高スループットとのマルチパラメトリック定量化のための2個のアルゴリズムショウジョウバエ神経筋接合部形態

この手順の全体的な目標は、形態測定ソフトウェアマクロを使用して、ショウジョウバエの神経筋接合部の形態学的特徴を自動的に定量化することです。この方法は、神経生物学の重要な問題であるシナプス発生の調節因子を特定するのに役立ちます。この手法の主な利点は、複数のNMJ特徴の自動定量化です。

これにより、NMJの形態を高スループットで客観的に解析することができます。私たちは、大量の疾患モデルでNMJの形態を調べることができるように、この方法論を開発することにしました。私たちは、彼らの個人的な違いを防ぐ方法と、定量化プロセスを大幅にスピードアップする方法を考えました。

この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に役立ちます。適切なマクロ設定が重要であり、特にVTソフトウェアに慣れていない新規ユーザーにとっては、一部の手順が難しい場合があります。このプロトコルでは、NMJの画像スタックを生成し、それらを個々のTIFFファイルとして保存します。チャネル1はDLG1染色または同様のマーカーを示し、チャネル2はBRP染色を示します。

まず、NMJ画像ファイルのCプロジェクションとハイパースタックを作成します。プラグインオプションを開き、ショウジョウバエNMJ Morphometricsを選択します。次に、顕微鏡が画像シリーズをTIFFとして保存するときに画像シリーズに割り当てた一意のファイル文字列を特定します。

これは画像名の末尾にあります。最も小さい平面とチャネル番号に指定された文字列をコピーして、一意のファイル文字列設定ウィンドウに貼り付けます。次に、サブマクロ [スタックに変換] を選択し、画像が配置されているディレクトリまたはフォルダーを選択します。

イメージ ファイルごとに、デフォルト名 stack と flat stack という 2 つの新しいファイルが作成され、その後に元のイメージ名が続きます。その後、元のファイルを削除してストレージスペースを節約できます。次に、ショウジョウバエ NMJ Morphometrics インターフェースから Define ROI サブマクロを選択し、画像ファイルディレクトリを選択します。

最初の投影が開いたら、フリーハンド選択ツールを選択します。次に、マウスを使用して、対象の完全な NMJ ターミナルを含む領域を定義します。選択したら、ターミナルの定義ウィンドウでOKをクリックします。

すべての投影法で NMJ 端子が定義されるまで、この操作を続けます。マクロはプロセスを自動的に進行させます。イメージ ファイルごとに、デフォルト名 ROI とそれに続く元のイメージ名で 1 つの新しいファイルが作成されます。

NMJの特徴を定量化するには、まずショウジョウバエのNMJ Morphometricsインターフェースに移動し、スケールを設定します。たとえば、画像内の 1 つのピクセルが 0.72 ミクロンに対応する場合、スケール ピクセルを 1 に、スケール距離を 0.072 に設定します。次に、サブマクロのanalyzeを選択し、2つのチャネル画像がある場合は、重みも切り替えます。

[OK]を押し、プロンプトが表示されたら、イメージファイルディレクトリを選択します。処理時間は、シナプスあたり数分になる場合があります。解析後、解析された各シナプスの新しい画像ファイルが親フォルダに保存され、定量的な測定値が結果となります。

txt ファイル。すべての画像を調べ、セグメンテーションエラーのある画像を除外します。たとえば、シナプス末端の一部が黄色のアウトラインに含まれていない場合があります。

背景の一部がシナプス終末に含まれる場合があります。青いスケルトンラインがシナプス末端を超えて伸びる場合があります。アクティブ ゾーンが多すぎるか、一部のアクティブ ゾーンが検出されないままになっている可能性があります。

セグメンテーションエラーが5%を超える画像の場合は、画像処理を改善するためにさまざまな分析アルゴリズムを検討してください。今後のビデオ セクションでは、これらのマクロ分析設定の多くを定義する方法について説明します。マクロの転がり球の半径値を調整するには、イメージ データ セットを代表する 3 つの NMJ Z 投影を選択します。

結果解像度イメージ名と、サブマクロ分析によって以前に作成された 2 つのアクティブ ゾーン スタック イメージ名を削除します。選択した各画像のスタック イメージ名ファイルを開き、ツールバーから分割チャネルを選択してチャネル 1 のイメージとチャネル 2 のイメージを作成し、これらのファイルを保存します。チャネル1(この場合はDLG one免疫標識に対応する)に属する画像を開きます。

次に、プロセスタブの下にあるフィルターsubtract backgroundを実行します。ローリングボールの半径を、シナプスと背景のコントラストが増加する値に設定します。投影タイプを最大強度として Z 投影を作成し、画像を保存します。

次に、すべての Z 投影で新しいローリング ボール半径を使用して背景減算アルゴリズムを実行し、結果を保存します。マクロの最適な自動しきい値を決定するには、保存した C 投影法を開き、[すべて試行] オプションを指定して [自動しきい値] を実行します。結果の画像から、画像に最適なアルゴリズムを見つけ、そのしきい値設定を使用してマクロをさらに実行するときに続行します。

さまざまな自動しきい値を定義するには、マクロによる適切な画像セグメンテーションが重要です。このため、8つのサイネージパラメータを適切に定量化するためには、ソフトウェアが提供する16の自動しきい値オプションに精通していることが重要です。プラスボタンを押して、自動しきい値の結果画像にズームインします。

アルゴリズム名は、各結果画像の下にあります。この例では、NMJ アウトラインしきい値の設定に最適な自動しきい値アルゴリズムは Huang です。スケルトンしきい値の場合、最適な設定は Li で、アクティブ ゾーンしきい値の最適な設定は Huang です。

マクロの細かい最大ノイズ許容値を定義するには、元の代表的なNMJ画像に戻ります。BRP チャネルを開きます。ポップアップメニューのプラグインタブに移動し、最大3Dを選択します。

しばらくすると新しい画像が表示され、元の画像を閉じます。次に、最小の 3D コマンドを使用します。次に、C2 stacks synapse one イメージの最大数を閉じ、新しく作成したイメージの最小値である max C2 stack synapse one を選択します。

次に、find maxima コマンドを使用します。新しいウィンドウで、プレビューポイント選択を選択し、ノイズ許容値を50に設定します。次に、最大点は小さな十字で示され、シナプスのアクティブゾーンのみをカバーする必要があります。

交差が多すぎる場合は、ノイズ許容値を増やします。一部のアクティブゾーンに注釈が付けられていない場合は、ノイズ許容値を小さくします。マクロの [ノイズ許容誤差の最大値を見つける] フィールドに派生したしきい値を使用します。

最大ノイズ許容値を選択するには、アクティブゾーンの数を適切に定量化することが重要です。適切な値を定義するために、さまざまな値を試す必要がある場合があります。次に、マクロ インターフェイスのしきい値アルゴリズムで派生したすべての値を調整し、マクロ設定の定義に最初に使用された代表的な画像に対してサブマクロ解析を実行します。

白い点で示されたアクティブゾーンを持つ新しいファイルが作成されます。このファイルを開くには、ツールバーにドラッグアンドドロップし、投影タイプをスライスとしてZプロジェクトを選択します。このようにして、プロジェクションファイルが作成されます。

次のステップは、しきい値を調整することです。新しいしきい値ウィンドウで、上部のバーをスライドして、必要なすべての焦点が読み取られるしきい値を選択します。これらはBRPの肯定的な点です。

この値を BRP puncta 下限しきい値として使用します。次に、以前に定義した値、アルゴリズム、新しい BRP puncta 下限しきい値を使用して、元の代表的な NMJ 画像で解析を再実行します。結果として得られる画像は、クリティカル分析の基準を満たす必要があります。

次に、定義設定を使用して、同じ条件下で取得されたすべてのNMJ画像に対してマクロを実行します。ショウジョウバエNMJ形態測定マクロを使用して、3つの変異遺伝子型におけるさまざまな既知のシナプス欠損を検証しました。アンキリン2の変異体は、ブートンとより小さなNMJを融合させることが知られています。

マクロを使用して、パヌロニルとクイリンの2つのRNAIノックダウンNMJの面積と周囲を測定し、対照よりも有意に小さいことがわかりました。GTPase Rab3は、適切なブルックピラの分布に必要です。中断されると、アクティブなゾーンは少なくなります。

マクロパヌロニルRab 3ノックダウンフライを使用した場合、NMJ端末あたり平均138のアクティブゾーンがあったのに対し、対照群では290個検出された。ハイワイヤーはNMJの成長の重要な調節因子であり、変異したNMJはその末端で分岐が延長されます。マクロパヌロニルハイワイヤーRNAIノックダウンラインを使用すると、全長、最長分岐長、分岐数、分岐点数など、いくつかのスケルトン由来のNMJパラメータに有意な増加が見られました。

このビデオを見た後、ショウジョウバエNMJモルフォメトリクスマクロの操作方法と設定の調整方法をよく理解しているはずです。一度習得すれば、50のシナプスの解析を1時間以内に行うことができます。これにより、シナプスあたりの定量化時間が約15分短縮されます。

NMJの高品質な画像を取得することが重要です。画像が優れているほど、マクロのパフォーマンスが向上します。この技術は、神経生物学分野の研究者がショウジョウバエNMJの形態学的パラメータを効率的に定量化するのに役立ちます。