用ドリップ流れと回転円板の原子炉の使用黄色ブドウ球菌バイオフィルム分析
December 27th, 2010
ドリップ流反応器と回転するディスクの原子炉とオープンシステムの流れのバイオフィルムを利用するためのプロトコルを詳細に表示されます。
この手順の全体的な目標は、ドリップフローバイオフィルムリアクターまたは回転ディスクリアクターのいずれかを使用して、低または中程度のせん断力で細菌バイオフィルムを成長させることです。バイオフィルム内のクーポンは、最初に細菌を接種し、摂氏37度でインキュベートして細菌細胞が成長表面に付着するように反応します。細胞がクーポンに付着すると、成長培地の流れが始まり、バイオフィルムの発達中に作用する力が発揮されます。
その後、成熟したバイオフィルムを採取して、バイオフィルムの分析観察を行うことができます。走査型電子顕微鏡を使用して、生成されたバイオフィルムの超構造を決定することができます。私はブレイズボールです。
フローセルのような既存の方法のこの技術の主な利点は、高いバイオマス生産と複数の同一のバイオフィルムが容易に達成できることです。この手順を実演するのは、Rachel Stevenson と、私の研究室の技術者で大学院生の Kelly Schwartz です。ドリップフローバイオフィルムリアクターは、メディア入力用の入力ポートと廃棄物排出用のアウトフローポートを備えた4つのチャンバーで構成されています。
各チャンバー内には、バイオフィルムが成長するための取り外し可能なクーポンがあります。ドリップフローバイオフィルムリアクターを組み立てるには、クーポンを各平行チャンバーに配置し、チャンバーの蓋を固定します。組み立てられたリアクターと流暢な栄養チューブをオートクレーブして、使用前にシステムを滅菌します。
また、バイオフィルム成長培地をオートクレーブして、滅菌したドリップフローリアクターに接種します。装置を平らな面に置き、clamp 排水ライン。次に、各チャンバーに10ミリリットルの滅菌三連祭壇画大豆ブロスベースの成長培地を満たし、100マイクロリットルの黄色ブドウ球菌を追加します。
一晩培養し、同じ培地で各チャンバーに別々に成長させました。接種したリアクターを摂氏37度のインキュベーターに18時間置き、細胞がクーポン表面に付着することを確認します。インキュベーション後、UNCは排水チューブをクランプし、リアクターを傾斜した木製ブロックカッターに10度の角度で置きます。無菌的に。
流暢な栄養チューブを連続フロー栄養ブロスが入ったボトルに接続します。ポンプを介してチューブラインに供給し、ポンプを全速力で運転してチューブをプライミングします。流暢なチューブがプライミングされたら、ポンプを停止し、各チューブの端に22ゲージの1インチ針を取り付けます。
チャンバーインレットストッパーをエタノールワイプで無菌的に拭きます。インレットストッパーに針を挿入します。ポンプをオンにし、ミディアムがクーポンに滴下するのを待ちます。
毎分約125マイクロリットルの流量で、メディアは入口ストッパーポートから排水ポートに下向きに流れる必要があります。リアクターを連続流で3日間運転します。時々、原子炉が適切に排水されているかどうかをチェックします。
ドレナージは、媒体がチャンバーに溜まっていないことを確認するために、チャンバーの目視検査によってチェックされます。メディアが溜まっている、挟まれている場合、流出チューブは通常、バイオフィルムを採取し、ポンプを停止し、反応器から針を取り除くための適切な排水を促進します。次に、リアクターを平らな面に置きます。
3日間の連続流動の後、黄色のバイオマスが接種されたクーポンの長さに沿って広がる黄色のバイオマスとして現れます。バイオフィルムの走査型電子顕微鏡写真は、表面に関連するバイオフィルムコミュニティのクーポンを覆う黄色ブドウ球菌を明らかにします。得られたバイオマスを定量化するために、滅菌鉗子を使用して、敗血症的に、クーポンを取り除き、細胞スクレーパーを使用して細菌を採取し、次にそれらを5ミリリットルの滅菌PBSを含む円錐管に移します。
組織を使用して、ホモジナイザーは均一な懸濁液が得られるまで細菌の凝集体を解凝集します。コロニー形成ユニットは、三連祭壇画ソガープレートに段階希釈液をプレーティングし、摂氏37度で24時間インキュベートし、コロニーをカウントすることによって定量されます。回転ディスクバイオフィルムリアクターは、成長培地がポンプで送られるケモススタットで構成されています。
スターバーと回転ディスクに収まるように設計された18枚のクーポンを備えた回転ディスク。最初にリアクターを組み立てるには、スピニングディスククーポンをスピニングディスクのスロットにロードします。次に、オーバーフローポート付きの1リットルのガラスビーカー内にロードされたディスクを置き、メディアフロー用の穴と曝気用の穴が1つある15番のゴム栓で反応器をキャップします。
オートクレーブ、組み立てられたリアクター、およびシステムを滅菌するためのインレットチューブ。リアクターに接種するには、ビーカーに250ミリリットルの滅菌培地を満たし、三連祭壇画大豆ブロスで栽培した黄色ブドウ球菌の一晩培養液を500マイクロリットル加えます。リアクターを毎分250回転に設定された攪拌板に置き、摂氏37度で一晩インキュベートして、細胞がクーポンに付着できるようにします。
一晩のインキュベーション後、インレットチューブを培地リザーバーのポートとペリスタルティックポンプに接続します。ポンプをオンにし、流量を毎分0.25ミリリットルに設定します。反応器を摂氏37度で24時間運転して、得られたバイオフィルムを収穫します。
原子炉を停止し、無菌的に停止します。クーポンに触れずにディスクを取り出します。滅菌鉗子を使用して、クーポンを取り外し、各クーポンを滅菌PBSに慎重に浸して、抗菌化合物試験のために緩く付着した細菌を取り除きます。
無菌的には、対象化合物を含む96ウェルプレートの個々のウェルにクーポンを入れます。プレートを摂氏37度で4時間インキュベートします。次に、クーポンをPBSの1倍を含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、ホモジナイザーを使用してバイオフィルムを分散させます。
最後に、栄養寒天培地上で細胞の段階希釈をプレート化し、前述のようにサンプルあたりの生存コロニー形成単位の数を決定します。このグラフは、スピニングディスクリアクターを使用して調製され、過酸化水素にさらされたバイオフィルムのコロニー形成ユニットの数を示しており、最大18個の同一のバイオフィルムを生成する能力があります。スピニングディスクリアクターを使用することで、この技術は抗菌化合物の試験に理想的です。
このビデオを見れば、ドリップフローと回転ディスクリアクターバイオフィルムの実行方法について十分に理解できるはずです。これらのバイオフィルムリアクターは、フローセルおよびマイクロタイタープレートバイオフィルムの代替品を提供し、大量のバイオフィルムバイオマスが必要な場合や、確立されたバイオフィルムの抗菌試験が必要な場合に最適です。
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概要
この記事では、ドリップフローリアクターと回転ディスクリアクターを使用して細菌バイオフィルムを成長させるためのプロトコルを紹介します。これらの手順は、クーポンに細菌を接種し、制御されたせん断力下でバイオフィルムを形成させる過程を詳細に説明しています。
主要な研究要素
科学分野
- 微生物学
- バイオフィルム工学
- バイオテクノロジー
背景
- 細菌バイオフィルムは、表面に付着する複雑な共同体です。
- バイオフィルムの発生を理解することは、様々な応用に不可欠です。
- せん断力はバイオフィルムの構造と機能に影響を与えます。
- 異なるリアクターの設計は、バイオフィルムの成長動態に影響を与える可能性があります。
研究目的
- バイオフィルム成長のための詳細なプロトコルを提供すること。
- ドリップフローリアクターと回転ディスクリアクターの効果を比較すること。
- 成熟したバイオフィルムの分析を容易にすること。
使用した方法
- クーポンへの細菌細胞の接種。
- 付着のために37度セルシウスでインキュベーション。
- 発生中のせん断力を作り出すための成長培地のフロー。
- バイオフィルム分析のための走査型電子顕微鏡。
主要な結果
- 指定された条件下での細菌バイオフィルムの成功的な成長。
- 異なるリアクタータイプからのバイオフィルム構造の比較。
- せん断力がバイオフィルムの形態に与える影響についての洞察。
- 電子顕微鏡を用いたバイオフィルムの詳細な画像化。
結論
- 概説されたプロトコルはバイオフィルム研究に効果的です。
- リアクターの選択はバイオフィルムの特性に大きな影響を与えます。
- さらなる研究はこれらの方法を応用して高度な応用を構築できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Robust biofilm models are essential for evaluating antimicrobial strategies and material performance in pharmaceutical and biotechnology R&D. Drip flow and rotating disk reactors enable reproducible, high-biomass Staphylococcus aureus biofilm formation under controlled shear, supporting predictive confidence in compound screening and device testing. These systems address critical early discovery and preclinical inflection points by standardizing biofilm growth for downstream quantitative analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of antimicrobial hypotheses in disease-relevant biofilm models.
- Supports functional validation of anti-biofilm targets and materials.
- Facilitates mechanistic de-risking by controlling shear and growth conditions.
- Provides reproducible platforms for portfolio triage of candidate compounds.
Screening & Assay Development
- Generates standardized, high-biomass biofilms for quantitative compound evaluation.
- Enables parallel production of identical biofilm samples for reproducibility.
- Supports scalable screening of antimicrobial efficacy and material performance.
- Delivers quantitative outputs such as colony forming units for assay comparability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with clinically relevant device and material testing.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of anti-biofilm strategies.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates based on robust biofilm challenge data.
- Provides mechanistic insight into biofilm resilience and removal under defined shear.
Pipeline & Workflow Integration
Drip flow and rotating disk reactors position biofilm analysis from early discovery through preclinical evaluation, bridging hypothesis testing, screening, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of antimicrobial and anti-fouling interventions in controlled biofilm systems.
- Screening: Provides reproducible, quantitative biofilm assays for compound and material evaluation.
- Analytics: Enables measurement of colony forming units and biofilm biomass for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with device and material testing relevant to clinical applications.
- Enterprise Reuse: Offers standardized, scalable platforms for repeated use across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in anti-biofilm efficacy and material performance.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable biofilm production workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in anti-infective and device portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on robust biofilm data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic technique and biofilm quantification.
- Needs access to specialized reactors, incubators, and analytical tools such as homogenizers and microscopy.
- Demands cross-team standardization of protocols for reproducibility.
- Adaptable to various coupon materials and device-relevant surfaces.
- Limited to in vitro modeling; translation to in vivo systems requires further validation.
