におけるさまざまなPTHホルモン類似体の有効性などの問題に対処できます。ジフテリア毒素は危険であり、労働者は通常のジフテリア毒素予防接種を受けるべきであることを忘れないでください。これらの手順を実行するときは、マスクや手袋などの個人用保護具を常に着用する必要があります。