ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

このプロトコルの全体的な目標は、4つの異なる周産期組織源、臍帯内層、ウォートンゼリー、臍帯-胎盤接合部、および胎児胎盤から間葉系間質細胞を分離することです。この方法は、特別な品質の間葉系幹細胞を非侵襲的に取得することにより、幹細胞生物学、代替医療の分野を前進させるのに役立ちます。この技術の主な利点は、異なる周産期組織源から多数の高品質の均質な細胞集団を生産的に得られることです。

この技術に由来する多能性臍帯間葉系間質細胞は、成体組織から単離された間葉系幹細胞よりも原始的であるため、さまざまな疾患や障害の治療に使用できます。この方法は、臍帯と胎盤のさまざまなセグメントと特定のニッチからの間葉系間質細胞の特性についての洞察を提供することができます。まず、バイオセーフティキャビネット内の氷上の150mmシャーレにサンプルを入れ、針とシリンジを使用して、氷冷PBSで組織を数回すすぎます。

すべての血栓が除去されたら、サンプルを注意深く調べて、さまざまな解剖学的領域を特定します。次に、鉗子を使用して臍帯の胎児端をつかみ、はさみを使用して臍帯と胎盤の接合部の上部を慎重に切開します。接合部の下に2回目の切開を行い、コードと胎盤の接合部を胎盤から分離します。

そして、分離したティッシュを個々のシャーレに分割します。次に、へその緒を縦方向に切断して、上皮を乱さずに血管と周囲のウォートンゼリーを完全に露出させます。メスを使用して、ウォートンゼリーを亜羊膜の血管と上皮間からこすり落とします。

次に、血管を取り外し、血管の下と周囲に残っている血管周囲ゼリーをウォートンのゼリー皿に移し、残りのコードライニング組織を独自の皿に入れます。すべての組織が解剖されたら、各皿のPBSを3〜5ミリリットルのトリプシンと交換し、ハサミを使用して各組織サンプルを1〜2ミリメートルの小片に切断し、摂氏37度と二酸化炭素5%で30分間インキュベーションします。位相差顕微鏡を使用して、組織からの細胞の放出を視覚化することにより、部分消化を観察します。

部分分解期間の終わりに、等量の培地でトリプシンを中和し、サンプルを個々の50ミリリットルの円錐管に移します。ティッシュペーパー片が3分間落ち着くのを待ちます。次に、上清を慎重に吸引し、サンプルごとに15〜20個の部分的に消化された組織片を個々の75平方センチメートルの組織培養フラスコにプレートします。

次に、9ミリリットルの培地を加えて、摂氏37度で2〜3日間のインキュベーションを行います。3日後に培地を交換し、位相差顕微鏡でxplantsを細胞増殖について調べます。細胞増殖が70%のコンフルエントに達したら、フラスコあたり1〜2ミリリットルのトリプシン溶液で細胞を解離し、フラスコを回転させて酵素溶液で均一にコーティングし、培養物を摂氏37度で3分間インキュベートします。

次に、1〜2ミリリットルの培地で反応を中和します。遠心分離により細胞を回収し、ペレットを継代培養用の培養培地に再懸濁し、1センチメートル二乗の細胞1センチメートルの2乗の播種密度で1倍にする。コードライニングおよびウォートンゼリー培養物からの細胞は、それぞれ59コロニーおよび80コロニーのコロニー形成効率値を示す。

しかし、臍帯-胎盤接合細胞のコロニー形成効率値は、骨髄間葉系幹細胞で観察された値と類似しており、臍帯-胎盤接合由来細胞は増殖能力と自己複製能力が高いことが示唆されています。フロー側では、これらの周産期組織から単離された単一細胞懸濁液のメトリック分析により、4つの組織源すべてからの特定の間葉系幹細胞マーカーに対する陽性細胞の割合は、標準的な骨髄由来間葉系細胞によって発現されるものと同様であることが示されています。しかし、蛍光強度比の中央値は、ウォートンゼリーおよび臍帯-胎盤接合部由来細胞が、胎児胎盤由来細胞の臍帯内層と非常に類似しているか、またはそれ以上であることを示しています。

興味深いことに、コロニー形成効率の値が異なるにもかかわらず、異なる周産期のソースからのすべての細胞は、定量的RTPCR分析によって同様のレベルの多能性マーカーを発現します。ただし、コード-プラセンタ接合部由来の間葉系間質細胞は、テストされたすべての多能性マーカーで最高レベルの発現を示しました。さらに、周産期の全ての供給源から単離された間葉系間質細胞は、脂肪形成性、軟骨形成性、および骨形成性の細胞型に容易に分化し、三系統分化が実証される。分化の可能性は間葉系間質細胞源によって異なりますが。

このテクニックを習得すると、効率的に実行すれば2〜3時間で完了できます。この手順を試みる際には、横方向のテクニックを練習し、組織源間の相互汚染を避けることが重要です。この技術は、研究者が周産期組織における幹細胞ニッチの性質を探求する道を開きました。