なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーションショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部

この方法論の全体的な目標は、解剖学的形質の定量的分析を実行する方法を示すことです。ショウジョウバエの幼虫の横紋筋を持つ核の形態、サイズ、および位置に影響を与える表現型の定量化が実証されています。細胞内小器官の形態、サイズ、分布を制御する分子メカニズムを理解することは、現代生物学の最も重要な問題の1つです。

これまで、実験群間および実験群内の形態学的変異は、定性的な分析のみが行われていました。ここでは、ショウジョウバエの遺伝学と形態計測定量解析を組み合わせて、筋肉内の核のサイズ、形状、分布を制御する遺伝子を特定する定量解析を提案します。この手順のデモンストレーションを手伝うのは、私の研究室の大学院生であるLeire Ledahawskiです。

テキストプロトコルに従って幼虫の神経筋接合部を解剖し、染色した後、鉗子を使用して1.5ミリリットルの微量遠心チューブからサンプルを取り出し、処理スライドに置きます。マイクロ解剖ハサミを使用して、フィレの頭と尾を切り取り、内部表面を上に保ちます。次に、1センチ間隔のきれいなスライドに3本のセルローステープを巻き付けて、取り付けスライドを準備します。

カバースリップをこの提供された隙間に載せて、サンプルが平らにならないようにします。次に、セルローステープストリップの間に約20マイクロリットルの封入剤を堆積させ、きれいな鉗子で培地を周囲に広げます。次に、準備から余分な組織を取り除きます。

解剖した幼虫を処理スライドから埋込スライドに引きずり込み、内部表面を上に保ったまま封入媒体に引き込みます。次に、空気が溜まらないように注意しながら、カバースリップをそっと塗ります。次に、スライドを透明なネイルワニスで密封し、スライドを少なくとも10分間乾かしてからイメージングします。

この解析には、DeVAP抗体、ラミン抗体、および核マーカーで染色された幼虫の体壁の筋肉を示す共焦点画像を使用します。次に、共焦点Zスタック画像をアリーナにドラッグアンドドロップします。画像をダブルクリックすると、ツールバーアイコンからアクセスできるSurpassビューで画像が自動的に開きます。

Surpass ビューには、3 つの主要な作業スペース パネルがあります。ビュー領域、オブジェクトリスト、およびオブジェクトプロパティ領域。次に、3D Viewアイコンをクリックして、ボリュームレンダリングされた3チャンネル画像を作成します。

次に、[オブジェクト]ツールバーから[新しい測定ポイントの追加]を選択し、[オブジェクトプロパティ]領域の作成ウィザードに従います。最初に[編集]タブを選択し、[特定のチャネル]から核マーカーまたはラミンチャネルを選択して核を強調表示します。次に、Esc タブを押してポインターを選択モードに設定し、マウス ホイールで 3D カーソル ボックスのサイズを調整して、画像内の特定の核を含めます。

Shiftキーを押しながら同じ核を左クリックして、測定ポイントを追加します。次に、同じ手法を使用して、同じ筋肉の近くの核に2番目のポイントを追加します。2点の間には線が自動的に引かれ、2つの原子核間の距離が統計変数として表示および記録されます。

特定の核を囲むすべての原子核について、この手順を繰り返します。次に、[統計] [詳細な距離データ] の下にある収集されたすべての測定ポイントから、最短距離を選択します。「オブジェクト・プロパティ」領域で、「タブ表示を使用して統計をファイルにエクスポート」オプションを選択します。

これにより、データがスプレッドシートに保存されます。この解析では、ラミンと核マーカーで染色された体壁の筋肉の共焦点画像を使用して、核を視覚化します。筋核の形状を評価するには、核の表面積を同じ体積の球の表面積と比較する球形度を測定します。

あるいは、扁平線、扁平線、または楕円体と回転楕円体を区別する楕円度を測定します。前述のようにイメージを開きます。次に、オブジェクトツールバーアイコンの「新規サーフェスを追加」をクリックします。

「オブジェクトプロパティ」領域に表示される「Creation Wizard」で、核を表示するソースチャネルとして核マーカー染色を選択します。オプションの絶対強度をしきい値として設定します。ほとんどの核が滑らかでオーバーロードされていないレンダリングを示すようにするには、しきい値カーブの値を変更します。

同時に、原子核の穴や不完全なマスクの存在を避けてください。次に、フィルターツールを使用して、サーフェスレンダリングからノイズを除去します。新しく作成したサーフェスレイヤーのEditタブで、誤ってレンダリングされた核サーフェスを分割します。

別のオプションは、誤ってレンダリングされた原子核の表面をマージすることです。サーフェスレンダリングされた原子核の楕円率と球面の値は、[統計]タブで使用できます。このデータを分析用にエクスポートします。

このプロトコルでは、核マーカーで染色され、ラミンとDeVAPに特異的な抗体で染色された体壁の筋肉を報告する共焦点画像を使用します。メインメニューの項目から目的の画像を開き、[編集]、[3Dを切り抜く]の順にクリックします。Surface Creation Wizardに従って、前のセクションで説明したように、laminチャネルを使用します。

サーフェスが作成されたら、[Objects Properties] 領域の [Edit] をクリックし、[Mask All] を選択して、核内の信号を分離します。次に、DeVAP信号を選択します。Select Channel ドロップダウンメニューから Set Voxels Ouside the Surface オプションをクリックし、その値を 0 にします。

これにより、Display Adjustment ウィンドウで使用できる新しいマスクされたチャンネルが作成されます。原子核内の信号の存在を視覚化するには、オブジェクトツールバーのアイコン「新しいクリッピングプレーンを追加」をクリックして、コンター平面を作成します。次に、クリッピング平面の角度とその位置をインタラクティブに調整して、原子核内の信号の分布を視覚化します。

ヒトVAMP関連タンパク質Bのミスセンス変異は、ALSの病因に関与しています。記載された方法を用いて、ALSの原因となる突然変異V2601を保有するハエオルソログ遺伝子DeVAPを発現する横紋筋を、野生型DeVAPの同等レベル、または野生型DeVAPのより高いレベルを発現する対照と比較した。最近傍解析を使用して、筋線維に沿った核の分布を評価しました。

変異したDeVAP導入遺伝子を発現する対照筋や、野生型タンパク質を過剰に発現する筋肉と比較して、目的の変異は核間の平均最短距離の劇的な減少を引き起こしました。次に、原子核の球形度を調べました。その結果、核の間隔を狭める導入遺伝子は、核の体積も拡大することがわかりました。

核の3D再構成とボリュームレンダリングにより、関心の突然変異を発現する筋肉は、核に局在するクラスターを形成することが明らかになりました。この方法は、ミトコンドリアなどの他のオルガネラに関連する形態学的特徴の定量分析にも拡張できます。核の構造、位置、サイズの変化は、老化や、パーキンソン病やALSなどの多くの神経変性疾患と関連しています。

運動障害の根底にある分子メカニズムを理解することは、効果的な治療介入のための新しい薬理学的標的の特定につながる可能性があります。