単一サンプルからの代謝産物、脂質およびタンパク質の包括的分析のための単純分別抽出法

この分析法の全体的な目標は、単純な分画メチルトリブチルエーテル抽出法を使用して、極性および半極性代謝物、脂質、タンパク質を含むすべての主要な分子実体を単一のサンプルから回収および分析することです。一般に、科学者は1つのサンプルから複数の化合物クラスを分析することは難しいと感じています。ここで紹介するMTBE抽出法を用いると、1つのサンプルから脂質、代謝物、タンパク質など、複数の化合物クラスを抽出して分析することができます。

この手法の主な利点は、少量の単一サンプルアリコートからすべての分子化合物クラスを確実に抽出できることです。この方法は、マルチオミクス解析の実験的基礎を提供し、プロテオミクス、リピドミクス、メタボロミクスによる解析に使用できるフラクションを提供するため、システムバイオロジーの基本的な質問に答えるのに役立ちます。以下のプロトコルは、シロイヌナズナの葉組織を用いて実証されています。

シロイヌナズナはアブラナ科の小さな顕花植物で、キャベツに関連しています。この手順は、組織ホモジナイザーチューブホルダーを液体窒素で少なくとも10分間予冷することから始めます。液体窒素からサンプルを取り出し、チューブホルダーに入れます。

次に、チューブホルダーを液体窒素から取り外します。チューブホルダーを組織ホモジナイザーにすばやく入れ、ホモジナイザーを設定して生物学的材料を細かく均質な粉末に粉砕します。葉の場合は、20ヘルツを1分間使用します。

均質化の時間と速度は、組織によって異なる場合があります。得られたサンプルが非常に細かい粉末になるまで、必ず均質化してください。また、サンプルは均質化のすべてのステップで凍結しておく必要があります。

サンプルを均質化し、チューブホルダーから生物学的サンプルを取り出します。また、すぐに使用しない場合は、さらに抽出するまでマイナス80°Cの冷凍庫に入れてください。2ミリリットル丸底安全ロック式マイクロ遠心チューブ4本にサンプル番号をラベル付けします。

チューブと一部のヘラを液体窒素に浸して予冷します。チューブとスパチュラが冷めたら、チューブの1つを分析天びんに置き、スパチュラを使用して25ミリグラムの組織粉末をマイクロ遠心チューブに分注します。各サンプルの正確な重量を記録し、すぐに分注サンプルを液体窒素に入れます。

植物材料の解凍を避けるために、この手順を迅速に実行してください。分注したサンプルは、さらに抽出するまで摂氏マイナス80度で保存します。抽出の準備をするには、添付の文書に記載されているように調製したメチルtert-ブチルエーテル、またはMTBEメタノール抽出混合物をマイナス20°Cの冷凍庫で予冷します。

分注したサンプルを取り出し、予冷した抽出混合物を各サンプルチューブに1ミリリットル加えます。この手順を迅速に実行します。MTBEは粘度が低く、ピペットチップから滴り落ちることがあります。

抽出混合物内で組織が十分に均質化されるまで、ボルテックスミキサーで各サンプルをすぐに混合します。すべてのサンプルが抽出されるまで、チューブをベンチのラックに保管してください。この手順は重要です。

ここでは、タンパク質を沈殿させ、それらの酵素活性を不活性化します。すべてのサンプルをオービタルシェーカーで100 RPMで45分間、摂氏4度でインキュベートします。次に、氷冷超音波浴でサンプルを15分間超音波処理します。

次に、相分離による分画には、水とメタノールの3対1の溶液を各サンプルチューブに650マイクロリットル加えます。その後、1分間ボルテックスして混合します。サンプルを20, 000倍gの速度で摂氏4度で5分間遠心分離します。

このステップの後、2つの液相が混ざらないように、また沈殿したペレットを乱さないように、チューブを慎重に取り扱ってください。この段階では、チューブの底に固体ペレットを持つ2つの許容可能な液相があります。非極性上層相には脂質が含まれています。

下部水相には、極性および半極性代謝産物が含まれています。ペレットには、タンパク質、デンプン、および細胞壁が含まれています。上部脂質含有相から500マイクロリットルの溶媒を標識された1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

その後、200マイクロリットルのピペットで、残った脂質相を丁寧に取り除いて捨てます。次に、下相から400マイクロリットルの溶媒を標識された1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。200マイクロリットルの追加アリコートをマイクロフュージチューブに移し、ガスクロマトグラフィーベースの代謝物分析などのさらなる分析を行います。

余分な容量をピペッティングして、残りの水相を取り除き、廃棄します。次に、得られたタンパク質-デンプン-細胞壁ペレットを洗浄するために、500マイクロリットルのメタノールを加え、次いでそれを1分間ボルテックスする。サンプルを10, 000倍gの速度で摂氏4度で5分間遠心分離します。

窒素フローエバポレーターを使用して脂質サンプルから溶媒を蒸発させ、脂質の酸化的修飾を回避します。得られた乾燥サンプルは、すぐに分析する必要があります。水性サンプルから溶媒を加熱せずに真空濃縮器で一晩蒸発させます。

乾燥した水性サンプルは、摂氏マイナス80度で数週間保存してから分析できます。乾燥した脂質画分を7〜3個のアセトニトリルと2-プロパノールの溶液の400マイクロリットルに再懸濁します。.十分な液体をガラスバイアルに移し、しっかりとキャップを閉めます。

次に、ガラスバイアルを摂氏4度の冷却オートサンプラーに入れます。サンプルあたり 2 マイクロリットルを注入し、毎分 400 マイクロリットルの流速で稼働する UPLC システムを使用して、摂氏 60 度に保持された逆相 C8 カラムで脂質を分離します。クロマトグラフィー分離には、添付資料の表 1 に記載されている移動相を使用してください。

150 から 1500 の電荷対質量比の質量範囲をカバーする適切な MS 装置を使用して、ポジティブイオン化モードとネガティブイオン化モードで質量スペクトルを取得します。1対1のUPLCグレードのメタノールを水に溶かした溶液の200マイクロリットルで極性相を再懸濁します。十分な液体をガラスバイアルに移し、しっかりとキャップを閉めます。

次に、ガラスバイアルを摂氏4度の冷却オートサンプラーに入れます。各サンプルから 2 マイクロリットルを注入し、毎分 400 マイクロリットルの流量で稼働する UPLC システムを使用して、摂氏 40 度に保持した RP C-18 カラムで代謝物を分離します。クロマトグラフィー分離には、添付資料の表 2 に示すパラメーターで移動相を使用してください。

50〜1500の質量電荷比をカバーする適切な質量分析計を使用して、ポジティブイオン化モードとネガティブイオン化モードでフルスキャン質量スペクトルを取得します。最後に、添付の文書に記載されているように、タンパク質の抽出、消化、および分析を行います。25 ミリグラムのシロイヌナズナの葉組織を採取、粉砕、抽出してから、3 つの分析 UPLC-MS プラットホームにかけました。

極性および半極性の一次代謝物および二次代謝物を、逆相C-18 UPLC-MSにより極性相から分析しました。上段のパネルに示した脂質のベースピーククロマトグラムと下段に示した半極性代謝物を、ポジティブイオン化モードで分析しました。各クロマトグラムの右上隅にある円グラフは、さまざまな化学クラスに割り当てられた同定された脂質と代謝物の数を示しています。

例えば、58種類の脂質がトリアシルグリセリド群に割り当てられ、上のグラフではTAGとして示されています。この画分から得られる糖や極性アミノ酸など、逆相材料上で良好な保持を示さない親水性の代謝物は、GCMSや親水性相互作用液体クロマトグラフィーなどの他の分析方法で分析できます。抽出から回収されたタンパク質は溶液中で消化され、ショットガンLCMSを使用して分析されました。

右上隅に示されている円グラフは、さまざまな生物学的プロセスに割り当てられた同定されたタンパク質の数を示しています。たとえば、268 個のタンパク質がローカリゼーション カテゴリに割り当てられました。要約すると、この例で使用されているようなサンプルから、200を超える脂質種、50の注釈付き半極性代謝物、および数千のタンパク質を日常的に同定できます。

さらに、この方法は、さまざまな組織、臓器、および細胞培養材料を使用して幅広い適用性を示しました。このビデオを見れば、1つのサンプルから最も重要な化合物を抽出し分析する方法を十分に理解できるはずです。この手順を試行する際には、すべてのサンプルを凍結し、材料を適切に粉砕し、分析グレードの溶媒と化学薬品を使用することが重要です。

この手順に従って、抽出されたサンプルの分子組成を決定するために、すべての分析方法を採用することができます。