Name: 多数の試料を用いた実験における土壌微生物の同定のための脂質抽出と分析法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 39 s
Description: 学ぶ土壌微生物の脂質抽出法。凍結乾燥と有機溶媒を用いて多数試料のスループットと精度を両立させ、微生物叢構造を解析する効率的な手法です。

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この研究はDOE五大湖バイオエネルギー研究センター（DOE BER事務局DE-FC02-07ER64494）とDOE OBP事務所（DE-AC05-76RL01830）によって資金提供された。著者はAnders Gurdaの患者とビデオ撮影と編集に巧みな貢献をしたことを認めたいと思っています。

注記：この手順では常に適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。潜在的なサンプル汚染を避けるため、素手でガラス製品に触れないでください。クロロホルムの取り扱いが必要な手順を実行する場合は、適切な手袋を着用してください。 1.準備（約40サンプルの2日間） <ol><li>滅菌した袋に土を集め、氷を入れた冷蔵庫で野外から輸送してください。新鮮な土壌をふるい分けてすぐに凍結乾燥することができない場合、分析を開始する準備が整うまでサンプルを-80℃の冷凍庫に保存します。 </li><li>ホモジナイズして土壌を準備する。粗いふるい（ 例えば 2mm）で根や石を取り除き、塊を砕く。 </li><li>凍結乾燥機の取扱説明書に従ってサブサンプルを適切な容器に入れ、できるだけ早く凍結乾燥させて凍結乾燥を準備する。土壌が凍結乾燥したら、抽出するまで乾燥剤を入れた密閉容器に保存する。それは最高です凍結乾燥土壌を最低-20℃、好ましくは-80℃で磨砕する。 </li><li>抽出の準備として、凍結乾燥した土壌を貯蔵から取り除き、粉状の粘稠度に粉砕する。粉砕の方法には、ボールミル、ボールビーター、および乳鉢および乳棒が含まれる。土壌を粉砕した後、冷凍庫に保存する（1.3参照）。 注：抽出に使用されるサンプルの量は、その有機物含量に依存する。一般的なガイドラインは、重量で炭素12〜18％、炭素1〜3％が土壌3〜5 gの土壌0.5〜1 gを使用することです。 </li><li>ヘキサンを用いて30 mLの遠心チューブをあらかじめすすぐ。約2〜3mLのヘキサンをチューブに加え、5秒間ボルテックスする。ヘキサンを別のチューブに移し、ボルテックスする。ヘキサン（2〜3mL）を使用して、6本の管を連続的にリンスすることができる。ヒュームフード内でヘキサンリンスチューブを逆さにして保管し、使用済みヘキサンを適切な廃棄容器に処分する。 </li><li>ガラス製品を2~3層のアルミニウムホイルで包み、マッフル炉に入れます。焼く（マッフル）ガラス製品を450℃で4.5時間加熱した。 </li><li> 試薬を準備する。 <ol><li>使用される土壌量については、リン酸緩衝液（P-緩衝液）：CHCl 3 ：MeOHの0.8：1：2の容量比で化学薬品を添加する。 </li><li> P-緩衝液の調製：リン酸緩衝液：0.1M、pH7.0。 <ol><li> 1M K 2 HPO 4ストック61 mLを加え、滅菌する（化学薬品はACS認定グレード以上でなければならない）。 1 M KH 2 PO 4ストック39 mLを加え、滅菌する（化学薬品はACS認定グレード以上でなければならない）。タイプ1の水で1000 mLまで満たします。 NaOHまたはHClでpHを7.0に調整する。未使用の溶液は、周囲温度で7日間、または冷蔵庫で30日間保管してください。 </li><li>あるいは、10.62gのK 2 HPO 4および5.31gのKH 2 PO 4を計量し、タイプ1の水で1Lに希釈する。 pHを確認し、必要に応じて調整します。 </li></ol></li><li>試薬1、鹸化試薬を調製する。 <ol><li>タイプ1の水300 mLを分注する。300mLのCH 3 OH（HPLC等級以上）を加える。 90.00gのNaOH（認定ACS以上）を加える。 NaOHペレットを攪拌しながら溶液に加える。ペレットが溶解するまでかき混ぜる。この溶液は30 d以下で保存することを推奨します。 </li></ol></li><li>試薬2、メチル化試薬を調製する。 <ol><li> 273mLのCH 3 OH（HPLC等級以上）を分注する。攪拌しながら325mLの認定された6.00N HCLを添加する。この溶液は30 d以下で保存することを推奨します。 </li></ol></li><li>試薬3、抽出試薬：50％C 6 H 14 （ヘキサン）、50％C 5 H 12 O（MTBE）を調製する。 <ol><li>ヒュームフードで、C 6 H 14 （HPLCグレード以上）200 mLとC 5 H 12 O（HPLCグレード以上）200 mLを合わせます。よく混ぜます;しっかりと蓋をする。可燃性のキャビネットまたはヒュームフードを1年以内に保管してください。 </li></ol></li><li>試薬4、塩基洗浄試薬を調製する。 <ol><li>ディスペンス9001mLの水をビーカーに加える。攪拌しながら10.80gのNaOH（認定ACS以上）を加える。ペレットが溶解するまでかき混ぜる。この溶液は30 d以下で保存することを推奨します。 </li></ol></li><li>内部標準のストック溶液を調製する。 <ol><li> 100mgの19：0EE標準を秤量する。 50mLのヘキサンですすいだメスフラスコに加える。 15mLのヘキサン-MTBE溶液（試薬3）をフラスコに添加し、渦流で溶解する。ヘキサン-MTBE溶液（試薬3）で50mLに捨てる。キャップと渦巻きを混ぜる。 PTFEで覆われたキャップ付きのヘキサンですすいだガラス管に移し、-20℃で保存する。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.第1日 - 土壌からの脂肪酸の抽出（〜40サンプルで4〜5時間） <ol><li> Pバッファー、クロロホルム、およびメタノール用の5〜10 mL分注ピペットを3つ用意します。 注：クロロホルムの危険性が低い代替物質が抽出剤として提案されている。これらは、同等の脂質回収率16 </sup&gt; 、 17であるが、このプロトコルでは評価されていない。 </li><li>凍結乾燥した土壌を30 mLの遠心チューブに秤量し、土壌の質量を記録する。 </li><li> 2つのブランクを作成し、チェック標準（前に抽出された土）を含めます。 </li><li>ヒュームフード内で、試薬をP-バッファー、CHCl 3 、およびMeOHの順で遠心チューブの土壌に加えます（表1）。 CHCl 3を添加する前に、P緩衝液添加後に土壌時間を濡らす。遠心チューブをしっかり閉めて、光から保護してください。 </li><li>シェーカーを水平に置き、確実に固定されていることを確認します。速度を280 rpmに設定し、1時間振とうします18 。 </li><li>以下のように各サンプルに2本の16 mm x 150 mmのガラスチューブを準備する：チューブにラベルを付け、同じ容量のCHCl 3と等容量のP-バッファーを加える。 </li><li>シェーカーから遠心チューブを取り出し、1,430で10分間遠心分離するxgおよび25℃。相分離はガラス管内に見えるべきである。 </li><li>ヒュームフードで、上清を遠心分離管からステップ2.6で調製したチューブの1本に移す。ステップ2.4〜2.5を繰り返し、上清を第2チューブにデカントする。 </li><li>すべての16 mm×150 mmのガラスチューブにPTFEで覆われたキャップをしっかりとキャップし、10 xを反転させて混合します。 </li><li> 試料を一晩静置して2つの相の分離を完了させる。これを行うには、サンプルを暗いキャビネット/スペースに入れておくか、室温でアルミホイルで覆います。抽出物を週末に分けてもよい。 <ol><li>あるいは、次のステップに直接移動したい場合や、翌日にサンプルが乱れる場合は、1,000 xg、25℃で10分間遠心してください。 注：比較グループ内のすべてのサンプルに、同じ相分離放置時間を与えます。 </li></ol></li></ol> 3. DAY2 - 脂質の単離（約40サンプルで3〜4時間） <ol><li>蒸発装置と溶媒トラップをオンにします。蒸発装置を33℃に設定して予熱します。 </li><li>真空ポンプに接続されたサイドアームフラスコ、高純度チューブおよびガラスピペットをフード内に設置します。 </li><li>水層を保持して、2つのガラス管の最上層と界面（約2/3の方法の下）を吸引する。各サンプルにクリーンピペットを使用してプロセスを繰り返します。 </li><li>注意深くデカントすることによって、第2のチューブからの抽出物の水層を第1のチューブからの水層と合わせる。デカンテーション中のチューブに傷や亀裂がないことを確認してください。 </li><li> CHCl 3抽出物を合わせたら、液体を検査する。 MeOHを透明になるまで添加しない場合。 </li><li>真空蒸着装置を用いて全ての試料を乾燥させる。温度33℃、渦速度26％、圧力400mbarの設定から始めてください。 </li><li> P蒸発システム内のサンプルを撚り合わせ、10分後に350mbarまでゆっくりと圧力を低下させる。 </li><li>進行状況をモニターし、チューブ内の液体レベルが加熱ブロックのレベルに達したら、圧力を300 mbarに下げます。 </li><li>引き続き残りの液体の高さを監視し、深さが約1cmのときは圧力を200mbarに下げます。 </li><li>サンプルが乾燥したら、サンプルを取り出し、ポンプを10分間さらに運転して蒸気を除去します。 </li><li>チューブをしっかりとキャップし、脂質を-80℃の冷凍庫に保存する。 </li><li>該当する化学物質の安全規制に従って、吸引した液体を廃棄してください。 </li></ol> DAY 3 - 鹸化およびメチル化（〜40サンプルについて6〜7時間） <ol><li>水浴をつけてください。浴1を95℃に、浴2を80℃に設定する。 </li><li>ピペットディスペンサーをセットし、正しい量を調剤していることを確認します。 試薬1：1サンプルあたり1mL 試薬2：1サンプルあたり2mL 試薬3：サンプルあたり1.25mL 試薬4：1サンプルあたり3mL 注：加熱プロセスはチューブに圧力を作ります。引っかき傷、ひび割れ、破れたチューブは使用しないでください。 </li><li>ピペットディスペンサーを使用して、1.0mLの試薬1を乾燥した脂質に添加する。密封し、5秒間ボルテックスしてラックに入れます。 </li><li>サンプルチューブのラックを95℃の水浴に5分間置きます。チューブのラックをバスから取り出し、チューブに気泡が入っていることが示されていることを確認します。漏れたチューブのキャップを締め直したり、交換したり、クラックや切粉がないか再度確認してください。水浴中でチューブをさらに10分間加熱し続ける。 </li><li>バス1からサンプルを取り出し、バス2（80℃）に置き、さらに15分間インキュベーションを続ける。 </li><li>冷却のためにラックを水道水のパンに入れてチューブを取り外し、サンプルを冷却します。 </li><li>各サンプルに2 mLの試薬2を加えます。キャップをしっかり締め、5〜10秒間ボルテックスします。 </li&gt; <li>ラックを80℃の水浴に置き、10分間インキュベートする。 </li><li>水槽からチューブのラックを取り出し、冷却用の水道水のパンに入れます。冷却プロセスを加速するためにラックのラックを揺らす。 注：時間と温度を超えないでください。加熱が多すぎると、FAMEが劣化する可能性があります。 </li><li>ピペットディスペンサーを使用して、1.25mLの試薬3を各サンプルチューブに加えて、脂肪酸メチルエステルを抽出する。チューブをしっかりと締め、チューブをシェーカーに10分間置いてください。 </li><li>振とうした後、チューブラックを10分間放置して相を分離させる。ガラスピペットを用いて有機相（最上層）を16mm×100mmガラス試験管に移す。 </li><li>試薬3を再び添加し、振とうし、相を分離させ、上相を移すことにより抽出を繰り返す。 注記下位フェーズは転送しないでください。少量の上相をチューブに残すことは問題ありません。 </li><li>ピペットディスペンサーを使用して、3mLの試薬4をe 16mm×100mmチューブ。 </li><li>試験管をしっかりとキャップし、20〜30秒間ボルテックスする。 </li><li>ボルテックス後、1,000×gで3分間遠心分離する。 </li><li>きれいなガラスピペットを使用して、上部の有機相を吸引し、4mLのアンバーバイアルに移す。 </li><li>蒸発装置と溶媒トラップをオンにします。蒸発装置を30℃に設定し、ボルテックス速度を26％に、真空を200mbarに設定し、予熱を押す。 </li><li>進行状況を監視します。サンプルが乾燥したら、サンプルを取り出し、ポンプを10分間さらに運転して蒸気を除去します。 </li><li>試薬ボトル1および4からピペットを取り出し、希酸（ 例えば 1％HCl）、続いて脱イオン水でポンプします。 DI水をポンピングして試薬2に使用したピペットをすすいでください。フード内では、試薬3で使用したピペットから適切な容器に溶媒を排出し、溶媒残留物が蒸発するまでフード内に保持します。 </li><li>スティックを防ぐためにプランジャーを取り外した状態でピペットを逆さにして保管してくださいgの逆止め弁を有する。 </li><li>ガラスピペットを一度使用してから、適切な容器に入れてください。 </li><li>フード内では、ガラス製品の溶媒残留物を蒸発させます。 </li><li>きれいな水と洗剤溶液でガラス製品をすすいでください。 </li></ol> 5.第4日 - 作用溶液の調製およびGCバイアルへのFAMEの移動（約40サンプルについて2〜3時間） <ol><li>材料を集める：乾燥サンプルを入れた4mLのアンバーバイアル;琥珀色の2mL GCバイアル; 400μL平底ガラスインサートとキャップ; 500μLガラスシリンジ; 50mLメスフラスコ;ストック溶液 - 50/50ヘキサン/ MTBE（試薬3）中のノナデカン酸エチル（19：0 EE内部標準）。 </li><li>ガラスシリンジを使用して、エチルノナデカノエート（19：0 EE）ストック溶液500μLを50 mLメスフラスコに加えます。 </li><li>試薬3を用いて、フラスコを容積測定点まで満たす。 </li><li>フラスコをキャップし、5倍に転倒混和する。 </li><li> 3 mLを清潔な4 mLバイアルに移して、使用している溶液リザーバーに入れます。 </li><li> thを使う乾燥した脂肪酸メチルエステルとキャップを含む4 mLの各バイアルに、作業溶液300μLを加えます。 </li><li>サンプルを15秒間ボルテックスし、15分間放置する。 </li><li>ガラスパスツールピペットを使用して、懸濁した脂肪酸メチルエステルを注意深く400μLインサートを含む2mL GCバイアルに移す。 </li><li>分析前に-20℃の冷凍庫に密封したGCバイアルを保管してください。 </li><li> GC分析のサンプルを提出する。 注記：分析は、補足ファイルS1に記載されている特定のGCカラムおよび条件を使用して実行する必要があります。メチル化の2週間以内にGC分析を完了することが最良である。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

多くの反復および/または実験単位を有する実験からの複数の試料の試験のために、研究者はリン脂質脂肪酸分析（PLFA）が時間および材料の点で禁止的であることを見出し得る25 。 PLFA法を用いて、細胞膜リン脂質を抽出し、精製し、改変したBligh and Dyer 26二相水性有機抽出物を用いて同定する。これに続いて、極性によって脂質を分離するための固相シリカクロマトグラフィー、およびリン脂質脂肪酸の脂肪酸メチルエステルへのアルカリ性メチル化が続く。 PLFAプロファイリングでは、脂質収率は低くてもよいが、非常に高純度である。微生物IDは脂肪酸メチルエステル法（MIDI-FA）の代替法を導入しました。 MIDI-FAの方法で、すべての脂質は純粋培養又は土壌/堆積物試料11から直接抽出された、12、27を介して鹸化。この方法は、PLFA法の濃縮または精製工程がないため、脂質損失が低く、迅速である。しかし、MIDI-FA法は、純粋な培養物中の生物を同定するために設計されたものであるため、迅速かつ安価であるが、最初の抽出または精製工程はない。したがって、共抽出されたコミュニティの署名27、28、29を歪ま土壌有機物から脂質様化合物を挙げることができます。この包含はまた、バイオマスの測定を歪めることができるので、MIDI-FAは、典型的には定性的土壌脂質13を説明粗くするためにのみ使用されてきました。 ここで説明する手順は、2つの別々の抽出手順の中で最良のものである：1）改変されたBligh and Dyer 26法を用いた脂質の抽出および濃縮、および2）脂肪酸メチルエステルsaメチル化、抽出、および塩基洗浄手順が市販されている。この方法は、これらのプロトコルの両方の利点を達成し、短所を最小限に抑えるために開発されました15 。 MIDI-FAを実施する前に初期抽出を行い、有機可溶性成分（ 例えば、脂質）を単離し、これを精製工程で完了することにより、このプロトコルは速度と精度との間のバランスを提供する。この方法は、高純度が要求される場合（ すなわち 、 13 C PLFA分析の場合）、またはリン脂質および中性脂質を別々に分析する場合には適していないが、多くの場合、DNAベースよりも高い感度で環境条件に対する微生物のコミュニティ応答を検出することができる方法30、31、32、33。膜脂質は細胞死の後に急速に分解し、情報の多くが死亡または非アクティブの生物34から来ている環境DNAとは対照的に、サンプリング5、7の時に住んでいる微生物のコミュニティを反映しています。土壌微生物35の間で観察休眠率の高さを考えると、生きたバイオマスの特性は、比較的細かい時間的スケールで時間的植物-微生物相互作用を理解するために使用することができ、脂質バイオマーカーは、微生物群集7の生理学的状態を分析するために使用することができます。大きなフィールド設定での微生物応答を評価するには、ハイスループットの方法が必要であることが示されています25 、ここで提案する方法はPLFAバイオマーカープロファイリングの精度を再現しませんが、MIDI-FA手順。この方法は、アドレッシングに有効なツールであることが証明されています大規模な農業生態系の研究36、37、38、42、43、44、45、46、47、48、49、50における土壌の広い範囲上の微生物群集動態に関する質問。 脂質クラスは、この方法で合成され、それらの別々のクラス22、39に含まれる情報の損失があるかもしれないが、力を強化することができる脂質クラスを組み合わせて16のアーバスキュラー菌根菌の原点検出する：両方のホスホから1ω5cを- および中性脂質40 。また、tこの方法では、未知の脂肪酸（非生物由来の有機物由来である可能性がある）の数は、この方法ではより高い可能性があり、MIDI-FAよりも低いことが示されており、脂質プロファイルの処理比較が、スループット能力が懸念される15 。中性画分は、主に真菌によって産生される貯蔵脂質から誘導されると考えられているが、土壌動物41からの寄与はいくらか小さいかもしれない。これに照らして、本明細書に記載の方法は、PLFAよりも真菌脂質18：2ω6,9cおよび18：1ω9cのより大きな寄与を示す結果を生じ得る。中性画分に現れやすい他の脂質には、飽和脂肪酸のいくつか、 例えば 16：0,18：0,20：0が含まれる。 脂質データを表現し分析する方法はいくつかあります。最も一般的な表現は、存在量（nmol g -1土壌）、モル分率n（ナノモルの個々の脂質nmol -1全脂質）、およびモルパーセント（モル分率* 100）。試料中の総脂質によって標準化されたモル分率およびモル％は、所与の脂質の相対存在量の尺度である。適切な変換後、 例えば 、平方根アークサイン、モル分率は、主成分または冗長解析コーディネーションによる分析での使用に適しています。存在量は、土壌1グラム当たり抽出される所定の脂質の絶対量である。細胞当たりの脂質の量はかなり一定であり、脂質抽出は非常に効率的で包括的であるため、総量は総脂質の良好な推定値であり、主要指標の豊富さはそれを表す生態学的グループのバイオマスを反映する17 。最後に、微生物群集組成を見るための良い方法は、多変量解析法16を用いることである（ 例えば 、非対称多次元スケーリング（NMDS-データ変換を必要としない）または主要成分分析（PCA）は、すべての脂質バイオマーカーの相対存在量を比較するのに有用であり得る。

<html>栄養サイクル1における微生物の重要な役割、植物コミュニティの構成2の改変、植物の生産性の調節3 、有機物4の分解を考慮して、土壌微生物群を理解することは陸生生態系を理解する上で不可欠です。 土壌におけるそれらの比較的豊富な存在およびそれらの化学的特徴のために、脂質バイオマーカーは、土壌微生物群集5を含む優勢な生態学的群をプロファイルするために使用することができる5 。異なる微生物群の特徴である脂質バイオマーカーを定量化することにより、総脂質を推定し、グラム陽性（Gm +）およびグラム陰性（Gm-）細菌、アルブスカラ菌菌（AM）および栄養細菌真菌、および放線菌5 、<html> SS = &quot;外部参照&quot;&gt; 6、7、8。 微生物群集の特徴を示す多くの方法がある。 PLFA法は、基本的な微生物群集構造を理解するために一般的に使用される方法である。微生物群の総量と微生物総量の相対量を評価するのに有効な方法です。細菌の比率栄養循環1、9、10の速度を評価するために：急激な脂質の代謝回転に、PLFAプロファイリングはまた、真菌は、例えば、土壌微生物コミュニティの変化の比較的高速な検出を可能にし、生態系の機能の比較を可能にする情報を提供します。しかし、PLFA抽出法は時間を守り、尊敬しているが、時間がかかり、野外スケールの多数のサンプルを必要とする生態系規模の研究には適していないF &quot;&gt; 11、12。 対照的に、脂肪酸メチルエステル抽出法（MIDI-FA）は、迅速な処理を可能にする可能性がある。この方法では、試料を鹸化し、FAMEに変換し、抽出し、次いで分析する。 MIDI-FA法は、異なる脂質クラス13 （リン脂質、中性脂質、および糖脂質）の分離を伴う脂質の抽出を組み合わせたPLFAよりも、迅速であるが区別が難しい。 このプロトコールでは、PLFAおよびMIDI-FA脂質プロファイリングの要素を組み合わせた方法について説明します。これは、改変されたBlighおよびDyer法の最初のクロロホルム抽出段階を用いて脂質の抽出を行い、次いで鹸化およびFAMEへの変換を使用する。これは、非微生物材料5、14からバックグラウンドノイズの多くを排除しながら微生物群集構造を検出するための堅牢な方法を提供します</sup&gt;。この方法は、多くの試料15との大規模な研究から脂質を分析することがロジスティックと経済的に実現可能にするために、スループットを増加させながら精度の大部分を保持する、すなわち、PLFAとMIDI-FAの両方のプロトコルとの間のバランスを達成するために開発されました。 MIDI-FAを実施する前に初期抽出を行い、有機可溶性成分（ 例えば、脂質）を単離し、精製工程でこれを完了することにより、プロトコールは速度と精度との間のバランスを提供する。

<table><tbody><tr><td>RapidVap</td><td>Labconco</td><td>7900000</td><td>蒸発システム</td></tr><tr><td>RapidVap</td><td>Labconco</td><td>7491400</td><td>サンプルブロック</td></tr><tr><td>耐薬品性真空ポンプ</td><td>Labconco</td><td>7584000</td><td>真空ポンプ</td></tr><tr><td>ケミカルトラップキャニスター</td><td>Labconco</td><td>7815300</td><td>トラップキャニスター</td></tr><tr><td>溶剤インサート</td><td>Labconco</td><td>7515200</td><td>溶剤トラップインサート</td></tr><tr><td>ダイヤフラムポンプ</td><td>ウェルチ</td><td>7398000</td><td>DryFast真空ポンプ</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>フィッシャー</td><td>15-462-15Q</td><td>2井戸水浴</td></tr><tr><td>ガスクロマトグラフ</td><td>各種</td> N<td>/A</td><td>サンプル分析用</td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>各種</td> N<td>/A</td><td>サンプル分離用</td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>各種</td> N<td>/A</td><td>サンプル凍結乾燥用</td></tr><tr><td>リピペット (6)</td><td>BrandTech</td><td>4720440</td><td>試薬分注用</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher</td><td>02-215-365</td><td>アナログボルテックスミキサー</td></tr><tr><td>テフロン遠心分離管</td><td>Thermo/Nalgene</td><td>3114-0030</td><td>テフロンサンプルチューブ</td></tr><tr><td>キャップ</td><td>Thermo/Nalgene</td><td>DS3131-0020</td><td>テフロン管用キャップ</td></tr><tr><td>試験管</td><td>コーニング</td><td>9825-16</td><td>16x100mm 管</td></tr><tr><td>試験管</td><td>コーニング</td><td>9825-16xx</td><td>16x150mm チューブ</td></tr><tr><td>キャップ</td><td>コーニング</td><td>9998-15</td><td>15-415 糸 ブラック フェノール キャップ PTFEライナー付き</td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>フィッシャー</td><td>13-678-20B</td><td>14.6cm</td></tr><tr><td>500 uL ガラスシリンジ</td><td>フィッシャー</td><td>13684106LC</td><td>ハミルトン 81217</td></tr><tr><td>琥珀色のバイアル</td><td>アジレント</td><td>5182-0716</td><td>4mL 琥珀色のバイアル</td></tr><tr><td>キャップ</td><td>Agilent</td><td>5182-0717</td><td>ブルー スクリュー キャップ</td></tr><tr><td>インサート</td><td>Agilent</td><td>5181-3377</td><td>400uL 平底ガラス インサート</td></tr><tr><td>Standards</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>19:0 エチル ノナデカン酸 (エチル ノアデカン酸</td>) <td>VWR</td><td>TCN0459-5G</td><td>分析標準</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸二カリウム(K2HPO4-ACSグレード以上)</td><td>各種</td><td>N / A</td>リン酸<td>緩衝液</td></tr>リン酸<tr><td>カリウム一塩基性(KH2PO4-ACSグレード以上)</td><td></td>各種N <td>/ A</td>リン酸<td>緩衝</td></tr><tr><td>メタノール(CH3OH-HPLCグレード以上)</td><td></td>試薬<td></td><td>1&2</td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム(NaOH-ACSグレード以上)</td><td>各種</td><td>N / A</td><td>試薬1 &4</td></tr><tr><td>塩酸 (6N HCL)</td>各種 <td></td><td>N/A</td><td>試薬2</td></tr><tr><td>ヘキサン(HPLCグレード以上)</td><td></td>各種 N<td>/A</td><td>試薬3</td></tr><tr><td>MTBE(メチルtert-ブチルエーテル - HPLCグレード以上)</td><td></td>各種 N<td>/A</td> 試薬<td>3</td></tr></tbody></table>

多数の試料を用いた実験における土壌微生物の同定のための脂質抽出と分析法

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

微生物群集は、生態系プロセスの重要な推進要因であり規制者でもあります。生態系の管理が微生物群集にどのように影響するかを理解するために、微生物群集組成を測定する比較的正確ではあるが努力を要する技術は、リン脂質脂肪酸（PLFA）分析である。 PLFAは、微生物バイオマスの指標および菌類および細菌の広範な官能基の組成として使用できるリン脂質バイオマーカーを分析するために開発されました。それは、代替植物コミュニティ、生態系、および管理レジームの下で土壌を比較するために一般的に使用されてきた。 PLFA法は、微生物群集組成のシフトの検出に敏感であることが示されている。 別の方法である、脂肪酸メチルエステル抽出および分析（MIDI-FA）は、微生物同定技術として、純粋な培養物からリン脂質画分を分離することなく、全脂質を迅速に抽出するために開発された。このメソッドは迅速ではあるが土壌サンプルにはあま​​り適していない。なぜなら、土壌粒子を分離する初期段階がなく、代わりに土壌中の背景有機物からの人工物を生成する鹸化反応で始まるからである。 この論文では、多くのサンプルを用いた研究で土壌微生物群集の構造を決定するために、総脂質と指標脂質の相対存在量の両方を特徴づける微生物の細胞膜から脂質を抽出するための努力と正確さをバランスさせながらスループットを向上させる方法について説明します。この方法は、第1ステップとして土壌脂質を抽出および濃縮することによりPLFAプロファイリングによって達成された精度と、抽出された有機材料を鹸化し、MIDI-FA法で処理することによる努力の減少を第2ステップとして組み合わせる。

レポートのデータテーブルは、スプレッドシートまたはデータベースに照合することができます。応答係数（異なる鎖長に対する応答を正規化する補正係数）を調整した後、ピーク面積を外部標準または内部標準のピーク面積と比較して抽出物中の濃度に到達させることができる。抽出された土壌の質量で除算することにより、データは土壌1g当たりのFAMEの質量として、または各FAMEの分子量を用いて、より一般的に報告された1g / molのnmolとして表すことができる。微生物FAMEsの合計は、微生物総バイオマスの指標であり、処理間で比較することができる（ 図1 ）。特定のFAMEはまた、グラム陽性又はグラム陰性細菌、放線菌、アーバスキュラー菌根菌、および真菌saprotrophic 19、20のような特定の微生物のグループに関連付けることができ<sクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 21、22、23、24アップ。特定のバイオマーカーの質量の割合は、これらの群の相対的存在量を反映することができる（ 図2 ）。全体的なFAMEの豊富なパターンは、コミュニティレベルの指紋を作成します。この指紋は、アジテーションなどの多変量解析技術を使用して微生物のコミュニティの非類似性を比較することができます （ 図3 ）。ほとんどのDNAベースのアプローチとは対照的に、コミュニティレベルの脂質データは、相対的または絶対的な存在量として分析することができる。総バイオマスが試料間で実質的に異なる場合、これらの2つのアプローチは非常に異なる結果をもたらす。実験の根底にある生態学的疑問は、どのアプローチが使用されるかを決定するべきである。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55310/55310fig1.jpg" /> F<html>図1 ：総FAMEバイオマス。連続トウモロコシ、受精草原、未受精草地の総FAMEバイオマーカーバイオマス（nmol g -1土壌）の比較。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55310/55310fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55310/55310fig2.jpg" /> 図2 ：細菌と真菌のFAMEバイオマス。連続トウモロコシ、受精草原および未受精草地からの細菌および真菌FAMEバイオマーカーバイオマス（nmol g -1土壌）の処理比較。絶対量からの真菌および細菌の質量。平均（合計f /合計b）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55310/55310fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> ve_content &quot;fo：keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55310/55310fig3.jpg" /> 図3 ：FAME脂質バイオマーカーの非測定次元スケーリング。全ての微生物FAME脂質バイオマーカーの絶対量プロファイルを用いた全体的な微生物群の比較。この例では、連続したトウモロコシと未処理の草原のコミュニティが分離され、非常に離れていますが、いくつかの受精した牧草のサンプルには、トウモロコシのものと類似の微生物のコミュニティがあり、その他のものは未取得の草原に似ています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55310/55310fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/55310/55310table1.jpg" /> 表1： T h e soLの VENの T 型 、propor S 上の TIは、G -1 土壌を 添加し 、D T H EIR オード R O F N 2 O ITIを 加えます 。これは、有機相および水相の適切な抽出および分離にとって重要である。

この論文は、多くの試料を用いた研究において土壌微生物群集構造を決定するために、総脂質と指標脂質の相対存在量の両方を特徴づける微生物の細胞膜から脂質を抽出するための努力と正確さとをバランスさせながらスループットを増加させる方法を記載している。

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

このビデオの目的は、土壌微生物コミュニティ構造の決定や多検体研究において、全脂質の特性評価および指標脂質の相対存在量の解析に用いるための、微生物細胞膜からの脂質抽出法を説明することです。本手法は、手間と精度のバランスを維持しつつ、スループットを向上させます。フィールドにおいては、土壌の不均一性を考慮し、サイトを代表するように土壌サンプルを採取する必要があります。サンプリング時の微生物コミュニティを維持するため、サンプルは氷上で現場から運搬してください。研究室に戻ったら、根や石を取り除き、粗い篩（ふるい）にかけて土塊を砕きます。これにより、サンプルの均一化も行われます。サブサンプルを適切な容器に入れ、可能な限り速やかに凍結乾燥の準備をしてください。土壌の凍結乾燥後、抽出まで乾燥剤と共に密閉容器に入れて保存します。凍結乾燥土壌は-80°Cで保存することが最適です。抽出の準備として、保存していた凍結乾燥土壌を取り出して粉砕します。粉砕方法には、ボールミル、ボールメーター、または乳鉢と乳棒が挙げられます。土壌を粉砕した後、再度、土壌サンプルを十分に均質化し、フリーザーで保存します。すべての実験器具は厳格に洗浄されていなければなりません。洗剤、グリース、または汚れがわずかでも残っていると、最終的なGCクロマトグラムにピークとして現れ、結果に影響を及ぼす可能性があります。抽出は、溶媒で洗浄した30 milliliterのテフロン製遠心チューブを用いて行います。チューブに2〜3 milliliterのヘキサンを加え、数秒間ボルテックスします。ヘキサンを別のチューブに移し、さらにボルテックスします。2～3 mLのヘキサンを使用して、6本のチューブを順次洗浄できます。ヘキサンで洗浄したチューブは、ドラフトチャンバー内で逆さまにして保管し、使用済みのヘキサンは適切な廃棄容器に廃棄してください。ガラス器具は、使用直前に洗浄または溶剤で濯いでください。マッフル炉による加熱処理を行うことで、高温での酸化によりガラス器具の残留物が除去され、清潔な状態になります。ガラス器具をアルミホイルで2〜3層に包み、マッフル炉に入れます。温度を450 °Cに設定し、炉が設定温度に達した後、最低4時間30分焼成します。炉から取り出す前に、少なくとも1時間の冷却時間を設けてください。ヘキサンで洗浄したテフロンチューブにラベルを貼り、重量を量ります。テフロン遠心チューブに土壌を加え、再度重量を量って土壌量を決定します。抽出が正しく行われたかを確認したい場合は、常に1バッチあたり少なくとも2つのブランクを設けてください。また、チェック標準（できれば以前に抽出を行ったことのある土壌）を含めてください。脂質抽出。リン酸緩衝液、クロロホルム、メタノールのための5〜10 mLのリピペットを3本準備します。クロロホルムは表面張力が低く、非常に密度の高い液体です。分注量が正確かつ一定になるよう注意してください。ボトルには常に半分以上の液体が入った状態で保持してください。ドラフト内で、テフロンチューブに入れた土壌に、リン酸緩衝液、クロロホルム、メタノールの順で試薬を添加します。これが、試料材料から脂質を物理的に抽出する最初の操作となります。試薬溶液の調製方法は、書面プロトコルに記載されています。有機相と水相を適切に分離させるためには、溶媒の比率と添加順序が重要です。クロロホルムを添加する前に、緩衝液の添加後に土壌を十分に濡らす時間を設けてください。都合が良ければ、2回目以降の抽出では、抽出剤を混合して単一のアリコートとして添加することができます。テフロンチューブのキャップをしっかりと締め、遮光して保存します。チューブを水平に配置し、しっかりと固定されたことを確認してシェーカーにセットします。速度設定を「high」にし、1時間振盪させます。チューブを振盪させている間に、各サンプル用に2本の長いガラスチューブを次のように準備します。チューブにラベルを貼り、土壌に添加したのと同量のクロロホルムと、それと同量のリン酸緩衝液を加えます。25 °Cのシェーカーからテフロンチューブを取り出した後、2,500 RPMで10分間遠心分離します。次に、消灯したドラフトチャンバー内で、テフロンチューブから上清を長いチューブのいずれかに分注します。ガラスチューブ内で相分離が確認できるはずです。下層には、主にクロロホルムである有機溶媒と脂質が含まれています。この抽出を繰り返します。上澄み液を、先に準備しておいた2本目のチューブに注ぎます。これで、土壌から脂質の物理的抽出を2回行ったことになります。ほとんどの土壌において、これで十分です。すべてのロングクラスチューブをテフロンライナー付きキャップでしっかりと密閉し、10回反転させて混合します。一晩静置し、重力によって相を分離させます。2つの相を完全に分離させるため、サンプルをそのまま一晩静置します。その際、サンプルを暗いキャビネットに入れるか、アルミニウム箔で覆い、室温で保存してください。抽出物の分離に週末を費やしても問題ありません。2日目、脂質の単離を行います。2日目には、水層を吸引し、真空蒸発システムで溶媒を除去して脂質を濃縮します。また、サンプルをウォーターバスまたはサンドバスに置き、緩やかな窒素気流を当てることで乾燥させることも可能です。チューブ内の液体が十分に分離し、大部分が透明になっているはずです。分離が不十分な場合、または2層間の界面が特に厚い場合は、さらに1日置いて分離を継続させてください。フード内で真空吸引装置を準備します。これは、Tygonチューブとパステールピペットを用いて真空ポンプに接続されたサイドアームフラスコです。ポンプを作動させ、ピペットを使用して水相をフラスコ内に吸引します。最上層と界面を吸引してください。これはおおよそ下から2/3の位置になります。これを2〜3セットのガラス管に対して行います。最上層には、少量の土壌粒子が含まれている場合があります。可能であれば、これらを除去してください。2番目または3番目のチューブセットからの抽出液を、慎重にデカンテーションして最初の2つのチューブの抽出液と合わせてください。注ぐ際に固形物が混入しないようにし、チューブを回転させて壁面を洗浄してください。各サンプルに清潔なピペットを使用し、残りのサンプルに対してもこの操作を繰り返します。クロロホルム抽出液を混合し、数分間静置した後、液面を確認してください。多くの場合、残留水の薄い層が形成されます。もし残存している場合は、次へ進む前に吸引してください。残留水は脂肪酸の二重結合を攻撃する可能性がありますが、サンプルを乾燥させる際、ごく少量であれば溶媒と共に共蒸発します。真空蒸発装置を用いて、すべてのサンプルを乾固させてください。チューブの蓋をしっかりと閉め、-80°Cのフリーザーで保存します。3日目は、けん化およびメチル化を行います。まず、ウォーターバスの電源を入れます。水位を確認し、バス1を95°Cに、バス2を80°Cに設定します。リピペットを使用して、乾燥させた脂質にけん化試薬（Reagent 1）を1 mL加えます。キャップをしっかりと締め、短時間ボルテックスした後、ラックに立てます。この手順が完了したら、チューブのラックを95 °Cのウォーターバスに入れ、5分間待ちます。ラックをウォーターバスから取り出し、チューブに漏れがないか確認します。これは、チューブ内で泡がフォームのように上昇することで確認できます。漏れているチューブのキャップを締め直すか、交換してください。その後、ウォーターバスでさらに10分間チューブを加熱し続けます。ウォーターバスの温度設定を80°Cに下げ、さらに15分間インキュベーションを続けます。チューブを取り出し、ラックを水道水の入ったパンに入れて冷却します。氷水は使用しないでください。サンプルが冷却されたら、各サンプルにメチル化試薬（Reagent 2）を2 mL加えます。再びキャップをしっかりと締め、5〜10秒間ボルテックスします。試薬が過剰であるため、溶液中に沈殿物として粒状の塩が見える場合があります。ラックを80°Cのウォーターバスに入れ、10分間インキュベートします。チューブが入ったラックをウォーターバスから取り出し、冷却のために水道水を入れたパンに入れます。ラックを振って冷却を早めます。リピペットを使用して、各チューブにヘキサンおよびメチルtert-ブチルエーテル（試薬3）を1.25 millilitersずつ加え、相抽出を行います。キャップをしっかりと密閉し、シェーカーで10分間振盪させます。振盪後、チューブラックをそのまま10分間静置し、相を分離させます。パステールピペットを用いて、上層となった有機相を短いガラス管に移します。液体の大部分を回収することが望ましいです。少量の水層が混入しても、抽出への影響はありません。試薬3を加え、振盪し、相分離させ、上層を回収して水相抽出を繰り返します。下層の状態に応じて、この操作をもう一度繰り返し、合計3回回収することができます。ショートチューブ内の抽出液に、水酸化ナトリウム希釈溶液であるベース洗浄液（試薬4）を3 milliliter加えます。試験管のキャップをしっかりと締め、20〜30秒間ボルテックスした後、2,000 RPMで3分間遠心分離します。遠心分離後、清潔なパスツールピペットを用いて上層の有機相を吸引し、4 mLの遮光バイアルに移します。この際、水相を吸引しないよう十分に注意してください。次のステップは、真空蒸発装置を用いて溶媒を乾固させることです。4日目は、GC分析に向けて抽出液の調製を行います。ピペッターを使用して、乾燥相が入った各4 mLバイアルに試薬3を100 µLずつ加えます。サンプルをボルテックスした後、10分間静置します。2台目のピペッターを使用して、懸濁したFAMEsを慎重にGCバイアルに移します。4 mLバイアルに溶媒をさらに分注し、短時間ボルテックスします。バイアルを転がし、壁面に残ったFAMEsを完全に溶解させます。2本目のピペッターを再度使用して、溶媒をGCバイアルに移します。さらに3回目の溶媒をバイアルに加え、ボルテックス処理をした後、GCバイアルに移して転送を完了させます。GCバイアルにキャップをし、フリーザーで保存します。分析前に、密封したGCバイアルをフリーザーで保存してください。GC分析。本システムを使用するには、特定のGCカラムを用いて分析を行う必要があります。ガスクロマトグラフには、不活性化ガラスウールのプラグを備えた内径4 mmのガラスインレットライナーが装着されたスプリット/スプリットレスインレットが備わっています。インレットは250 °Cに設定し、定圧モードで動作させます。キャリアガスには水素を使用します。検出器のサポートガスとして窒素と空気が必要です。カラムはAgilent Ultra 2を使用します。カラムは長さ25 m、内径2 mm、固定相膜厚33 µmである。このカラムの固定相は5%フェニル-95%メチルポリシロキサンであり、DB-5タイプカラムとしても知られている。脂質抽出物を分析するため、オーブン温度170 °Cにおいて、2 µLのアリコートを100:1の分割比で注入する。注入後、オーブン温度を毎分5 °Cで300 °Cまで上昇させ、その後12分間保持するようにプログラムする。MIDI標準に従って一連の注入を行い、その結果を用いてMIDIマニュアルの指示通りに調整を行います。このように校正されたシステムは、時折微調整が必要になる場合がありますが、一般的にこれらのパラメータを使用することで良好な結果を得ることができます。MIDIシステムはサンプルごとにレポートを作成し、そこに検出されたピークごとに1行で構成される表が含まれます。ソフトウェアは、ピーク保持時間、ピーク面積、ピーク同定に加え、ピーク同定に使用されるパラメータであるECL（推定鎖長）および保持時間に伴う変動や検出器の応答を正規化するために使用されるパラメータである応答係数を報告します。ECLは、一連の直鎖状FAMEsの中で、各未知のFAMEがどこで溶出するかを示します。例えば、未知物質の保持時間が炭素数12と13の鎖の中間に位置して溶出した場合、ECLは12.5炭素鎖として報告されます。ソフトウェアは、各ピークのECLをデータベース内のFAMEsのECLと比較し、一致した場合には、未知試料に corresponding name を割り当てます。データベース内の2つのFAMEsのECLが非常に近い場合は、ソフトウェアは両方の名称を報告し、より近い方を先に記載します。レポートのデータテーブルは、スプレッドシートやデータベースにまとめて管理することができます。応答係数で補正した後、ピーク面積を外部標準物質または内部標準物質のピーク面積と比較することで、抽出物の濃度を算出できます。抽出した土壌の質量で除することで、データは土壌1gあたりのFAME質量として、あるいは各FAMEの分子量を用いることで、土壌1gあたりのナノモルとして表すことができます。その後、バイオマーカーFAMEを合算することで微生物ギルドのバイオマスを求め、これらのギルドをさらに分析することが可能です。例えば、ここでは、施肥されていない草原が施肥された草原よりも多くのFAMEバイオマスを有していることがわかります。どちらの草原も、近隣のトウモロコシ畑よりもバイオマス量が多いです。また、FAMEは真菌や細菌などの特定の機能群に関連しています。これらの関連性はエコシステム特有のものであるため、過度に一般化しないことが重要です。この種の解析により、特定のグループが特定の環境においてより豊富に存在するかどうかがわかります。ここでは、未施肥の草原において、トウモロコシ畑よりも菌類がより豊富に存在しています。最後に、微生物コミュニティ全体の組成を把握するもう一つの方法は、非計量的多次元尺度構成法（NMDS）や主成分分析（PCA）などの順序付け法を用いて、すべてのFAMEの相対存在量を一度に比較することです。順序付けにおいて、より類似した微生物コミュニティは互いに近い位置に配置されます。したがって、本例のデータでは、トウモロコシ栽培地と非施肥草原は非常に離れていますが、一部の施肥草原のサンプルでは、トウモロコシ栽培地に類似した微生物コミュニティを持つものと、非施肥草原に類似したものがあります。微生物コミュニティは、同一環境内であっても変動が激しいことが多く、必ずしも明確に分類できるとは限りません。このビデオを視聴することで、微生物の細胞膜から脂質バイオマーカーを土壌から抽出するプロセスを十分に理解できるはずです。ホスホリピド脂肪酸の抽出は、独自の微生物バイオマーカーを同定することにより、微生物ギルドおよび全微生物バイオマスを評価するための効果的かつ迅速で安価な手法です。

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JoVE Journal

Environment

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