単一サンプルからの代謝産物、脂質およびタンパク質の包括的分析のための単純分別抽出法

本法の全体的な目的は、シンプルな分画メチル-t-ブチルエーテル抽出を用いて、単一のサンプルから極性および準極性代謝物、脂質、タンパク質を含むすべての主要な分子種を回収し、分析することです。一般的に、単一のサンプルから複数の化合物クラスを分析することは困難であるとされています。ここで紹介するMTBE抽出を用いることで、脂質、代謝物、タンパク質などの複数の化合物クラスを単一のサンプルから抽出し、分析することが可能になります。

この手法の主な利点は、少量の単一サンプル分注液から、あらゆる分子化合物クラスを堅牢に抽出できることです。この方法は、プロテオミクス、リピドミクス、およびメタボロミクスの解析に使用可能な分画を提供し、マルチオミクス解析の実験的根拠となるため、システム生物学における根本的な問いへの回答に寄与します。以下のプロトコルでは、Arabidopsisの葉組織を用いて実演します。

シロイヌナズナはアブラナ科の小型の花咲き植物であり、キャベツの近縁種です。まず、組織ホモジナイザーのチューブホルダーを液体窒素で10分以上予冷します。サンプルを液体窒素から取り出し、チューブホルダーに設置してください。

次に、チューブホルダーを液体窒素から取り出します。速やかにチューブホルダーを組織ホモジナイザーに入れ、生物学的試料を微細で均質な粉末に粉砕するようにホモジナイザーを設定します。葉の場合、20 hertzで1分間処理します。

ホモジナイズの時間と速度は、組織によって調整してください。得られたサンプルが非常に微細な粉末状になるまで、必ずホモジナイズを行ってください。また、ホモジナイズのすべてのステップにおいて、サンプルは凍結状態で保持する必要があります。

サンプルを均質化し、チューブホルダーから生物学的サンプルを取り出します。すぐに使用しない場合は、次回の抽出まで-80°Cのフリーザーに保存してください。4本の2mLラウンドボトムセーフロックマイクロ遠心チューブに、サンプル番号を記入します。

チューブとスパチュラ数本を液体窒素に浸して予冷します。チューブとスパチュラが冷えたら、チューブ1本を分析天秤に載せ、スパチュラを使用して組織粉末25 mgをマイクロ遠心チューブに分注します。各サンプルの正確な重量を記録し、分注したサンプルを直ちに液体窒素に入れます。

植物材料の解凍を避けるため、この操作を迅速に行います。分注したサンプルは、次回の抽出まで-80°Cで保存します。抽出の準備として、付属文書に従って調製したメチルtert-ブチルエーテル（MTBE）メタノール抽出混合液を-20°Cのフリーザーで予冷しておきます。

分注したサンプルを取り出し、各サンプルチューブに、あらかじめ冷却した抽出混合液を1 mL加えます。この操作は迅速に行ってください。MTBEは粘度が低いため、ピペットチップから滴下することがあります。

抽出混合物の中で組織が十分に均質化されるまで、各サンプルを直ちにボルテックスミキサーで混合します。すべてのサンプルの抽出が完了するまで、チューブをベンチ上のラックに保持してください。このステップは極めて重要です。

ここでは、タンパク質を沈殿させ、その酵素活性を失活させます。すべてのサンプルを、オービタルシェーカーを用いて4 °Cで100 RPM、45分間インキュベートします。その後、氷冷した超音波洗浄槽でサンプルを15分間ソニケーションします。

次に、相分離により分画するため、水とメタノールの3:1溶液を650 µLずつ各サンプルチューブに加えます。その後、ボルテックスミキサーで1分間混合します。サンプルを4°Cで20,000 ×gの速度で5分間遠心分離します。

このステップの後、2つの液相が混ざり合い、また沈殿したペレットが乱れるのを避けるため、チューブの取り扱いには十分注意してください。この段階では、チューブの底に固形ペレットがあり、その上に2つの許容可能な液相が存在します。非極性の上の相には脂質が含まれています。

下層の水相には極性および半極性代謝物が含まれています。ペレットにはタンパク質、デンプン、および細胞壁が含まれています。上層の脂質含有相から溶媒500 µLを、ラベルを貼った1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。

次に、200 µL ピペットを使用して、残っている脂質相を注意深く取り除き、廃棄します。続いて、下層の溶媒 400 µL を、ラベルを貼った 1.5 mL マイクロ遠心チューブに移します。さらに 200 µL の分注量を別のマイクロ遠心チューブに移し、ガスクロマトグラフィーによる代謝物解析などのさらなる分析を行います。

ピペットで余剰分を吸い出し、水相の残りを除去して廃棄します。次に、得られたタンパク質-デンプン-細胞壁ペレットを洗浄するため、500 µLのメタノールを加え、1分間ボルテックスします。サンプルを4 °C、10,000 ×gで5分間遠心分離します。

脂質の酸化修飾を避けるため、窒素フロー蒸発器を用いて脂質試料から溶媒を蒸発させる。得られた乾燥試料は直ちに分析すること。水系試料の溶媒は、真空濃縮機を用いて加熱せずに一晩かけて蒸発させる。

乾燥させた水系サンプルは、分析まで-80°Cで数週間保存することが可能です。乾燥した脂質分画を、アセトニトリルと2-プロパノールの7:3溶液400 µLで再懸濁させます。十分な量の液体をガラスバイアルに移し、しっかりとキャップを締めます。

次に、ガラスバイアルを4 °Cに冷却したオートサンプラーに入れます。サンプルあたり2 µLを注入し、60 °Cに保持された逆相C8カラムを用いて、流量400 µL/minのUPLCシステムで脂質を分離します。クロマトグラフィー分離には、付属ドキュメントの表1に記載されている移動相を使用してください。

適切なMS装置を用いて、電荷対質量比150から1500の質量範囲をカバーする正および負のイオン化モードで質量スペクトルを取得します。極性相を、UPLCグレードのメタノールと水の1:1溶液200 µLで再懸濁します。十分な量の液体をガラスバイアルに移し、しっかりと蓋をします。

次に、ガラスバイアルを4 °Cに冷却したオートサンプラーに入れます。各サンプルから2 µLを注入し、40 °Cに保持されたRP C-18カラムを用いて、流量400 µL/minで動作するUPLCシステムで代謝物を分離します。クロマトグラフィー分離には、付属文書の表2に記載されたパラメータの移動相を使用してください。

適切な質量分析計を用い、質量電荷比 50 から 1500 の範囲をカバーする正および負のイオン化モードでフルスキャンマススペクトルを取得します。最後に、付属のドキュメントに記載されている手順に従って、タンパク質の抽出、消化、および分析を行います。25 mg の Arabidopsis 葉組織を採取し、粉砕および抽出した後、3 つの分析用 UPLC-MS プラットフォームに供しました。

極性および半極性の一次および二次代謝物を、逆相C-18 UPLC-MSを用いて極性相から分析しました。上段パネルに示す脂質および下段パネルに示す半極性代謝物のベースピーククロマトグラムを、正イオンモードで分析しました。各クロマトグラムの右上の円グラフは、異なる化学クラスに割り当てられた、同定済みの脂質および代謝物の数を示しています。

例えば、58種類の異なる脂質がトリアシルグリセロール群に割り当てられ、上のチャートではTAGとして示されています。この画分に含まれる糖や極性アミノ酸など、逆相材料で十分な保持を示さないより親水的な代謝物は、GCMSや親水性相互作用液体クロマトグラフィーなどの他の分析法で分析することが可能です。抽出によって回収されたタンパク質は、溶液状態で消化され、ショットガンLCMSを用いて分析されました。

右上に表示されている円グラフは、異なる生物学的プロセスに割り当てられた同定タンパク質の数を示しています。例えば、268個のタンパク質が局在化カテゴリーに割り当てられました。要約すると、本例で使用したもののようなサンプルから、200種類以上の脂質種、50種類の注釈付き半極性代謝物、および数千種類のタンパク質を日常的に同定することが可能です。

さらに、本手法は異なる組織、器官、および細胞培養材料を用いて広範な適用性を示しました。このビデオを視聴することで、単一の試料から主要な化合物を抽出および分析する方法について十分に理解できるはずです。本手順を実施する際は、すべての試料を凍結状態で保持し、材料を適切に粉砕し、分析グレードの溶媒および化学薬品を使用することが重要です。

本手順に従い、あらゆる分析手法を用いて抽出サンプルの分子組成を決定することができます。