多数の試料を用いた実験における土壌微生物の同定のための脂質抽出と分析法

このビデオの目的は、土壌微生物コミュニティ構造の決定や多検体研究において、全脂質の特性評価および指標脂質の相対存在量の解析に用いるための、微生物細胞膜からの脂質抽出法を説明することです。本手法は、手間と精度のバランスを維持しつつ、スループットを向上させます。フィールドにおいては、土壌の不均一性を考慮し、サイトを代表するように土壌サンプルを採取する必要があります。サンプリング時の微生物コミュニティを維持するため、サンプルは氷上で現場から運搬してください。

研究室に戻ったら、根や石を取り除き、粗い篩（ふるい）にかけて土塊を砕きます。これにより、サンプルの均一化も行われます。サブサンプルを適切な容器に入れ、可能な限り速やかに凍結乾燥の準備をしてください。

土壌の凍結乾燥後、抽出まで乾燥剤と共に密閉容器に入れて保存します。凍結乾燥土壌は-80°Cで保存することが最適です。抽出の準備として、保存していた凍結乾燥土壌を取り出して粉砕します。粉砕方法には、ボールミル、ボールメーター、または乳鉢と乳棒が挙げられます。

土壌を粉砕した後、再度、土壌サンプルを十分に均質化し、フリーザーで保存します。すべての実験器具は厳格に洗浄されていなければなりません。洗剤、グリース、または汚れがわずかでも残っていると、最終的なGCクロマトグラムにピークとして現れ、結果に影響を及ぼす可能性があります。

抽出は、溶媒で洗浄した30 milliliterのテフロン製遠心チューブを用いて行います。チューブに2〜3 milliliterのヘキサンを加え、数秒間ボルテックスします。ヘキサンを別のチューブに移し、さらにボルテックスします。

2～3 mLのヘキサンを使用して、6本のチューブを順次洗浄できます。ヘキサンで洗浄したチューブは、ドラフトチャンバー内で逆さまにして保管し、使用済みのヘキサンは適切な廃棄容器に廃棄してください。ガラス器具は、使用直前に洗浄または溶剤で濯いでください。

マッフル炉による加熱処理を行うことで、高温での酸化によりガラス器具の残留物が除去され、清潔な状態になります。ガラス器具をアルミホイルで2〜3層に包み、マッフル炉に入れます。温度を450 °Cに設定し、炉が設定温度に達した後、最低4時間30分焼成します。

炉から取り出す前に、少なくとも1時間の冷却時間を設けてください。ヘキサンで洗浄したテフロンチューブにラベルを貼り、重量を量ります。テフロン遠心チューブに土壌を加え、再度重量を量って土壌量を決定します。

抽出が正しく行われたかを確認したい場合は、常に1バッチあたり少なくとも2つのブランクを設けてください。また、チェック標準（できれば以前に抽出を行ったことのある土壌）を含めてください。脂質抽出。リン酸緩衝液、クロロホルム、メタノールのための5〜10 mLのリピペットを3本準備します。

クロロホルムは表面張力が低く、非常に密度の高い液体です。分注量が正確かつ一定になるよう注意してください。ボトルには常に半分以上の液体が入った状態で保持してください。

ドラフト内で、テフロンチューブに入れた土壌に、リン酸緩衝液、クロロホルム、メタノールの順で試薬を添加します。これが、試料材料から脂質を物理的に抽出する最初の操作となります。試薬溶液の調製方法は、書面プロトコルに記載されています。

有機相と水相を適切に分離させるためには、溶媒の比率と添加順序が重要です。クロロホルムを添加する前に、緩衝液の添加後に土壌を十分に濡らす時間を設けてください。都合が良ければ、2回目以降の抽出では、抽出剤を混合して単一のアリコートとして添加することができます。

テフロンチューブのキャップをしっかりと締め、遮光して保存します。チューブを水平に配置し、しっかりと固定されたことを確認してシェーカーにセットします。速度設定を「high」にし、1時間振盪させます。

チューブを振盪させている間に、各サンプル用に2本の長いガラスチューブを次のように準備します。チューブにラベルを貼り、土壌に添加したのと同量のクロロホルムと、それと同量のリン酸緩衝液を加えます。25 °Cのシェーカーからテフロンチューブを取り出した後、2,500 RPMで10分間遠心分離します。

次に、消灯したドラフトチャンバー内で、テフロンチューブから上清を長いチューブのいずれかに分注します。ガラスチューブ内で相分離が確認できるはずです。下層には、主にクロロホルムである有機溶媒と脂質が含まれています。

この抽出を繰り返します。上澄み液を、先に準備しておいた2本目のチューブに注ぎます。これで、土壌から脂質の物理的抽出を2回行ったことになります。

ほとんどの土壌において、これで十分です。すべてのロングクラスチューブをテフロンライナー付きキャップでしっかりと密閉し、10回反転させて混合します。一晩静置し、重力によって相を分離させます。

2つの相を完全に分離させるため、サンプルをそのまま一晩静置します。その際、サンプルを暗いキャビネットに入れるか、アルミニウム箔で覆い、室温で保存してください。抽出物の分離に週末を費やしても問題ありません。

2日目、脂質の単離を行います。2日目には、水層を吸引し、真空蒸発システムで溶媒を除去して脂質を濃縮します。また、サンプルをウォーターバスまたはサンドバスに置き、緩やかな窒素気流を当てることで乾燥させることも可能です。

チューブ内の液体が十分に分離し、大部分が透明になっているはずです。分離が不十分な場合、または2層間の界面が特に厚い場合は、さらに1日置いて分離を継続させてください。フード内で真空吸引装置を準備します。

これは、Tygonチューブとパステールピペットを用いて真空ポンプに接続されたサイドアームフラスコです。ポンプを作動させ、ピペットを使用して水相をフラスコ内に吸引します。最上層と界面を吸引してください。

これはおおよそ下から2/3の位置になります。これを2〜3セットのガラス管に対して行います。最上層には、少量の土壌粒子が含まれている場合があります。

可能であれば、これらを除去してください。2番目または3番目のチューブセットからの抽出液を、慎重にデカンテーションして最初の2つのチューブの抽出液と合わせてください。注ぐ際に固形物が混入しないようにし、チューブを回転させて壁面を洗浄してください。

各サンプルに清潔なピペットを使用し、残りのサンプルに対してもこの操作を繰り返します。クロロホルム抽出液を混合し、数分間静置した後、液面を確認してください。多くの場合、残留水の薄い層が形成されます。

もし残存している場合は、次へ進む前に吸引してください。残留水は脂肪酸の二重結合を攻撃する可能性がありますが、サンプルを乾燥させる際、ごく少量であれば溶媒と共に共蒸発します。真空蒸発装置を用いて、すべてのサンプルを乾固させてください。

チューブの蓋をしっかりと閉め、-80°Cのフリーザーで保存します。3日目は、けん化およびメチル化を行います。まず、ウォーターバスの電源を入れます。水位を確認し、バス1を95°Cに、バス2を80°Cに設定します。リピペットを使用して、乾燥させた脂質にけん化試薬（Reagent 1）を1 mL加えます。

キャップをしっかりと締め、短時間ボルテックスした後、ラックに立てます。この手順が完了したら、チューブのラックを95 °Cのウォーターバスに入れ、5分間待ちます。ラックをウォーターバスから取り出し、チューブに漏れがないか確認します。

これは、チューブ内で泡がフォームのように上昇することで確認できます。漏れているチューブのキャップを締め直すか、交換してください。その後、ウォーターバスでさらに10分間チューブを加熱し続けます。

ウォーターバスの温度設定を80°Cに下げ、さらに15分間インキュベーションを続けます。チューブを取り出し、ラックを水道水の入ったパンに入れて冷却します。氷水は使用しないでください。

サンプルが冷却されたら、各サンプルにメチル化試薬（Reagent 2）を2 mL加えます。再びキャップをしっかりと締め、5〜10秒間ボルテックスします。試薬が過剰であるため、溶液中に沈殿物として粒状の塩が見える場合があります。

ラックを80°Cのウォーターバスに入れ、10分間インキュベートします。チューブが入ったラックをウォーターバスから取り出し、冷却のために水道水を入れたパンに入れます。ラックを振って冷却を早めます。

リピペットを使用して、各チューブにヘキサンおよびメチルtert-ブチルエーテル（試薬3）を1.25 millilitersずつ加え、相抽出を行います。キャップをしっかりと密閉し、シェーカーで10分間振盪させます。振盪後、チューブラックをそのまま10分間静置し、相を分離させます。

パステールピペットを用いて、上層となった有機相を短いガラス管に移します。液体の大部分を回収することが望ましいです。少量の水層が混入しても、抽出への影響はありません。

試薬3を加え、振盪し、相分離させ、上層を回収して水相抽出を繰り返します。下層の状態に応じて、この操作をもう一度繰り返し、合計3回回収することができます。ショートチューブ内の抽出液に、水酸化ナトリウム希釈溶液であるベース洗浄液（試薬4）を3 milliliter加えます。

試験管のキャップをしっかりと締め、20〜30秒間ボルテックスした後、2,000 RPMで3分間遠心分離します。遠心分離後、清潔なパスツールピペットを用いて上層の有機相を吸引し、4 mLの遮光バイアルに移します。この際、水相を吸引しないよう十分に注意してください。

次のステップは、真空蒸発装置を用いて溶媒を乾固させることです。4日目は、GC分析に向けて抽出液の調製を行います。ピペッターを使用して、乾燥相が入った各4 mLバイアルに試薬3を100 µLずつ加えます。

サンプルをボルテックスした後、10分間静置します。2台目のピペッターを使用して、懸濁したFAMEsを慎重にGCバイアルに移します。4 mLバイアルに溶媒をさらに分注し、短時間ボルテックスします。

バイアルを転がし、壁面に残ったFAMEsを完全に溶解させます。2本目のピペッターを再度使用して、溶媒をGCバイアルに移します。さらに3回目の溶媒をバイアルに加え、ボルテックス処理をした後、GCバイアルに移して転送を完了させます。

GCバイアルにキャップをし、フリーザーで保存します。分析前に、密封したGCバイアルをフリーザーで保存してください。GC分析。

本システムを使用するには、特定のGCカラムを用いて分析を行う必要があります。ガスクロマトグラフには、不活性化ガラスウールのプラグを備えた内径4 mmのガラスインレットライナーが装着されたスプリット/スプリットレスインレットが備わっています。インレットは250 °Cに設定し、定圧モードで動作させます。

キャリアガスには水素を使用します。検出器のサポートガスとして窒素と空気が必要です。カラムはAgilent Ultra 2を使用します。

カラムは長さ25 m、内径2 mm、固定相膜厚33 µmである。このカラムの固定相は5%フェニル-95%メチルポリシロキサンであり、DB-5タイプカラムとしても知られている。脂質抽出物を分析するため、オーブン温度170 °Cにおいて、2 µLのアリコートを100:1の分割比で注入する。注入後、オーブン温度を毎分5 °Cで300 °Cまで上昇させ、その後12分間保持するようにプログラムする。

MIDI標準に従って一連の注入を行い、その結果を用いてMIDIマニュアルの指示通りに調整を行います。このように校正されたシステムは、時折微調整が必要になる場合がありますが、一般的にこれらのパラメータを使用することで良好な結果を得ることができます。MIDIシステムはサンプルごとにレポートを作成し、そこに検出されたピークごとに1行で構成される表が含まれます。

ソフトウェアは、ピーク保持時間、ピーク面積、ピーク同定に加え、ピーク同定に使用されるパラメータであるECL（推定鎖長）および保持時間に伴う変動や検出器の応答を正規化するために使用されるパラメータである応答係数を報告します。ECLは、一連の直鎖状FAMEsの中で、各未知のFAMEがどこで溶出するかを示します。例えば、未知物質の保持時間が炭素数12と13の鎖の中間に位置して溶出した場合、ECLは12.5炭素鎖として報告されます。

ソフトウェアは、各ピークのECLをデータベース内のFAMEsのECLと比較し、一致した場合には、未知試料に corresponding name を割り当てます。データベース内の2つのFAMEsのECLが非常に近い場合は、ソフトウェアは両方の名称を報告し、より近い方を先に記載します。レポートのデータテーブルは、スプレッドシートやデータベースにまとめて管理することができます。

応答係数で補正した後、ピーク面積を外部標準物質または内部標準物質のピーク面積と比較することで、抽出物の濃度を算出できます。抽出した土壌の質量で除することで、データは土壌1gあたりのFAME質量として、あるいは各FAMEの分子量を用いることで、土壌1gあたりのナノモルとして表すことができます。その後、バイオマーカーFAMEを合算することで微生物ギルドのバイオマスを求め、これらのギルドをさらに分析することが可能です。

例えば、ここでは、施肥されていない草原が施肥された草原よりも多くのFAMEバイオマスを有していることがわかります。どちらの草原も、近隣のトウモロコシ畑よりもバイオマス量が多いです。また、FAMEは真菌や細菌などの特定の機能群に関連しています。

これらの関連性はエコシステム特有のものであるため、過度に一般化しないことが重要です。この種の解析により、特定のグループが特定の環境においてより豊富に存在するかどうかがわかります。ここでは、未施肥の草原において、トウモロコシ畑よりも菌類がより豊富に存在しています。

最後に、微生物コミュニティ全体の組成を把握するもう一つの方法は、非計量的多次元尺度構成法（NMDS）や主成分分析（PCA）などの順序付け法を用いて、すべてのFAMEの相対存在量を一度に比較することです。順序付けにおいて、より類似した微生物コミュニティは互いに近い位置に配置されます。したがって、本例のデータでは、トウモロコシ栽培地と非施肥草原は非常に離れていますが、一部の施肥草原のサンプルでは、トウモロコシ栽培地に類似した微生物コミュニティを持つものと、非施肥草原に類似したものがあります。

微生物コミュニティは、同一環境内であっても変動が激しいことが多く、必ずしも明確に分類できるとは限りません。このビデオを視聴することで、微生物の細胞膜から脂質バイオマーカーを土壌から抽出するプロセスを十分に理解できるはずです。ホスホリピド脂肪酸の抽出は、独自の微生物バイオマーカーを同定することにより、微生物ギルドおよび全微生物バイオマスを評価するための効果的かつ迅速で安価な手法です。