多数の試料を用いた実験における土壌微生物の同定のための脂質抽出と分析法

このビデオの目的は、微生物の細胞膜から脂質を抽出するための労力と精度のバランスを取りながらスループットを向上させる方法を説明することです。これにより、総脂質と指標脂質の相対存在量の両方を特性評価して土壌微生物群集の構造を決定し、多くのサンプルで研究を行うことができます。現場では、土壌の不均一性を考慮して、サイトを表す方法で土壌サンプルを収集する必要があります。サンプリング時の微生物群集を保護するために、サンプルは氷上でフィールドから輸送する必要があります。

研究室に戻ったら、根や石を取り除き、粗いふるい分けで塊を砕きます。これは、サンプルの均質化にも役立ちます。サブサンプルを適切な容器に入れて凍結乾燥の準備をし、できるだけ早く凍結乾燥してください。

土壌を凍結乾燥させたら、抽出するまで乾燥剤を入れた密閉容器に保管します。冷凍庫の乾燥土壌を80度で保管し、抽出の準備を C.As、凍結乾燥土壌を保管から取り出して粉砕するのが最善です。粉砕方法には、ボールミル、ボールメーター、または乳鉢と乳棒が含まれます。

土壌を粉砕した後、再び土壌サンプルを完全に均質化し、冷凍庫に保管します。すべての実験器具は、細心の注意を払って清潔でなければなりません。残留洗剤、グリース、または汚れは、最終的なGCクロマトグラムにピークとして現れるため、結果に影響を与える可能性があります。

抽出は30ミリリットルのテフロン遠心分離管で行われ、溶媒ですすぐ必要があります。2〜3ミリリットルのヘキサンをチューブに加え、数秒間渦巻きます。ヘキサンを別のチューブとボルテックスにデカントします。

2〜3ミリリットルのヘキサンを使用して、6本のチューブを連続的にすすぐことができます。ヘキサンすすぎたチューブを逆さまにしてヒュームフードに保管し、使用済みのヘキサンは適切な廃棄物容器に廃棄してください。ガラス器具は、使用直前に消音するか、溶剤ですすぐことができます。

消音は、高温で残留物を酸化することにより、ガラス器具を清潔に保ちます。ガラス器具を2〜3層のアルミホイルで包み、マッフル炉に入れます。450°Cに設定し、炉が設定値に達したら、最低4時間半焼きます。

炉から取り出す前に、少なくとも1時間冷やしてください。ヘキサン洗浄したテフロンチューブをラベル付けし、秤量します。テフロン遠心チューブに土を加え、土の質量を再計量します。

バッチごとに常に少なくとも2つのブランクを作成し、抽出が正しく機能したことを確認したい場合は、チェック基準、できれば以前に抽出された土壌を含めます。脂質抽出。リン酸緩衝液、クロロホルム、メタノール用の5〜10ミリリットルの再ピペットを3本調製します。

クロロホルムは、表面張力が低い非常に密度の高い液体です。ディスペンスする量が正確で一貫しているように注意してください。ボトルの半分以上を液体で満たしてください。

ドラフト内で、テフロンチューブ内の土壌に試薬をリン酸緩衝液、クロロホルム、メタノールの順で加えます。これは、サンプル材料からの脂質の初めての物理的抽出です。試薬溶液のレシピは、書面によるプロトコルに含まれています。

溶媒の割合と添加順序は、有機相と水相を適切に分離するために重要です。クロロホルムを添加する前に、バッファー添加後、土壌が湿る時間を確保してください。都合が良ければ、抽出剤を組み合わせて、2回目以降の抽出用に1つのアリコートとして追加することができます。

テフロンチューブをしっかりとキャップし、光から保護するために覆います。それらをシェーカーに水平に置き、しっかりと固定されていることを確認します。速度設定を「高」にすると、1時間ほど振ってください。

チューブを揺らしながら、以下のようにサンプルごとに長めのガラス管を2本用意します。チューブにラベルを付け、土壌に添加したのと同じ量のクロロホルムと等量のリン酸緩衝液を追加します。25°Cでシェーカーからテフロンチューブを取り外した後、チューブを2、500RPMで10分間遠心分離します。

次に、ライトをオフにしたドラフト内で、テフロン管からの上清を長い管の1つにデカントします。相分離はガラス管に見えるはずです。下層には、主にクロロホルムなどの有機溶媒と脂質が含まれています。

この抽出が繰り返されます。前に準備した2番目のチューブに上清を注ぎます。これで、土壌から脂質を2回物理的に抽出しました。

ほとんどの土壌では、これで十分です。テフロンで裏打ちされたキャップですべての長いクラスのチューブをしっかりとキャップし、10回反転させて混合します。一晩で重力によってフェーズを分離します。

サンプルを一晩放置して、2つの相を完全に分離します。これを行うには、サンプルを暗いキャビネットに保管するか、室温でアルミホイルで覆います。週末に抽出物を分離させても大丈夫です。

2日目、脂質の分離。2日目には、真空蒸着システムで溶媒を除去して水層を吸引し、脂質を濃縮します。サンプルは、水浴または砂浴に入れ、穏やかな窒素の流れを適用して乾燥させることもできます。

これで、チューブ内の液体が十分に分離され、ほぼ透明になっているはずです。そうでない場合は、または2つの層間の界面が特に厚い場合は、分離を別の日続けてください。ボンネットに真空吸引器をセットします。

これは、リーフタイゴンチューブと牧草地ピペットを備えた真空ポンプに接続されたサイドアームフラスコです。ポンプが作動している状態で、ピペットを使用して水相をフラスコに引き込みます。最上層とインターフェースを吸引します。

これは、下り方の約2/3になります。これを2〜3セットのガラス管に行います。最上層には、土壌の粒子がいくつか含まれている場合があります。

可能であれば、これらを削除します。2番目およびまたは3番目のチューブセットからの抽出物を、慎重にデカンテーションすることにより、最初の2セットの抽出物と組み合わせます。固形物を注ぐのを避け、回転させてチューブの壁をすすぎてみてください。

各サンプルに清潔なピペットを使用し、残りのサンプルに対してこのプロセスを繰り返します。クロロホルム抽出物を混ぜ合わせて数分間放置したら、液体の表面を検査します。多くの場合、残留水の薄い層が形成されます。

これが存在する場合は、先に進む前に吸引してください。残留水は脂肪酸の二重結合を攻撃する可能性がありますが、サンプルが乾燥するにつれて、ごく少量が溶媒と共蒸発するはずです。真空蒸着装置を使用してすべてのサンプルを乾燥させます。

チューブをしっかりとキャップし、80°Cの冷凍庫に保管します。まず、ウォーターバスをオンにします。水位を確認し、浴槽1を95°C、浴槽2を80°Cに設定し、リピペットを使用して、乾燥脂質に鹸化試薬試薬試薬1を1ミリリットル加えます。

しっかりとキャップをし、短時間渦巻きにして、ラックに置きます。このステップで降りたら、チューブのラックを95°Cのウォーターバスに入れ、5分間待ちます。チューブのラックをバスから取り外し、チューブに漏れがないか確認します。

これは、泡のようにチューブ内に上昇する気泡によって示されます。漏れているチューブのキャップを締め直すか、元に戻します。ウォーターバスでチューブをさらに10分間加熱し続けます。

ウォーターバスの温度設定を80°Cに下げ、さらに15分間インキュベーションを続けます。チューブを取り外し、ラックを水道水の鍋に入れて冷まします。氷水は使用しないでください。

サンプルが冷えたら、各サンプルに2ミリリットルのメチル化試薬Reagent 2を加えます。再び、しっかりとキャップをし、5〜10秒間渦巻きます。粒状塩は、溶液中の沈殿物として見えるようになることがありますが、これは試薬が過剰であるために発生することがあります。

ラックを80°Cのウォーターバスに入れ、10分間インキュベートします。ウォーターバスからチューブのラックを取り外し、水道水の鍋に入れて冷却します。ラックを攪拌して冷却プロセスを加速します。

リピペットを使用して、1.25ミリリットルのヘキサンとメチルターシャリーブチルエーテル(試薬3)を各チューブに1つ加えて、相を抽出します。キャップをしっかりと密封し、チューブをシェーカーに10分間置きます。振とうした後、チューブのラックを10分間放置して、フェーズを分離します。

最上層となった有機相を、牧草地のピペットを使用して短いガラス管に移します。ほとんどの液体を回収するのが最善です。非常に少量の水相は抽出を損なうことはありません。

試薬3を添加し、振とうし、相を分離させ、上相を移すことにより、水相抽出を繰り返します。ボトムフェーズの状態に応じて、これをもう1回繰り返して合計3回の転送を行うことができます。水酸化ナトリウムの希薄溶液であるベースウォッシュ試薬4の3ミリリットルを、短いチューブ内の抽出物に加えます。

試験管をしっかりとキャップし、20 〜 30 秒間渦巻き、次に 2 、 000 RPM で 3 分間遠心分離します。遠心分離後、清潔な牧草地のピペットを使用して上部の有機相を吸引し、4ミリリットルの琥珀色のバイアルに移します。水相を吸引しないように十分注意してください。

次のステップは、真空蒸発装置で溶媒を蒸発させて乾燥させることです。4日目、GC分析のための抽出物の準備。ピペッターを使用して、乾燥相を含む4ミリリットルのバイアルのそれぞれに100マイクロリットルの試薬3を加えます。

サンプルをボルテックスし、10分間放置します。2つ目のピペッターを使用して、懸濁したFAMEを慎重にGCバイアルに移します。溶媒の別のアリコートを4ミリリットルのバイアルに加え、短時間ボルテックスします。

バイアルを転がして、バイアルの壁に残っているFAMEが溶解していることを確認します。2 番目のピペッターを再度使用して、溶媒を GC バイアルに移します。バイアルに溶媒の3番目のアリコートを追加し、ボルテックスし、GCバイアルに移すことにより、転写を完了します。

GCバイアルにキャップをして冷凍庫に保管します。密封されたGCバイアルは、分析前に冷凍庫に保管してください。GC分析。

このシステムを使用するには、特定のGCカラムを使用して分析を実行する必要があります。ガスクロマトグラフには、ID4mmのガラス製インレットライナーと非アクティブ化されたグラスウールプラグが取り付けられたスプリットスプリットレスインレットが装備されています。入口は250°Cに設定され、定圧モードで作動します。

キャリアガスは水素です。検出器の支持ガスとして窒素と空気が必要です。Agilent Ultra 2カラムを使用しています。

カラムの長さは25m、内径は2mm、固定相の膜厚は33μmです。このカラムの固定相は5%フェニル、95%メチルポリシロキサンで、DB-5タイプのカラムとしても知られています。脂質抽出物を分析するために、2マイクロリットルのアリコートを100:1の分割比で注入し、オーブンの温度を170°Cで注入 C.Post、オーブンを毎分5度で300°Cまで増加させ、その後12分間保持するようにプログラムされます。

MIDI規格の一連の注入が行われ、その結果を使用してMIDIマニュアルの指示に従って調整が行われます。この方法でキャリブレーションを行うと、システムは時折微調整が必要になる場合がありますが、一般的にはこれらのパラメータを使用して良好な結果が得られるはずです。MIDIシステムは、各サンプルに対してレポートを生成し、実現されたピークごとに1本の線を持つテーブルが含まれます。

このソフトウェアは、ピーク保持時間、ピーク面積、ピーク同定、ECLまたは推定チェーン長、ピーク同定に使用されるパラメータ、およびレスポンスファクター(保持時間に関する変動と検出器応答を正規化するために使用されるパラメータ)を報告します。ECLは、一連のストレートチェーンのFAMEのうち、各未知のFAMEがどこで溶出するかを表します。したがって、たとえば、未知化合物の保持時間が 12 と 13 の炭素鎖の中間で溶出する場合、ECL は 12.5 炭素鎖として報告されます。

ソフトウェアは、各ピークのECLをデータベース内のFAMEのECLと比較し、一致が発生した場合は対応する名前を未知に割り当てます。データベース内の 2 つの FAME の ECL が非常に近い場合、ソフトウェアは両方の名前を最も近い名前が最初にリストして報告します。レポートのデータ テーブルは、スプレッドシートまたはデータベースに照合できます。

レスポンスファクターを調整した後、ピーク面積を外部標準または内部標準のピーク面積と比較して、抽出物の濃度を算出できます。抽出された土壌の質量で割ることにより、データは土壌1グラム当たりのFAMEの質量として表され、また、各FAMEの分子量を使用して、土壌1グラム当たりのナノモルとして表される。その後、バイオマーカーFAMEを合計して微生物ギルドのバイオマスを生成でき、これらのギルドをさらに分析できます。

たとえば、ここでは、肥沃な大草原よりもFAMEバイオマスが多い未施肥の大草原が見られます。どちらも近くのトウモロコシ畑よりもバイオマスが多いです。また、FAMEは、真菌や細菌などの特定の官能基に関連付けられています。

これらの関連付けは生態系固有のものであるため、過度に一般化しないことが重要です。このタイプの分析は、特定のグループが特定の環境でより豊富に存在するかどうかを示します。ここでは、菌類はトウモロコシ畑よりも未受精の大草原に豊富にあります。

そして最後に、全体的な微生物群集の構成を見る別の方法は、非計量多次元スケーリング、NMDS、または主成分分析、PCAなどの序列法を使用して、すべてのFAMEの相対的な存在量を一度に調べることによって比較することです。叙階では、より類似した微生物群集が互いに接近します。したがって、この例のデータから、トウモロコシと未受精の大草原は非常に離れていますが、一部の受精した大草原のサンプルには、トウモロコシの微生物群集に似た微生物群集があり、他のサンプルは未受精の大草原に似ています。

微生物群集は、環境内でも非常に変動することが多いため、常にきれいに分離するとは限りません。このビデオを見れば、微生物の細胞膜から脂質バイオマーカーが土壌から抽出されるプロセスについてよく理解できるはずです。リン脂質脂肪酸の抽出は、独自の微生物バイオマーカーの同定を通じて、微生物ギルドと総微生物バイオマスを評価するための効果的、迅速、かつ安価な方法です。