非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発

この方法は、先端成長植物細胞が細胞の物理的障壁をどのように貫通するかなど、植物細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、従来の顕微鏡下でマイクロメートルスケールのギャップで細胞の変形プロセスを再構築する高解像度の画像を取得できることです。成長している花粉管とコケプロトネマタを調べるための装置を作るには、まず約11グラムのPDMSを作成し、それを4インチの型にロードします。

その後、真空チャンバー内で金型を20分間脱気します。次に、型を摂氏65度で90分間硬化させます。硬化したら、PDMS層を金型から剥がし、生検パンチツールを使用してPDMS内のチャネルへのアクセス穴を開きます。

次に、PDMSと5cmのガラス皿を空気プラズマに50秒間さらします。マイクロ流体ネットワークを密閉するには、PDMS層をガラス皿に押し付け、摂氏65度で30分間硬化させます。根毛検査用に設計されたマイクロデバイスを作るには、2つの型を装填して硬化させます。

チャンネル穴を開けるときは、2mmのパンチを使用してください。両方の層を空気プラズマに50秒間さらした後、実体顕微鏡でカバーガラスを含めて結合します。これを実現するには、カスタムメイドのアライナーツールを使用します。

アセンブリをオーブンで30分間硬化させ、マイクロ流体ネットワークを密閉します。硬化後、カバーガラスをデバイスから取り外し、5cmのガラス皿に移します。花粉管マイクロデバイスを使用する前に、真空チャンバー内で20分間脱気してください。

先端の細いマイクロピペットを使用して、雌しべ入口に増殖培地を追加します。他のウェルにも同じ媒体をロードします。チャネルがいっぱいになるまで数分待ちます。

その間、湿らせたペーパータオルを皿に入れて、地域の湿度を維持します。次に、T.fournieriの青と白の花から花粉粒を集めます。解剖針を使用して粒子を柱頭に移します。

次に、長さ1cmの受粉スタイルを縦にカットし、次にカットスタイルをマイクロ流体デバイスの入口に挿入します。カットスタイルをピンセットでマイクロ流体デバイスの入口に挿入する場合、スタイルを損傷する可能性があるため、スタイルを強く保持しないことが重要です。次に、テープを使用して皿に蓋を固定し、皿を摂氏28度のインキュベーターに移し、5〜6時間暗闇に置いておく必要があります。

層流フードの下で作業し、トランスジェニックA.thaliana Columbia種子の滅菌から始めます。それらを洗浄液に5分間浸します。次に、オートクレーブ水で種子を十分にすすぎます。

滅菌したら、種子を摂氏4度で暗所に48時間保管します。数日後、マイクロデバイスを使用する前に20分間脱気してください。次に、先端が細かくついたピペットを使用して、適切な増殖培地をデバイスのウェルにロードし、溶液がすべてのチャネルに引き出されるまで数分待ちます。

また、湿らせたペーパータオルを皿にセットして湿度を保ちます。次に、準備したシードをデバイスの入口に移します。次に、テープを使用して蓋を固定し、連続光で摂氏22度のインキュベーターに皿を移します。

使用する前に、マイクロデバイスをUV下で一晩滅菌してください。翌日、マイクロデバイスを20分間ガス抜きします。脱気したら、マイクロウェルに適切な増殖培地をロードします。

チャネルが徐々に満たされる間、湿度を維持するために、マイクロデバイスをオートクレーブ水で囲みます。コケプロトネマタ組織の小片をマイクロデバイスの入口に移します。次に、連続光の下でデバイスを摂氏25度で培養します。

成長が2〜3週間後、顕微鏡で結果の明視野画像を撮影します。先端成長植物細胞は、土壌中の根毛の経路は言うまでもなく、生体内での伝播経路やマイクロパイルなど、成長経路に沿って一連の物理的障壁に遭遇します。今回紹介するマイクロ流体in vitro細胞培養プラットフォームは、花粉管、根毛、コケプロトン体という3種類の植物細胞の先端成長過程の検討を可能にします。

表示は、デバイスの1ミクロンのギャップを通じて実現されます。このサイズのマイクロギャップは壊れやすいため、特に繰り返し使用すると閉じてしまうことがあります。したがって、実験を実行する前に、ギャップが損なわれていないことを確認することが重要です。

花粉管研究では、生細胞イメージングを用いて、花粉管の頂端領域の形態変化をモニタリングするとともに、非常に小さな空間に遭遇した場合に反応した栄養核や精子細胞の形態変化をモニターしました。この技術は、開発後、植物細胞生物学の研究者が、花粉管、根毛、コケプロトンネマなどの先端成長植物細胞の伸長能力を非常に小さなスペースで探求する道を開きました。