Name: 高スループットとのマルチパラメトリック定量化のための2個のアルゴリズムショウジョウバエ神経筋接合部形態 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 学ぶDrosophila神経筋接合部の形態学的特徴を自動定量化する画像解析アルゴリズム。高スループット解析でシナプス発達調節因子の同定を効率化し、客観的で再現性のある結果を提供します。

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我々はショウジョウバエ株を提供するためのウィーンショウジョウバエリソースセンターとブルーミントンショウジョウバエストック・センター（NIH P40OD018537）を認めます。私たちは、イメージングの専門家支援のための顕微鏡的イメージングセンターからジャック・フランセン感謝します。この研究は、ドイツの精神遅滞のネットワークにより、2 DCN /ラートボウト大学医療センターの博士フェローシップによって、VIDIおよび科学研究費オランダ機構（NWO）からTOP助成金（917-96-346、912-12-109）によってサポートされていました教育研究（BMBF）のドイツ連邦環境省のNGFN +プログラムによっておよびASへの欧州連合（EU）のFP7の大規模な統合ネットワークGencodys（HEALTH-241995）によって資金を供給。資金提供者は、研究デザイン、データの収集と分析、公表することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていました。

<ol><li>Lin, Y. C., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+synapse+and+dendrite+maintenance+and+their+disruption+in+psychiatric+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).</li>
<li>van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+epigenetic+networks+in+intellectual+disabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities.</a> Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).</li>
<li>Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+vulnerability+of+synapses+and+circuits+associated+with+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders.</a> J Neurochem. 126, 165-182 (2013).</li>
<li>Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+dendritic+structure+on+firing+pattern+in+model+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons.</a> Nature. 382, 363-366 (1996).</li>
<li>Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+form+to+function%3A+calcium+compartmentalization+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).</li>
<li>Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+action+potentials+in+dendrites+depends+on+dendritic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology.</a> J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).</li>
<li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 22, 383-388 (2012).</li>
<li>Mehnert, K. I., Cantera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+the+morphology+of+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila.</a> Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).</li>
<li>Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).</li>
<li>Ruiz-Canada, C., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+on+the+use+of+the+Drosophila+embryonic%2Flarval+neuromuscular+junction+as+a+model+system+to+study+synapse+development+and+function%2C+and+a+brief+summary+of+pathfinding+and+target+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).</li>
<li>Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).</li>
<li>Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gain-of-function+screen+for+genes+controlling+motor+axon+guidance+and+synaptogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila.</a> Curr Biol. 11, 417-430 (2001).</li>
<li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li>
<li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34, 729-741 (2002).</li>
<li>Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+suppressors+of+Drosophila+NSF2+neuromuscular+junction+overgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth.</a> Genetics. 170, 779-792 (2005).</li>
<li>Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highwire+restrains+synaptic+growth+by+attenuating+a+MAP+kinase+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal.</a> Neuron. 51, 57-69 (2006).</li>
<li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Fiji-Based+Algorithm+That+Systematically+Quantifies+Nine+Synaptic+Parameters+Provides+Insights+into+Drosophila+NMJ+Morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry.</a> PLoS Comput Biol. 12, e1004823(2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Dubos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+depletion+of+intellectual+disability+and+Parkinsonism+candidate+gene+ATP6AP2+in+fly+and+mouse+induces+cognitive+impairment+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration.</a> Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).</li>
<li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNijhof%2C+B+%22Drosophila+NMJ+Morphometrics%22">Drosophila NMJ Morphometrics</a>. , figshare 
 
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.
">https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.
</a> (2017).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide+IJ+1.46%22">ImageJ User Guide IJ 1.46</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html</a> (2014).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide+IJ+1.46%22">ImageJ User Guide IJ 1.46</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://fiji.sc/Auto_Threshold">http://fiji.sc/Auto_Threshold</a> (2014).</li>
<li>Pielage, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+presynaptic+giant+ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+of+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58, 195-209 (2008).</li>
<li>Koch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ankyrin+2+is+required+for+synaptic+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability.</a> Neuron. 58, 210-222 (2008).</li>
<li>Iqbal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+and+heterozygous+disruptions+of+ANK3%3A+at+the+crossroads+of+neurodevelopmental+and+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders.</a> Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).</li>
<li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).</li>
<li>Wan, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highwire+regulates+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Highwire regulates synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 26, 313-329 (2000).</li>
<li>Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+maturation+and+maintenance+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).</li>
<li>Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-type+specific+functions+of+DNT1%2C+DNT2+and+Spz+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PLoS One. 8, e75902(2013).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100(2006).</li>
</ol>

著者は、開示する利害の衝突を持っていません。

「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」と「 ショウジョウバエ NMJブトン形態計測は、」シナプスの形態を評価することに興味を持って研究者のための強力なツールです。 NMJのパラメータの手動評価は面倒です。それはマクロが15分に経験豊富な研究者を救うであろうと推定されている/ NMJは、手動画像セグメンテーションに費やしました。条件または遺伝子型ごとに評価したシナプスの1〜2ダースで、これはすぐにでも小規模の研究では、保存された時間のかなりの量を合計します。大画面を行う場合、手動評価および定量化に比べ、ハイスループット分析を使用しての利得は、巨大であり得ます。スループットの向上に加えて、マクロが容易に客観的な分析を提供すること。彼らは、そうでない場合は盲目の実験と同様に、複数の研究者が分析に関与しているときに発生する対人の違いを必要とする個人的な偏見を除外します。最後に、マクロは敏感かつ正確なANを提供します劇的なNMJ欠陥よりもむしろ微妙な原因と、これまで研究者の目によって正しく評価されていない残っているシナプス制御因子の同定を可能にするNMJの機能のalysis、。検証手順およびマクロに利用するアルゴリズムについての詳細な情報は、パブリケーションNijhof らに見出されます。 17。 マクロの機能が適切に引き続き筋肉4.でキイロショウジョウバエのNMJの形態学的特徴を測定することが確認されている、それはマクロもこの生物において他の筋肉でシナプスを分析するのに適したことが示されました。マクロは、他のショウジョウバエの種、さらに昆虫を含む他の種で同様の構造を持つNMJの形態学的パラメータを測定するために使用することができる可能性が高いです。進化では非常に遠くでものNMJ、 例えば、マウスののNMJは、非常に似た構造の立体構造29を示し、。マクロは、他の種からのNMJの準備でテストされていないが、潜在的なユーザーは、このような目的のためにマクロをテストすることをお勧めします。 ユーザーが画像に適したマクロ設定を選択/定義するためにさまざまな自動しきい値とアルゴリズムを探ることが非常に重要です。マクロ評価は手動評価と比較した場合、これらの設定で、約95％の精度が達成されます。適切に画像のセグメント100％が非常に面倒又は不可能でさえ処置することができるマクロ設定を調整します。その数は5％以下である場合はそのため、適切にセグメント化されていない画像の排除が推奨されます。画像の品質が低い場合には明らかに、マクロが不十分な画像セグメンテーションのより高い比率を生成します。低品質の画像は、同様に手動評価に影響を与えることになるので、マクロのパフォーマンスにリンクすることはできません。彼らは画像のために設計されたとしてもかかわらずマクロはかなり頑丈です高含量顕微鏡17（多数のサンプルのイメージングを可能にする自動化蛍光顕微鏡）で生成されたS。 重要な点は、ユーザーが視覚的にマクロによって生成されたすべての結果の画像を検査ということです。これは不満足なセグメンテーションと一緒に写真を検出して排除することができます。このプロトコルのセクション6において、ユーザは、「分析」サブマクロを実行するときに正しい画像セグメンテーションのための設定を調整する方法を案内されます。すぐにマクロの要件とどのようにマクロの設定「マクロの設定をExamples_adjusting」というフォルダを調整することで理解するには、マクロリポジトリhttps://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2aに含まれています。サーティーンサブフォルダ、異なる顕微鏡プラットフォーム（高含有量/共焦点/蛍光顕微鏡）と異なる免疫染色で得られた実施例の画像とのそれぞれが、設けられています。 「例のガイド」と題されたPDFを同じに含まれています各実施例に必要な設定が期待結果と結果の画像を提供するテキストドキュメントとともに提供されるフォルダー。 マクロが.TIFFファイルを分けて保存された画像を処理するように設計された、それにもかかわらず、一部のユーザーは、さまざまな形式で自分の画像を保存している場合があります。ドキュメントのマクロに画像をインポートする方法の詳細な手順で「例ガイド」 -以下のウェブサイトhttps://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21は、3つのサンプルファイル（3例1）「 ショウジョウバエ NMJ」という名前のフォルダが含まれています.TIFF分離したファイルとして保存されていない場合も、同じフォルダに格納されています。 NMJ面積、NMJ周囲長、終末の数、NMJのブトンエリア、NMJ長、NMJ最長支店長、イスラの数：一緒に、「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」と「 ショウジョウバエ NMJブトン形態計測」マクロは10種類のNMJの機能を定量化NDS、分岐の数、分岐点の数とアクティブなゾーンの数。これは、1つまたは少数のシナプス機能30、31を評価することができ、これまでに利用可能なツール上で大きな利点を提供します。マルチパラメトリック定量分析は、シナプスの生物学の多くの側面までの1を制御する新たな規制当局を特定するために、例えば 、新たな発見のための大きな可能性を負いません。それはまた、全く同じ又は重複NMJ機能をcoregulate、したがって共通の分子経路で動作する可能性がある遺伝子を決定するために必要な解像度を提供します。最後に、シナプスのパラメータは、遺伝子は、このような協調形態学的相関を確保邪魔されずに条件17とで相互に関連付ける方法を異なる調査する可能性を開きます。 まとめると、このプロトコルは、「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」二つのマクロを使用する方法を説明し、ハイスループット様式で10の形態素NMJ機能の客観的かつ高感度定量を行う「 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測」、。

このような知的障害、自閉症スペクトラム障害と統合失調症の認知障害は、しばしば異常なシナプス機能1、2、3によって特徴付けられます。シナプスの形態および機能がしっかり絡み合っています。形態学的欠陥は、シナプス機能不全を引き起こす可能性があり、逆に、異常なシナプス伝達は、シナプスの成熟および形態4、5、6に影響を与えます。 モデル生物の数は、よりよいシナプス生物学を理解し、シナプスの変化が健康と病気7、8、9での脳機能にどのように影響するかに光を当てるために使用されてきました。 ショウジョウバエ NMJはグルタミン酸SYのために広く研究およびin vivoモデルで十分に確立されていますnapse生物学10、11。過去数十年間では、このモデルはのNMJ間の形態学的な差を検出する目的で、だけでなく、大規模な遺伝子スクリーニングのために、生理学的および遺伝子に焦点を当てた研究のために使用されてきました。具体的には、フォワード遺伝子スクリーニングは、シナプスの開発の根底にある多くの重要な調節因子および機構を特定し12、13、14、15、16として機能しています。しかしながら、これらの画面のほとんどはNMJ端子形態の視覚的評価に及び定性的なシナプスの異常の検出または少数形態学的特徴の半定量的スコアに依存していました。その結果、人間の目には非自明ではなく、微妙なシナプスの形態異常を見逃しやすいです。総合的に定量的な差を検出できるようにするために、NMJは正確に関心の形態学的パラメータを系統的に定量化して評価する必要があります。手動NMJの機能を測定することは、いくつかのNMJ関心の特徴および/または大規模な遺伝的スクリーニングを実行するときがある場合は特に、面倒です。マルチパラメトリック、ハイスループット形態素解析をサポートするため、客観定量化を達成するために、2つのマクロ「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」と「 ショウジョウバエ NMJブトン形態計測は、」17を開発しました。両方のマクロは、オープンソースの画像解析ソフトウェアフィジー18で実行され、共焦点および非共画像の両方を定量化することができます。 「ショウジョウバエ NMJ形態計測」対策後シナプスマーカーディスク大-1（はDlg-1）又はシナプス前西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で免疫染色NMJ端子、アクティブゾーンマーカーbruchpilot（BRP）で同時標識しました。これは、9形態学的parameを定量化TERS（さらに後述する）：NMJ面積、NMJ境界、終末の数、NMJ長、NMJ最長枝長、島の数、分岐の数、分岐点とシナプス末端における活性なゾーンの数の数（ 図1） 。終末の数を決定するためのアルゴリズムは、このマクロに存在しているが、精度17の基準を満たしませんでした。適切終末の数を評価するために、具体的には、抗シナプトタグミン（SYT）または抗システインストリングタンパク質（CSP）によって免疫染色NMJ製剤を用いて終末を定量化するために設計された「 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測」マクロを使用する必要があり、そしてBRPとの共免疫標識。終末の数、NMJのブートン領域、NMJ長、NMJ最長枝長、島の数、分岐の数、分岐点の数および活性ZOの数：「ショウジョウバエ NMJブートン形態計測」マクロは、以下のパラメータを定量化NE（ 図2）。 マクロは、3つのサブマクロから成る：（I）「スタックに変換」は、すべての利用可能な画像ファイルを識別し、Z-hyperstacksと両チャンネルの最大強度投影を作成します。出力として、このマクロは、「stack_image_name」と「flatstack_image_name」と呼ばれるシナプスごとに2つの新しいファイルが生成されます。 II）連続して、すべての最大投影像「flatstack_image_name」を開き、手動で関心のある特定のシナプスの端末が存在する関心領域（ROI）を定義するための要求でそれらを提示する「ROIの定義」。これは、隣接する筋肉及び/又は画像11に存在することができる（例えば1秒など）シナプス末端の他のタイプに接続するシナプスの排除を可能にするために実施されました。 （III）ROIの境界内の画像のすべての領域に完全に自動化された分析を適用し、「分析」。として全ての数値測定が注釈されます「RESULTS.TXT」とマクロによって生成される基礎となる画像セグメンテーションを説明する「res_image_name.tif」：このステップの結果、ユーザは、2つの新しいファイルを取得します。 NMJアウトライン、NMJ骨格、およびBRP-正極活ゾーンの数：画像解析中に3つの構造は、各シナプス末端から誘導されます。 NMJ輪郭はNMJ面積およびその周囲を決定するために使用され、その後の流域の分離は、終末の数を提供します。スケルトンから、5つのNMJの機能が推定される総NMJ長さ、任意の2つのエンドポイントを結ぶ連続最長パスの長さの和（最長分岐長）、NMJ当たりの未接続区画の数（「島」と呼ばれます）、分岐の数、分岐点（一方の分岐点が3つ以上のブランチを接続）の数。アクティブなゾーンの数をカウントすることによってBRPチャネルに決定されますBRP-陽性スポット。 （注釈付きNMJ輪郭（黄線）、NMJ骨格（青線）、及び（白病巣で示す）BRP-正極活ゾーンの数は、結果画面に表示され、パラメータの測定をするために処理されます。 TXT）出力ファイル（ 図3）。 ショウジョウバエ NMJ形態計測」および『 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測はショウジョウバエ NMJ形態計測『および『 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測』』最初に説明し、広範囲Nijhof ら 17によって検証した。この論文は、マクロを使用して、NMJの形態を分析する方法に焦点を当てて』。それにもかかわらず、マクロ支援分析、NMJ解剖および免疫染色の前に実行する必要がある。これらは重要なステップであり、そして免疫組織化学のために使用されるマーカーの組み合わせは、マクロ分析に適していることが必要である。これらの手順は簡単にSEに記載されていますこのプロトコルのction 1及びこれらの手順を実行するために詳細にプロトコルを記述参照にユーザーを導きます。

<table><tbody><tr><td>Immunostaining</td><td></td><td></td><td> Dilution</td></tr> <tr><td>Mouse anti-discs large 1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AFFN-DLG1-4D6</td><td>1/25 (Conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)</td></tr><tr><td>Rabbit anti-horseradish peroxidase</td><td>Jackson IR</td><td>323-005-021</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Synaptotagmin</td><td>ヒューゴ・ベレン</td><td></td>からの贈り物 <td>Jan-00</td></tr><tr><td>マウス抗システインストリングタンパク質</td><td>発達研究 ハイブリドーマバンク</td><td>DCSP-1(ab49)</td><td>1/10 (Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kitを使用して結合)&nbsp;</td></tr><tr><td>マウス 抗ブルッフパイロット</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Jan-50</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス Alexa Fluor 488</td><td>Life technologies</td><td>A11029</td><td>1/200</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 568</td><td>Life technologies</td><td>A11011</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 568 マウス IgG1 ラベリングキット</td><td>ThermoFisher</td><td>Z25006</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止マウンタント</td><td>サーモフィッシャー</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>材質</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡</td><td>Leica SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio イメージャー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンピューターMac</td><td>またはPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高スループットとのマルチパラメトリック定量化のための2個のアルゴリズム<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;神経筋接合部形態

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

シナプスの形態は、シナプス伝達効率に緊密に関連しており、多くの場合、形態学的シナプスの欠陥は、最終的にシナプス機能不全につながります。 ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部（NMJ）、グルタミン酸作動性シナプスのための十分に確立されたモデルは、広範囲に数十年にわたって研究されてきました。 NMJの形態学的欠陥を引き起こす変異の同定は、シナプスの発達および機能を調節する遺伝子のレパートリーを明らかにしました。これらの多くは、 ショウジョウバエ NMJの形態異常を検出するための定性的なアプローチに焦点を当てた大規模な研究で同定されました。定性分析の欠点は、NMJの形態に貢献し、多くの微妙な選手がそう見過ごされたままということです。定量分析は、微妙な形態学的差異を検出するために必要とされるのに対し、彼らが面倒であるため、このような分析はまだ一般的に行われていません。このプロトコルは、「詳細にショウジョウバエ 2つの画像分析アルゴリズムを説明します</emフィジー互換マクロとして入手&gt; NMJ形態計測」および『 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測』、 ショウジョウバエ NMJの、定量的な正確かつ客観的形態計測分析のために。この方法は、一般的に使用されるマーカーはDlg-1で免疫NMJ端子を分析するために開発されBRPさらに、例えばHRP、CSPとSYTなどの他のマーカーへの広い適用は、このプロトコルで提示されているマクロは、9つの形態学的NMJの機能を評価することができる：NMJ面積、NMJ境界、終末の数、NMJ長、NMJ最長分岐長さ、島の数、分岐の数、分岐点及びNMJ端子にアクティブなゾーンの数の数。

二つの画像解析アルゴリズム、「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」および「 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測を」自動的ショウジョウバエ神経筋接合部（NMJ）の9つの形態学的特徴を定量化するために、 作成されました 。

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

この手順の全体的な目標は、形態測定ソフトウェアマクロを使用して、ショウジョウバエの神経筋接合部の形態学的特徴を自動的に定量化することです。この方法は、神経生物学の重要な問題であるシナプス発生の調節因子を特定するのに役立ちます。この手法の主な利点は、複数のNMJ特徴の自動定量化です。これにより、NMJの形態を高スループットで客観的に解析することができます。私たちは、大量の疾患モデルでNMJの形態を調べることができるように、この方法論を開発することにしました。私たちは、彼らの個人的な違いを防ぐ方法と、定量化プロセスを大幅にスピードアップする方法を考えました。この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に役立ちます。適切なマクロ設定が重要であり、特にVTソフトウェアに慣れていない新規ユーザーにとっては、一部の手順が難しい場合があります。このプロトコルでは、NMJの画像スタックを生成し、それらを個々のTIFFファイルとして保存します。チャネル1はDLG1染色または同様のマーカーを示し、チャネル2はBRP染色を示します。まず、NMJ画像ファイルのCプロジェクションとハイパースタックを作成します。プラグインオプションを開き、ショウジョウバエNMJ Morphometricsを選択します。次に、顕微鏡が画像シリーズをTIFFとして保存するときに画像シリーズに割り当てた一意のファイル文字列を特定します。これは画像名の末尾にあります。最も小さい平面とチャネル番号に指定された文字列をコピーして、一意のファイル文字列設定ウィンドウに貼り付けます。次に、サブマクロ [スタックに変換] を選択し、画像が配置されているディレクトリまたはフォルダーを選択します。イメージ ファイルごとに、デフォルト名 stack と flat stack という 2 つの新しいファイルが作成され、その後に元のイメージ名が続きます。その後、元のファイルを削除してストレージスペースを節約できます。次に、ショウジョウバエ NMJ Morphometrics インターフェースから Define ROI サブマクロを選択し、画像ファイルディレクトリを選択します。最初の投影が開いたら、フリーハンド選択ツールを選択します。次に、マウスを使用して、対象の完全な NMJ ターミナルを含む領域を定義します。選択したら、ターミナルの定義ウィンドウでOKをクリックします。すべての投影法で NMJ 端子が定義されるまで、この操作を続けます。マクロはプロセスを自動的に進行させます。イメージ ファイルごとに、デフォルト名 ROI とそれに続く元のイメージ名で 1 つの新しいファイルが作成されます。NMJの特徴を定量化するには、まずショウジョウバエのNMJ Morphometricsインターフェースに移動し、スケールを設定します。たとえば、画像内の 1 つのピクセルが 0.72 ミクロンに対応する場合、スケール ピクセルを 1 に、スケール距離を 0.072 に設定します。次に、サブマクロのanalyzeを選択し、2つのチャネル画像がある場合は、重みも切り替えます。[OK]を押し、プロンプトが表示されたら、イメージファイルディレクトリを選択します。処理時間は、シナプスあたり数分になる場合があります。解析後、解析された各シナプスの新しい画像ファイルが親フォルダに保存され、定量的な測定値が結果となります。txt ファイル。すべての画像を調べ、セグメンテーションエラーのある画像を除外します。たとえば、シナプス末端の一部が黄色のアウトラインに含まれていない場合があります。背景の一部がシナプス終末に含まれる場合があります。青いスケルトンラインがシナプス末端を超えて伸びる場合があります。アクティブ ゾーンが多すぎるか、一部のアクティブ ゾーンが検出されないままになっている可能性があります。セグメンテーションエラーが5%を超える画像の場合は、画像処理を改善するためにさまざまな分析アルゴリズムを検討してください。今後のビデオ セクションでは、これらのマクロ分析設定の多くを定義する方法について説明します。マクロの転がり球の半径値を調整するには、イメージ データ セットを代表する 3 つの NMJ Z 投影を選択します。結果解像度イメージ名と、サブマクロ分析によって以前に作成された 2 つのアクティブ ゾーン スタック イメージ名を削除します。選択した各画像のスタック イメージ名ファイルを開き、ツールバーから分割チャネルを選択してチャネル 1 のイメージとチャネル 2 のイメージを作成し、これらのファイルを保存します。チャネル1(この場合はDLG one免疫標識に対応する)に属する画像を開きます。次に、プロセスタブの下にあるフィルターsubtract backgroundを実行します。ローリングボールの半径を、シナプスと背景のコントラストが増加する値に設定します。投影タイプを最大強度として Z 投影を作成し、画像を保存します。次に、すべての Z 投影で新しいローリング ボール半径を使用して背景減算アルゴリズムを実行し、結果を保存します。マクロの最適な自動しきい値を決定するには、保存した C 投影法を開き、[すべて試行] オプションを指定して [自動しきい値] を実行します。結果の画像から、画像に最適なアルゴリズムを見つけ、そのしきい値設定を使用してマクロをさらに実行するときに続行します。さまざまな自動しきい値を定義するには、マクロによる適切な画像セグメンテーションが重要です。このため、8つのサイネージパラメータを適切に定量化するためには、ソフトウェアが提供する16の自動しきい値オプションに精通していることが重要です。プラスボタンを押して、自動しきい値の結果画像にズームインします。アルゴリズム名は、各結果画像の下にあります。この例では、NMJ アウトラインしきい値の設定に最適な自動しきい値アルゴリズムは Huang です。スケルトンしきい値の場合、最適な設定は Li で、アクティブ ゾーンしきい値の最適な設定は Huang です。マクロの細かい最大ノイズ許容値を定義するには、元の代表的なNMJ画像に戻ります。BRP チャネルを開きます。ポップアップメニューのプラグインタブに移動し、最大3Dを選択します。しばらくすると新しい画像が表示され、元の画像を閉じます。次に、最小の 3D コマンドを使用します。次に、C2 stacks synapse one イメージの最大数を閉じ、新しく作成したイメージの最小値である max C2 stack synapse one を選択します。次に、find maxima コマンドを使用します。新しいウィンドウで、プレビューポイント選択を選択し、ノイズ許容値を50に設定します。次に、最大点は小さな十字で示され、シナプスのアクティブゾーンのみをカバーする必要があります。交差が多すぎる場合は、ノイズ許容値を増やします。一部のアクティブゾーンに注釈が付けられていない場合は、ノイズ許容値を小さくします。マクロの [ノイズ許容誤差の最大値を見つける] フィールドに派生したしきい値を使用します。最大ノイズ許容値を選択するには、アクティブゾーンの数を適切に定量化することが重要です。適切な値を定義するために、さまざまな値を試す必要がある場合があります。次に、マクロ インターフェイスのしきい値アルゴリズムで派生したすべての値を調整し、マクロ設定の定義に最初に使用された代表的な画像に対してサブマクロ解析を実行します。白い点で示されたアクティブゾーンを持つ新しいファイルが作成されます。このファイルを開くには、ツールバーにドラッグアンドドロップし、投影タイプをスライスとしてZプロジェクトを選択します。このようにして、プロジェクションファイルが作成されます。次のステップは、しきい値を調整することです。新しいしきい値ウィンドウで、上部のバーをスライドして、必要なすべての焦点が読み取られるしきい値を選択します。これらはBRPの肯定的な点です。この値を BRP puncta 下限しきい値として使用します。次に、以前に定義した値、アルゴリズム、新しい BRP puncta 下限しきい値を使用して、元の代表的な NMJ 画像で解析を再実行します。結果として得られる画像は、クリティカル分析の基準を満たす必要があります。次に、定義設定を使用して、同じ条件下で取得されたすべてのNMJ画像に対してマクロを実行します。ショウジョウバエNMJ形態測定マクロを使用して、3つの変異遺伝子型におけるさまざまな既知のシナプス欠損を検証しました。アンキリン2の変異体は、ブートンとより小さなNMJを融合させることが知られています。マクロを使用して、パヌロニルとクイリンの2つのRNAIノックダウンNMJの面積と周囲を測定し、対照よりも有意に小さいことがわかりました。GTPase Rab3は、適切なブルックピラの分布に必要です。中断されると、アクティブなゾーンは少なくなります。マクロパヌロニルRab 3ノックダウンフライを使用した場合、NMJ端末あたり平均138のアクティブゾーンがあったのに対し、対照群では290個検出された。ハイワイヤーはNMJの成長の重要な調節因子であり、変異したNMJはその末端で分岐が延長されます。マクロパヌロニルハイワイヤーRNAIノックダウンラインを使用すると、全長、最長分岐長、分岐数、分岐点数など、いくつかのスケルトン由来のNMJパラメータに有意な増加が見られました。このビデオを見た後、ショウジョウバエNMJモルフォメトリクスマクロの操作方法と設定の調整方法をよく理解しているはずです。一度習得すれば、50のシナプスの解析を1時間以内に行うことができます。これにより、シナプスあたりの定量化時間が約15分短縮されます。NMJの高品質な画像を取得することが重要です。画像が優れているほど、マクロのパフォーマンスが向上します。この技術は、神経生物学分野の研究者がショウジョウバエNMJの形態学的パラメータを効率的に定量化するのに役立ちます。

two-algorithms-for-high-throughput-multi-parametric-quantification

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)は、シナプスの形態と機能を研究するためのモデルとして使用されます。このビデオでは、研究者がNMJを特徴付けるために定量化する重要な特徴について説明します。このプロトコル例は、定量を自動的に実行できるソフトウェアを示しています。...

ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)の定量化:シナプスの形態と機能を評価する方法

神経筋接合部(NMJ)は、シナプス不全に至ることもあるさまざまな条件で変化します。本稿では、このような構造変化を定量化するための蛍光顕微鏡法について述べる。...

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

細胞内小器官の形態、サイズ、位置は進化的に保存されており、その機能に直接影響を与えるようです。これらのプロセスの根底にある分子メカニズムを理解することは、現代生物学の重要な目標となっています。ここでは、定量的手法の適用により、これらの研究がどのように促進されるかを示します。...

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

本研究では、自由に利用可能な画像処理ツールを用いて、C.エレガンスにおけるシナプスサイズと局在化、筋肉形態、ミトコンドリア形状の定量的測定を概説する。このアプローチにより、C.エレガンスにおける将来の研究は、遺伝的変異の結果としての組織および小器官構造変化の程度を定量的に比較することを可能にする。...

カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ

神経筋接合成分を正確に検出する能力は、病理学的または発達的プロセスのために、そのアーキテクチャの変更を評価する上で非常に重要です。ここでは、定量的測定を行うために使用できる全マウント神経筋接合部の高品質画像を得るための簡単な方法の完全な説明を提示する。...

全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖

神経筋接合のアーキテクチャを維持し、成人 ショウジョウバエ 脚の運動ニューロンの詳細な免疫細胞化学的研究を可能にする解剖技術について述べています。...

認識された運動ニューロンの神経筋接合部における変化を検出する ショウジョウバエ 成脚の解剖と免疫染色

このプロトコルは、SMAおよびColQ関連のCMSのマウスモデルの病理学的変化を定量化するために使用される共焦点顕微鏡とSTED顕微鏡の組み合わせによる神経筋接合部の形態測定分析の方法を説明しています。...

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

このレポートは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部を視覚化するための新しいサンプル調製手順を提供します。この方法は、従来の方法と比較してサンプルのカールを防ぐのにより効果的であり、 ショウジョウバエの...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化

ここでは、神経筋接合部と筋細胞の微小管ネットワークを可視化するための詳細なプロトコルを紹介します。ショウ...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

学ぶDrosophila神経筋接合部の形態学的特徴を自動定量化する画像解析アルゴリズム。高スループット解析でシナプス発達調節因子の同定を効率化し、客観的で再現性のある結果を提供します。

高スループットとのマルチパラメトリック定量化のための2個のアルゴリズム

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