根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

このイメージングシステムの全体的な目標は、共焦点蛍光顕微鏡を使用して、細胞内分解能で数日間にわたって植物器官の発達を観察することです。この方法は、多細胞生物の細胞が器官形成中に成長と増殖のパターンをどのように調整するかなど、植物の形態形成における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、セットアップが簡単で、プロフュージョンシステムなどのタイムラプスイメージングでよく使用される専門機器に依存しないことです。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、Littlejohn と Love が New Phytologist に掲載した論文で、葉組織内のイメージングに対するペルフルオロデカリンの利点が説明されているのを読んだときでした。まず、ガラスカッターを使用して、厚さ1mmのスライドから幅3mmのガラスストリップを作成します。次に、シアノアクリレート接着剤または両面テープを使用して、ストリップを新しいスライドの幅全体で約45ミリメートル離して固定します。

型として機能するために、同じ寸法の追加のスライドを作成します。次に、ガス透過性PDMSガムから同じ高さのガスケットを作成します。2枚目のスライドを少量の無水エタノールで濡らし、PDMSをスライド上に平らにしてガラスストリップの高さまで広げます。

次に、ブレードを無水エタノールで濡らし、余分なPDMSを切り取ります。エタノールで濡れたツールはPDMSに付着しないため、これは非常に重要です。次に、PDMSをストリップの高さまで再フラットします。

次に、苗と寒天スラブを保持するキャビティをPDMSに切り込みます。一貫したキャビティサイズを生成するために、perspecsから作られた特注の自家製カッターを使用しますが、代わりにかみそりの刃を使用することもできます。次に、外側の端をトリミングして、ガスケットの厚さを約2mmにします。

次に、PDMSガスケットのないスライドの上に、両方のガラスストリップにカバースリップを置きます。次に、カバーガラスの下のスペースに、スペースを満たすのに十分な量の温かい液化寒天培地の約1ミリリットルをピペットで入れます。寒天には、目的の実験化合物を含めることができます。

次に、チューブ内で少量のPFDを振とうして、一部のPFDを空気平衡化します。寒天が固まったら、約200マイクロリットルのPFDをPDMSガスケットにロードしますが、完全には充填しないでください。寒天スラブからカバースリップをはがし、PDMSゲルガスケットのウェルに合う形状にカットします。

寒天とガスケット壁の間に2〜4ミリメートルの隙間を空けます。次に、チャンバーを空気平衡化PFDで完全に満たします。重力性一次根を画像化するために、寒天スラブの表面にセルロース膜を物理的バリアとして使用します。

寒天スラブは、1.5%寒天ではなく0.8%寒天で柔らかくなければなりません。寒天ブロックとほぼ同じ寸法の膜の一部を切り取ります。次に、80%エタノールで滅菌し、自然乾燥させます。

乾燥したら、メンブレンを液体増殖培地に浸し、寒天表面に移します。まず、寒天の上に最大3本の苗を慎重に置きます。彼らのポジショニングは重要です。

子葉と胚軸は寒天の端にぶら下がっていて、PFDに浮かんでいる必要があります。苗木が大きすぎてチャンバーに収まらない場合は、丸めることができます。

次に、選択した対物レンズと一致する厚さのカバースリップを使用してチャンバーを閉じます。ガラスストリップに接触するように、端に沿ってそっと押します。別のスライドガラスを使用して、カバーガラスをそっと押し下げ、2つのガラスストリップに均等に載せるようにします。

次に、縦半分に切ったマイクロポアサージカルテープを使用してカバースリップを固定します。次に、標本を約30分ほど落ち着かせてからイメージングします。シロイヌナズナの苗をチャンバー用に準備するには、まず種子を70%エタノールで滅菌します。

そして、それらをサプリメントの培地に植えます。植えた種子を摂氏4度で2〜4日間層状にします。次に、植えた種子を摂氏22度に移し、毎日16時間の光サイクルで垂直に成長させます。

側根を画像化するには、植物を7〜10日間育ててから、イメージングチャンバーに移します。イメージングチャンバー内で生理学的速度で成長する側根は、30分ごとに記録されました。側根も、比較のために同じ培地の標準的なペトリプレート上で成長させました。

個々の根の成長率はどちらのセットアップでも大きく異なりますが、どちらの条件下でも範囲は同様でした。全体として、成長率は長さとともに増加しました。イメージングチャンバー内またはプレート上の植物の成長率は、成長の最初の27時間で区別がつきませんでした。

どちらのグループも、同じ平均側根の長さからスタートしました。原形質膜マーカーと微小尿細管マーカーを共発現する側根を、イメージングチャンバー内で1時間間隔でイメージングしました。根の位置は非常に安定しており、数時間の共焦点イメージングを可能にしました。

実験全体を通して、増殖の視覚的な指標が観察されました。分裂細胞では、前期前期バンド、有糸分裂紡錘体、およびフラモプラストをすべて同定することができました。3日間にわたって、イメージングチャンバー内の側根の成長は、最初の48時間ではペトリプレートと比較して有意差がありませんでしたが、72時間までに平均成長率は低下しました。

しかし、チャンバー内の根のかなりの割合は、72時間にわたってプレート上の根と同等の速度で成長しました。一度マスターすれば、すべてが順調に進めば、15分で2枚のスライドを作ることができます。このイメージングシステムを使用して薬理学的治療の効果を研究することは可能ですが、ウォッシュアウト実験には灌流システムなどの他のより複雑な方法が必要です。

開発後、この技術は、植物の形態形成を支える細胞イベントを追跡するための安価で簡単な方法を提供し、特にシロイヌナズナの側根における器官形成を共有する空間的要求の細胞エッジの役割を探求しました。