ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け
2017年4月3日
ここで、我々は、ヒト臍帯（UC）および臍帯に胎児胎盤サンプル単離のための（CL）、ウォートンゼリー（WJ）、臍帯胎盤接合（CPJ）、および胎児胎盤（FP）裏地の解剖のためのプロトコルを提示しますそして外植片培養技術を用いて、間葉系間質細胞（MSC）の特徴付け。
このプロトコルの全体的な目標は、4つの異なる周産期組織源、臍帯内層、ウォートンゼリー、臍帯-胎盤接合部、および胎児胎盤から間葉系間質細胞を分離することです。この方法は、特別な品質の間葉系幹細胞を非侵襲的に取得することにより、幹細胞生物学、代替医療の分野を前進させるのに役立ちます。この技術の主な利点は、異なる周産期組織源から多数の高品質の均質な細胞集団を生産的に得られることです。
この技術に由来する多能性臍帯間葉系間質細胞は、成体組織から単離された間葉系幹細胞よりも原始的であるため、さまざまな疾患や障害の治療に使用できます。この方法は、臍帯と胎盤のさまざまなセグメントと特定のニッチからの間葉系間質細胞の特性についての洞察を提供することができます。まず、バイオセーフティキャビネット内の氷上の150mmシャーレにサンプルを入れ、針とシリンジを使用して、氷冷PBSで組織を数回すすぎます。
すべての血栓が除去されたら、サンプルを注意深く調べて、さまざまな解剖学的領域を特定します。次に、鉗子を使用して臍帯の胎児端をつかみ、はさみを使用して臍帯と胎盤の接合部の上部を慎重に切開します。接合部の下に2回目の切開を行い、コードと胎盤の接合部を胎盤から分離します。
そして、分離したティッシュを個々のシャーレに分割します。次に、へその緒を縦方向に切断して、上皮を乱さずに血管と周囲のウォートンゼリーを完全に露出させます。メスを使用して、ウォートンゼリーを亜羊膜の血管と上皮間からこすり落とします。
次に、血管を取り外し、血管の下と周囲に残っている血管周囲ゼリーをウォートンのゼリー皿に移し、残りのコードライニング組織を独自の皿に入れます。すべての組織が解剖されたら、各皿のPBSを3〜5ミリリットルのトリプシンと交換し、ハサミを使用して各組織サンプルを1〜2ミリメートルの小片に切断し、摂氏37度と二酸化炭素5%で30分間インキュベーションします。位相差顕微鏡を使用して、組織からの細胞の放出を視覚化することにより、部分消化を観察します。
部分分解期間の終わりに、等量の培地でトリプシンを中和し、サンプルを個々の50ミリリットルの円錐管に移します。ティッシュペーパー片が3分間落ち着くのを待ちます。次に、上清を慎重に吸引し、サンプルごとに15〜20個の部分的に消化された組織片を個々の75平方センチメートルの組織培養フラスコにプレートします。
次に、9ミリリットルの培地を加えて、摂氏37度で2〜3日間のインキュベーションを行います。3日後に培地を交換し、位相差顕微鏡でxplantsを細胞増殖について調べます。細胞増殖が70%のコンフルエントに達したら、フラスコあたり1〜2ミリリットルのトリプシン溶液で細胞を解離し、フラスコを回転させて酵素溶液で均一にコーティングし、培養物を摂氏37度で3分間インキュベートします。
次に、1〜2ミリリットルの培地で反応を中和します。遠心分離により細胞を回収し、ペレットを継代培養用の培養培地に再懸濁し、1センチメートル二乗の細胞1センチメートルの2乗の播種密度で1倍にする。コードライニングおよびウォートンゼリー培養物からの細胞は、それぞれ59コロニーおよび80コロニーのコロニー形成効率値を示す。
しかし、臍帯-胎盤接合細胞のコロニー形成効率値は、骨髄間葉系幹細胞で観察された値と類似しており、臍帯-胎盤接合由来細胞は増殖能力と自己複製能力が高いことが示唆されています。フロー側では、これらの周産期組織から単離された単一細胞懸濁液のメトリック分析により、4つの組織源すべてからの特定の間葉系幹細胞マーカーに対する陽性細胞の割合は、標準的な骨髄由来間葉系細胞によって発現されるものと同様であることが示されています。しかし、蛍光強度比の中央値は、ウォートンゼリーおよび臍帯-胎盤接合部由来細胞が、胎児胎盤由来細胞の臍帯内層と非常に類似しているか、またはそれ以上であることを示しています。
興味深いことに、コロニー形成効率の値が異なるにもかかわらず、異なる周産期のソースからのすべての細胞は、定量的RTPCR分析によって同様のレベルの多能性マーカーを発現します。ただし、コード-プラセンタ接合部由来の間葉系間質細胞は、テストされたすべての多能性マーカーで最高レベルの発現を示しました。さらに、周産期の全ての供給源から単離された間葉系間質細胞は、脂肪形成性、軟骨形成性、および骨形成性の細胞型に容易に分化し、三系統分化が実証される。分化の可能性は間葉系間質細胞源によって異なりますが。
このテクニックを習得すると、効率的に実行すれば2〜3時間で完了できます。この手順を試みる際には、横方向のテクニックを練習し、組織源間の相互汚染を避けることが重要です。この技術は、研究者が周産期組織における幹細胞ニッチの性質を探求する道を開きました。
概要
本プロトコルでは、外植片培養法（explant culture technique）を用いて、ヒト臍帯および胎児プラセンタを解剖し、間葉系ストローマ細胞（MSC）を単離する方法について概説します。本手法により、異なる周産期組織源からMSCの特性評価が可能となり、幹細胞生物学の進展に寄与します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 幹細胞生物学
- 再生医療
- 細胞培養技術
背景
- 間葉系幹細胞（MSC）は、その多能性により治療への応用の可能性があります。
- 周産期組織は、原始的なMSCの豊富な供給源となります。
- 本プロトコルは、臍帯および胎盤から高品質なMSCの回収率を向上させることを目的としています。
- 異なる組織源に由来するMSCの特性を理解することで、臨床応用に役立てることができます。
研究目的
- 臍帯 linings、ウォートンゼリー、臍帯-胎盤接合部、および胎児胎盤からMSCを単離すること。
- これらの組織由来のMSCの品質および特性を評価すること。
- 研究および治療目的でMSCを取得するための非侵襲的な手法を提供すること。
使用した手法
- 臍帯および胎盤をそれぞれ異なる解剖学的領域に解剖すること。
- 組織サンプルの部分消化のためのトリプシン使用。
- 解剖した組織を特定の培地条件下で培養すること。
- 顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いた細胞増殖の評価と特性解析。
主要な結果
- Wharton's jellyおよび臍帯・胎盤接合部細胞において、高いコロニー形成効率が観察された。
- すべてのMSCは同様の多能性マーカーを発現したが、発現レベルには差が見られた。
- MSCは、複数の系統に分化する能力を示した。
- 本手法は、2〜3時間で効率的に完了させることができる。
結論
- 本プロトコールは、周産期組織から高品質なMSCを単離するための信頼性の高い手法を提供します。
- 異なるソースに由来するMSCの特性を理解することで、その治療への応用を強化することができます。
- 周産期組織における幹細胞ニッチのさらなる探索が推奨されます。
よくある質問
業界における重要性
本プロトコルでは、異なる周産期組織源から間葉系ストローマ細胞（MSCs）を単離することが可能であり、骨髄由来MSCsに代わる非侵襲的で倫理的に好ましい選択肢を提供します。臍帯・胎盤接合部（CPJ）、ウォートンゼリー（WJ）、臍帯内膜（CL）、胎児胎盤（FP）などの解剖学的領域を比較することで、本手法は再生医療パイプラインにおけるターゲット検証およびメカニズムのリスク低減を支援します。CPJ由来MSCsで観察される高いコロニー形成能と多能性マーカーの発現は、細胞治療への適用に対する予測的な信頼性を提供し、リード化合物の同定やポートフォリオの選別に寄与します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
早期発見とターゲットバリデーション
- 科学的価値： 増殖能および自己複製能が異なる個別の周産期ニッチからMSCを単離することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 脂肪分化、軟骨分化、および骨分化系における多能性の機能的検証を通じて、生物学的リスクの低減を支援する。
- 科学的価値： コロニー形成効率と多能性マーカーの発現において優れたMSC源としてCPJを同定することで、ターゲットへの信頼性を高める。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 実用的価値： 定義された表面マーカープロファイル（CD29, CD44, CD73, CD90, CD105）を持つ均一な接着性MSC集団を得ることで、後続のワークフローに向けた検証済み生物学的システムを調製できる。
- 科学的価値： 一貫した外植片培養技術と、コロニー形成効率やフローサイトメトリー指標などの定量的出力により、アッセイの標準化と再現性の課題を解決する。
- 実用的価値： プロトコルが2〜3時間で完了するため、スクリーニングへの対応力と拡張性が高く、前臨床スクリーニングカスケードにおける信頼性の高い化合物評価が可能になる。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 三系統への分化能という、前臨床バリデーションにおける重要な機能的リードアウトを実証することで、疾患との関連性およびトランスレーショナルなバイオマーカーの一致について論じています。
- 運用的価値： 骨髄由来MSCと同等の接着性、線維芽細胞様形態、および表面マーカー発現を維持するMSCを提供することで、探索から前臨床バリデーションまでの連続性を記述しています。
- 科学的価値： CPJ-MSCが他の由来細胞よりも効率的に分化することを示すことで、予測的なリスク低減価値に焦点を当て、リスク調整後の進展決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期探索からリード化合物同定、そして前臨床研究に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれ、解剖学的に局在を特定したMSC分離を通じて、仮説検証、パスウェイの解明、および生物学的なリスク低減を支援します。
- 探索生物学： 臍帯 linings、ワートンのゼリー、臍帯・胎盤接合部、および胎児胎盤におけるMSCの特性比較を可能にすることで、本手法がどのように仮説検証およびパスウェイの解明を支援するかを説明します。
- スクリーニング： アッセイの準備状況、再現性、およびコロニー形成効率（CLで59、WJで80、CPJはBMと同様）やフローサイトメトリーに基づくマーカー発現解析などの定量的な出力を記述します。
- 分析： コロニー形成効率、蛍光強度比、および多能性マーカーの定量的なRTPCRなどの測定について強調し、これにより研究チームが条件を比較し、予測値を評価することを可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： MSCの脂肪分化、軟骨分化、および骨分化を実証することで、本手法を前臨床段階の連続性と結びつけ、バイオマーカーの整合性と機能的検証を支援します。
- エンタープライズでの再利用： 本手法を単発的な技術ではなく、再利用可能な能力として位置づけ、周産期組織源における標準化を実現し、再生医療プログラムにおける一貫したMSC供給を可能にします。
運用および企業への影響
- 科学的価値：解剖学的に分化させたMSCの単離および機能特性評価を通じて、予測信頼度の向上、ターゲットの検証、およびメカニズム的な曖昧さの解消を実現する。
- 運用的価値：外植片培養、規定の消化パラメータ、および一貫した播種密度（1×10⁴ cells/cm²）により、標準化、再現性、およびスケーラビリティを確保する。
- 戦略的価値：探索の早期段階でCPJのような高能力なMSCソースを特定することで、より適切なgo/no-go判断、資本効率の向上、および後期の生物学的リスクの低減を可能にする。
- ポートフォリオへの影響：周産期MSCソース間における増殖能、自己複製能、および分化効率の差に基づいた、リスク調整後の優先順位付けおよび推進決定を行う。
実施上の考慮事項
- 組織解剖、無菌的な細胞培養、およびマーカー解析のためのフローサイトメトリーに関する専門的な科学的知識が必要です。
- 器具および分析インフラの要件には、位相差顕微鏡、遠心分離機、インキュベーター（37°C, 5% CO₂）、およびCDマーカーと蛍光強度の評価に使用するフローサイトメーターが含まれます。
- チーム間での標準化要件として、ラボ間での再現性を確保するために、一貫した組織解剖プロトコル、トリプシンの中和、および播種密度の統一が必要です。
- モデルシステム間の適応に関する検討事項として、外植片の増殖までの期間が異なるため（CPJは3–4日、CL/WJは7–10日、FPは11–14日）、組織源に基づいて外植片のサイズと消化時間を調整することが含まれます。
- 使用材料に伴う実用上の制限には、解剖中の組織源間の相互汚染の回避、および解剖学的部位によるコロニー形成能や増殖タイミングの変動への対応が含まれます。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Human Umbilical Cord (UC), Cord-Placenta Junction (CPJ), and Fetal Placenta (FP) Processing and Cell Isolation
6:21
Conclusion
4:29
Results: Colony-Forming Efficiency and Mesenchmyal Stromal Cell (MSC) Marker Expression of Perinatal Tissue-Isolated Cells
