Name: なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーションショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫神経筋接合部での核形態・大きさ・配置の定量的解析法。形態計測と遺伝学を組み合わせて核特性を制御する遺伝子を同定し、神経変性疾患研究に応用可能なロバストな手法を提供します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

私たちは、原稿についての洞察力に富んだコメントをいただいたアンドレア・チャイ博士に感謝しています。本研究は、ウェルカム・トラスト(認可番号:Pennetta8920)および運動ニューロン疾患協会(認可番号:Pennetta6231)の支援を受けました。

<ol><li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
<li>Fortini, M. E., Skupski, M. P., Boguski, M. S., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+human+disease+gene+counterparts+in+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A survey of human disease gene counterparts in the Drosophila genome.</a> J. Cell Biol. 150 (2), 23-30 (2000).</li>
<li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> JoVE. (24), (2009).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> JoVE. (25), (2009).</li>
<li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+staining+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).</li>
<li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+mechanisms+in+ALS+and+FTD%3A+disrupted+RNA+and+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li>
<li>Nishimura, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+vesicle-trafficking+protein+VAPB+causes+late-onset+spinal+muscular+atrophy+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A mutation in the vesicle-trafficking protein VAPB causes late-onset spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Am J Hum Genet. 75 (5), 822-831 (2004).</li>
<li>Chen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+properties+of+a+novel+mutation+in+VAPB+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the properties of a novel mutation in VAPB in familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biol Chem. 285 (51), 40266-40281 (2010).</li>
<li>Funke, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P56S+mutation+in+the+VAPB+gene+is+not+due+to+a+single+founder%3A+the+first+European+case%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">The P56S mutation in the VAPB gene is not due to a single founder: the first European case.</a> Clin Genet. 77 (3), 302-303 (2010).</li>
<li>SOD1,ANG,VAPB,TARDBP, and FUS mutations in familial amyotrophic lateral sclerosis: genotype-phenotype correlations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22J+Med.+Genet%22">J Med. Genet</a>. Millecamps, S., et al. 47 (8), 554-560 (2010).</li>
<li>Landers, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+VAPB+deletion+variant+and+exclusion+of+VAPB+mutations+in+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">New VAPB deletion variant and exclusion of VAPB mutations in familial ALS.</a> Neurology. 70 (14), 1179-1185 (2008).</li>
<li>Van Blitterswijk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VAPB+and+C9orf72+mutations+in+1+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">VAPB and C9orf72 mutations in 1 familial amyotrophic lateral sclerosis patient.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2951-2954 (2012).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Budnik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+synapse+structure+and+function+by+the+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of synapse structure and function by the Drosophila tumor suppressor gene dlg.</a> Neuron. 17 (4), 627-640 (1996).</li>
<li>Sanhueza, M., Zechini, L., Gillespie, T., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+mutations+in+the+ALS8+causative+gene+VAPB+have+detrimental+effects+on+neurons+and+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function mutations in the ALS8 causative gene VAPB have detrimental effects on neurons and muscles.</a> Biol Open. 3 (1), 59-71 (2014).</li>
<li>Worman, H. J., Ostlund, C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diseases+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Diseases of the nuclear envelope.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a000760(2010).</li>
<li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+degeneration+of+human+neural+stem+cells+caused+by+pathogenic+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2.</a> Nature. 491 (7425), 603-607 (2012).</li>
<li>Pennetta, G., Hiesinger, P. R., Fabian-Fine, R., Meinertzhagen, I. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+VAP-33A+directs+bouton+formation+at+neuromuscular+junctions+in+a+dosage-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila VAP-33A directs bouton formation at neuromuscular junctions in a dosage-dependent manner.</a> Neuron. 35 (2), 291-306 (2002).</li>
<li>Fisher, P. A., Berrios, M., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+proteinaceous+subnuclear+fraction+composed+of+nuclear+matrix%2C+peripheral+lamina%2C+and+nuclear+pore+complexes+from+embryos+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a proteinaceous subnuclear fraction composed of nuclear matrix, peripheral lamina, and nuclear pore complexes from embryos of Drosophila melanogaster.</a> J Cell Biol. 92 (3), 674-686 (1982).</li>
<li>Smith, D. E., Fisher, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+developmental+regulation%2C+and+response+to+heat+shock+of+two+antigenically+related+forms+of+a+major+nuclear+envelope+protein+in+Drosophila+embryos%3A+application+of+an+improved+method+for+affinity+purification+of+antibodies+using+polypeptides+immobilized+on+nitrocellulose+blots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification, developmental regulation, and response to heat shock of two antigenically related forms of a major nuclear envelope protein in Drosophila embryos: application of an improved method for affinity purification of antibodies using polypeptides immobilized on nitrocellulose blots.</a> J Cell Biol. 99 (1), 20-28 (1984).</li>
<li>Smith, D. E., Gruenbaum, Y., Berrios, M., Fisher, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+interconversion+of+Drosophila+nuclear+lamin+isoforms+during+normal+growth+and+in+response+to+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during normal growth and in response to heat shock.</a> J Cell Biol. 105 (2), 771-790 (1987).</li>
<li>Puckelwartz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+nesprin-1+produces+an+Emery+Dreifuss+muscular+dystrophy-like+phenotype+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of nesprin-1 produces an Emery Dreifuss muscular dystrophy-like phenotype in mice.</a> Hum Mol Genet. 18 (4), 607-620 (2009).</li>
<li>Tsujikawa, M., Omori, Y., Biyanwila, J., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+positioning+the+cell+nucleus+in+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanism of positioning the cell nucleus in vertebrate photoreceptors.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (37), 14819-14824 (2007).</li>
<li>Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fusion+and+fission+in+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fusion and fission in cell life and death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 872-884 (2010).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

過去には、内および実験群間の形態学的変動はほとんど考慮されませんでした。しかし、定量的な方法の適用は、現在の形態および解剖学的な形態の数学的記述の比較研究におけるノルムが計算されますなってきています。定量の使用は、特定の細胞プロセスに対して遺伝子操作の影響を評価する際に分析し、形態学的変化を検出する能力を高める上で、これらの変更が記載されている精度を向上させるのに有望です。また、定量的データの統計分析は、私たちが表現型との間に観察された差が有意であるかどうかを評価することができます。 横紋筋では、核は明確な丸みを帯びた構造を示し、均等に筋線維に沿って分布しています。確立およびサイズ​​、形状および核の構造を維持する分子メカニズムは知られていないが、これらの核の特徴は、おそらく、TでありますO筋機能を制御する基本的な役割を果たしています。実際、いくつかの筋疾患は、筋肉内核の形態や位置を制御する遺伝子の変異によって引き起こされます。細胞内の核の形状及び分布の機能的重要性は、筋肉に限定されるものではありません。証拠を蓄積すると、核内の欠陥はまた、パーキンソン病18,24などの神経変性疾患と関連していることを示しています。さらに、当社は、小胞体とミトコンドリアを含む他の細胞小器官の形態、大きさや細胞内分布は、機能的結果を有していてもよいことを理解し始めています。例えば、ミトコンドリアの形態の変化は、視神経萎縮型-1（OPA1）とシャルコー・マリー・トゥースタイプ2Aの神経障害25などの神経障害に関連しています。 これらの重要なプロセスの根底にある分子メカニズムを解明するプロセスを支援するために、我々は、高解像度の共焦点を結合することを提案しますイメージングソフトウェアおよび形態計測を使用してデータを定量的操作は筋繊維内の形状、大きさ、および核の場所にどのように影響するかの遺伝子を評価するために分析します。一緒にショウジョウバエの幼虫における神経筋システムの高度紋切り自然とショウジョウバエ遺伝学のパワーと汎用性は、幼虫のNMJに分析のこのタイプのために特に適した実験モデルを作ります。幼虫のNMJでは、表現型分析はのNMJの数が同じフライ内で研究することができると同じであっても識別可能なNMJは、異なる遺伝子型3,4のハエとの間で比較することができ、正確な形態計測分析を可能にする単一シナプスの解像度で行うことができます。 ショウジョウバエ幼虫NMJにおける核の位置、形状、大きさの表現型の特徴は、筋肉内の筋肉と核をハイライト抗体を用いて解剖のNMJの免疫染色を行うことによって開始します。 THIで概説したプロトコルでsの紙、筋核は全体の筋肉を染色するDVAPする特異的核内部とを有する抗体を強調核マーカーで、ラミン、核膜のマーカーに対するポリクローナル抗体で染色しました。これらの実験で使用ラミン抗体は、親切にポールフィッシャー19~22によって提供されたが、抗ラミン抗体の代替源を使用することができます。さらに、核膜のための具体的な他の抗体の数は、市販されています。筋肉は抗アクチンまたは抗チューブリン抗体で染色して可視化することができながら、最後に、DAPIやヨウ化プロピジウム、核マーカーは、もご利用いただけます。この実験手順において使用されるもの以外の抗体が使用される場合、免疫染色プロトコルは、固定条件と新しい抗体の作業濃度を最適化する必要があるれる余分なステップを必要とします。このプロトコルにおける1つの重要なステップは、ボリュームレンダリングを分析する必要がある場合は特に、目でありますスライド上のサンプルの電子実装。この場合には、試験片が押しつぶさ取得しないように、スライドとカバーガラスの間にスペーサーを含めることが重要です。カバーガラスの両側にスライドに巻き付けセルローステープの3つのバンドは、スペーサーを作る簡単な方法を表します。 ImageJのは、2D画像のために用いたが、3Dマルチチャンネル画像のほとんどが、この論文で提示分析、理由は、その社内可用性のIMARISを使用して行われました。しかしながら、他の同様の市販のソフトウェアパッケージは、これらの用途に使用することができます。 いくつかのオープンソース（例えば、ImageJの、CellProfiler、Vaa3D、アイシー、KNIMEなど）と共焦点画像の分析に利用可能な商用ソフトウェアプラットフォームがあります。 ImageJの26、フィジー27として知られているNIHまたはそのより強化されたバージョンからのフリーソフトウェアは、世界的なイメージングcommuniために利用可能なインポートフィルタ、マクロやプラグインの数が多いですTY。これらのプラグインのほとんどは、スライス・バイ・スライス方法で情報を処理に焦点を当てています。マルチチャンネル3D画像の可視化と分析に利用可能なプラグインもあります。しかし、それらは多くの場合、特定のタスクのために設計されており、ユーザーが自分のニーズにこれらのプラグインを拡張したり、適応する必要があるかもしれません。一方、商用プラットフォームは、比較的経験の浅いユーザーをターゲットにし、多くの場合、信じられないほどの速度で画像処理タスクの容易に使用できる、広いカバレッジに焦点を当てています。 このプロトコルで概説定量的表現型解析と一緒に実験手順は、細胞小器官の形態および細胞内でのそれらの分布を制御する分子機構の解明に役立つことができます。しかしながら、このアプローチは、特定のエンドポイントでこれらのプロセスを分析する明らか限界があります。細胞小器官の形態および分布を制御するプロセスは非常に動的であるために、異なる細胞TYとの間だけでなく、変化させる可能性があります発達または生理学的状態に応じて、同じセル内のPESも。この分析のさらなる実装は、細胞小器官の形態及び位置の変化を経時的にモニターされることを可能にするタイムラプスイメージングによって表されることになります。

定性的分析は、ほとんどの実験的研究の焦点を、大きな表現型の影響をもたらす遺伝子操作の調査や、定量化に適さない表現型、例えば不在/存在に限定します。表現型の定量化は通常行われず、表現型グループのメンバー内に存在する変動は考慮されません。さらに、形態の数学的記述がなければ、微細な表現型の変化が遺伝的に誘発された変化の結果なのか、それとも観察された変化が単にランダムな変動によるものなのかを判断するのは難しいかもしれません。
遺伝子破壊による表現型欠損の正確で偏りのない分析のためには、定量的な方法論がより伝統的な定性的アプローチを伴うべきだと提案します。表現型の定量的評価は、シナプスのように、その固有の形態学的および機能的可塑性により高い変動性を示す構造にとって特に有益です。私たちは、私たちが最も精通している研究領域、すなわちショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部(NMJ)に適用される定量分析の例を選択しました。ただし、概念と原理は他の実験システムにも同様に適用できます。
幼虫のNMJは、その構造の高度にステレオタイプ化された性質のために、シナプスの発達と機能を研究するための優れたモデルシステムです。幼虫の神経筋系の各半節には、シナプス後標的筋とシナプス接触を形成する32の識別可能な運動ニューロンが含まれています。すべての半節には、キューティクル1の内面に付着した多核線維として見える固定数の筋肉も含まれています。幼虫の神経筋系を使用するもう一つの利点は、ショウジョウバエの遺伝学の力と汎用性により、多数の突然変異対立遺伝子の生成を容易に可能にし、時間的および組織的に制限された方法で遺伝子発現を改変する可能性です。最後に、病気を引き起こすヒト遺伝子の75%は、ショウジョウバエ2で進化的に保存されたオルソログを持っています。実際、ハエとヒトの間では、遺伝的経路全体が保存されています。このため、ショウジョウバエの幼虫の神経筋系は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)1を含む多くのヒト疾患の根底にある分子メカニズムを解明するための非常に人気のある実験モデルです。
ここでは、いくつかの信頼できる免疫組織化学マーカーの利用可能性と、バイオイメージング技術および正確な形態測定分析を組み合わせることで、重要な機能的役割を果たす可能性のある解剖学的形質を記述できることを示しています3,4,5。定量解析に適した細胞プロセスの中で、核などの細胞内構造の形状、サイズ、位置の変化に着目しています。これらはすべて、私たちがほとんど知らないプロセスです。
今後数十年間の分子遺伝学者の課題は、非常に微妙な表現型の欠陥を生み出す遺伝子変異の影響を分析することにより、現在の知識を拡大することです。研究者が遺伝子変異の影響を細心の注意を払って調査することを可能にする定量的方法論は、特に十分に理解されていない細胞プロセスについて、遺伝子型が表現型とどのように関連しているかについて、より包括的な理解を提供することができます。

<table><tbody><tr><td>マイクロ鉗子 0.3 mm x 0.25 mm</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>11030-12</td><td></td></tr><tr><td>シルガード解剖プレート&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>76103</td><td>あらかじめ秤量したエラストマーベースを硬化剤と混合します。混合物を5cmのシャーレに入れます。60°Cで硬化させましょう。C、少なくとも24時間</td></tr>、<tr><td>ステンレス製/スチール製の微細ピン、直径0.1mm</td>、<td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>26002-10</td><td></td></tr>マイクロ<tr><td>ダイセクションハサミ(極細)&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)。組成:3 mM NaH2PO4、7 mM Na2HPO4、130 mM NaCl、pH 7</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4 (SIGMA-S8282)、 Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653)</td></tr><tr><td>Bouinの解決策.組成:ピクリン酸、ホルムアルデヒド、酢酸(15:10:1)</td><td></td><td></td><td>ピクリン酸(SIGMA 197378)、ホルムアルデヒド(F8775)、酢酸(SIGMA-1005706)</td></tr><tr><td>1x PBT(トリトン入りリン酸緩衝生理食塩水)1x PBS + 0.1%トリトン&nbsp;</td><td></td><td></td><td>トリトン-X100。SIGMA-T8787</td></tr><tr><td>ノーマルヤギ美容液&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>モルモット抗DVAP抗体</td><td></td><td></td><td>Giuseppa Pennetta博士(英国エジンバラ大学)より提供。5% NGS</td></tr><tr><td>Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase)</td>で1:200希釈で使用<td>Jackson ImmunoResearch</td><td>123-065-021</td><td>5% NGS Rabbit抗Lamin抗体</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>を含むPBTで1:500希釈で使用 <td>Paul Fisher博士(ニューヨーク州立大学ストーニーブルック校)提供。5%NGSを含むPBTで1:500希釈で使用&nbsp;</td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Molecular Probes</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ抗体、Alexa Fluor488、結合</td>型 <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>bs-295G-A555-BSS</td><td>5% NGS</td></tr><tr><td>ヤギ抗モルモット IgG 抗体 Cy3、結合型</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>bs-0358G-Cy3-BSS</td><td>1:500 希釈で 5% NGS</td></tr><tr><td>Vectashield 封入剤を含む PBT で 1:500 希釈で使用蛍光</td><td>ベクトル研究所</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

形態形成上のほとんどの研究は、特定の遺伝子と遺伝的経路の破壊によってどのように影響されるか、解剖学的特性の定性的な記述に依存しています。遺伝子操作は、表現型効果の範囲を生成し、変動があっても、対照群内の個体間に観察されるが、定量的な説明はほとんど、実行されません。新興の証拠は、細胞小器官の形態、大きさや位置が細胞の機能と生存の以前に過小評価、まだ基本的な役割を果たしていることを示しています。ここでは、 ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部（NMJ）で表現型の定量分析を実行するためのステップバイステップの手順を提供します。我々は、バイオイメージング技術と組み合わせて、いくつかの信頼性の免疫組織化学的マーカーを使用し、形態学的には、特定の細胞プロセス上の遺伝子変異の効果を調べるために分析します。特に、我々は、nの形態、大きさ及び位置に影響を与える表現型の定量分析に焦点を当てますショウジョウバエの幼虫の横紋筋肉内uclei。 ショウジョウバエ幼虫NMJは、健康と病気の両方の構造や神経筋システムの機能を、根底にある分子メカニズムを研究する貴重な実験モデルです。しかし、ここで説明する方法は、他のシステムに拡張することができます。

ALSは、具体的には横紋筋7の進行と致命的な麻痺につながる運動ニューロンに影響を与える変性疾患です。ヒトVAMP関連タンパク質B（hVAPB）におけるミスセンス変異は、ALSの種類8 8-12を含む運動ニューロン疾患の範囲を引き起こします。 hVAPB遺伝子におけるミスセンス変異（V234I）は、最近、ヒト13における典型的なALSの一つのケースで同定されています。その病原性の可能性を評価するために、我々は、疾患の原因となる変異（DVAP-V260I）を運ぶhVAPB ショウジョウバエオルソログDVAPを発現するトランスジェニックハエを生成しました。この導入遺伝子の発現は、UAS / GAL4系と筋固有のドライバのBG57-GAL4 14,15を使用して、筋肉を標的としました。 DVAP-V260Iトランスジェニック発現の効果を比較し、野生型DVAPタンパク質16の異なるレベルで発現する他の二つの導入遺伝子（DVAP-WT1とDVAP-WT2）、のそれに対比しました。モルeは具体的には、DVAP免疫反応性の増加は、同じ信号16のDVAP-V260IおよびDVAP-WT1の展示匹敵すると低いレベルながらDVAP-WT2ラインのコントロールに比べて2.2倍高いです。 核の変化は、加齢とパーキンソン病17,18を含むいくつかの神経変性疾患と関連しています。 ALS8のための私達のフライモデルが核アーキテクチャ、位置や大きさの変化を示しているかどうかを評価するために、我々は、核マーカーおよび核膜を可視化抗ラミン抗体19-22、との適切な遺伝子型の横紋筋肉内核を染色しました。筋肉を強調表示するには、DVAP特異的抗体はまた、同じ試料（ 図1）に加えました。共焦点画像を収集し、詳細な形態学的分析は、画像分析ソフトウェアを用いて行きました。対照筋において、核は均一に筋肉に沿って分布されることが見出されました筋肉を表現DVAP-V260IおよびDVAP-WTにいる間の繊維は、核が密接に関連したクラスター（ 図1）で再配布する傾向を示します。 我々は、すべての遺伝子型の筋線維に沿って核の分布を定量的に評価を行うために最近隣分析を行いました。最近隣分析は、最初に与えられた核の中心部や他のすべての周囲の核の中心との距離を測定することにより、すべての核のための最も近い隣人を識別します。この手順は、次いで、筋繊維に沿って他のすべての核に対して繰り返されます。最後に、特定の筋肉内の核との間の最短距離は、すべての核とその最も近い隣人の最短距離を平均することによって計算されます。 （ 図2A - C）。対照と比較して、DVAP-V260I導入遺伝子または導入遺伝子のいずれかのいずれかを発現する筋肉は、野生型タンパク質を過剰発現します、結果として、核が密接にクラスターに関連すると思われる、核間の平均最短距離の劇的な減少を提示し。アレルDVAP-V260Iを引き起こすALSの影響が最も強いDVAP-WT2導入遺伝子は、（ 図1および図2D）を用いる場合であっても、野生型タンパク質の過剰発現に関連したよりも深刻です。 DVAP-V260IまたはDVAP-WTのいずれかの導入遺伝子の過剰発現はまた、細長い構造（ 図1）と変形核で生じた核アーキテクチャの深刻な悪化を示します。この構造的収差は円形が式Cによって定義されたImageJソフトウェアを用いて定量しました。 <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/53821/53821eq3.jpg" /> 、真円とC = 0無限に細長いポリゴンを表すC = 1とすべての核の長さの比に幅を測定します。 CONTRでトランスジェニック変異体では、円形の必然的損失を伴う形状の変化は、この値（ 図1及び図3）からの大きな逸脱を引き起こしながら、明確な丸い形状を呈するオール核は、Cは1に等しいです。 また、ALS原因対立遺伝子がDVAP-WT導入遺伝子（ 図4）と比較して、この表現型を誘導することで、より効率的であると思われるが、筋肉が同じ導入遺伝子の発現において、核は、対照と比較してマークされ、拡大核体積を表示することがわかりました。 ほぼすべての神経変性疾患は、病原性タンパク質を含有する凝集体の細胞内蓄積によって特徴付けられます。我々は、3D再構成および核のボリュームレンダリングを行ったし、我々は筋肉変異導入遺伝子を発現しているか、野生型タンパク質を過剰発現するには、DVAPの免疫反応性がクラスター形成されていることがわかっNDそれらのいくつかはまた、核（ 図5）に局在していること。逆に、コントロールのNMJで、DVAPの免疫反応性はかすかに筋線維全体に分散され、核16から除外されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig1.jpg" /> 図1：WT DVAP-またはDVAP-260Iの導入遺伝子のいずれかを発現する横紋筋肉内筋核の共焦点画像 （A）BG57-GAL4 / +コントロール、（B）BG57; DVAP-V260I、（C）BG57; DVAP-WT1。および（D）BG57;示された導入遺伝子を発現しているDVAP-WT2の筋肉は、DVAP（赤信号）に特異的な抗体で染色されたラミン（緑信号）と核（青色信号）を可視化するための核特異的マーカーです。スケールバー=30μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig1large.jpg" target="_blank">表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図の拡大版。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig2.jpg" /> 図2：核とその単一の最も近い隣接間の平均距離を決定するために、最も近い隣人分析 （B）代表的な結果は、（A）のコントロールと比較した場合、DVAP-WT2導入遺伝子を過剰発現する筋肉に変更された核の位置を示します。示された遺伝子型の筋肉の平均核の距離が（C）式を用いて推定し、データ（D）に報告されています。幼虫のNMJは、DVAP（赤信号）に特異的な抗体で染色したラミン（緑）、核マーカー（青色信号）とされています。アスタリスクは統計的有意性を示しています。 *** P &lt;0.001、** P &lt;0.01。この実験の統計分析とANOVA検定を使用した一方向およびTukeyのmultipの下に報告されたすべての実験について遺伝子型間の差異は、ANOVA試験により有意であることが判明した場合ルの比較試験は、事後検定として適用しました。エラーバーはSEMを表します。スケールバー=30μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig3.jpg" /> 図 3： 核体積の計算における代表的なステップを示す画像 （A）表面作成ウィザードを使用してセグメント化された核を示す代表的な画像。画像の境界で核が無視されました。周囲のDVAP染色後の核DVAP信号を示す（B）の画像は、核マーカーチャネルで作成した表面を使用することによりマスクされています。 （C）表面層は、追加のパラメータの情報を提供します核体積及び球形度を含みます。様々な遺伝子型の核ボリューム上の（D）データ。アスタリスクは統計的有意性を示しています。切開のNMJ抗DVAP抗体（赤シグナル）、抗ラミン抗体（緑色シグナル）および核マーカー（青色信号）で染色しました。 *** P &lt;0.001、** P &lt;0.01。エラーバーはSEMを表します。スケールバー=30μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig3large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig4.jpg" /> 図4：ImageJ のによる核形状の推定における代表的なステップを示す画像。 &#160;&#160;画像の最大強度投影は、筋肉内の核の真円度を推定するためのImageJを用いて分析しました。 （A）投影の代表例プロトコルのステップ7.9のように、3チャネル画像の。 （B）チャネルが分割され、核マーカーチャネルが選択されたプロトコルのステップ7.10を示す画像。 （C）セグメントにImageJの中の核とROIマネージャープラグインを強度閾値を適用した後、関心のあるすべての核が選択することができ、その形状は、形状記述子を介して測定していることを示す代表的な画像（7.11から7.15ステップ）。 （D）は、種々の遺伝子型の円形の定量。緑が核を概説し、ラミン染色に対応している幼虫のNMJで、赤信号はDVAP染色を示しています。すべての核の内部が原因で核マーカーでの染色に青色で標識されています。アスタリスクは統計的有意性を示しています。 *** P &lt;0.001、** P &lt;0.01。エラーバーはSEMを表します。スケールバー=30μmの<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig4large.jpg" target="_blank">彼女をクリックしてください</a>eは、この図の拡大版を表示します。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig5.jpg" /> 図5：筋核のボリュームレンダリングの作成 ​​で特定のステップを示す画像 。 （A）DVAPタンパク質（赤）、ラミン（緑）、DNAマーカー（青色）で染色した筋肉の3D強度ブレンドビューを示す画像。 （B）セグメントに核ラミンチャネルを使用して生成された表面層を表す画像。 （C）表面層を選択核外DVAP信号をマスクするために使用された核を表す画像。黄色でハイライト表示は画像に追加されたクリッピング平面です。ビューと位置のその角度は、対話的に核の内部信号の分布を可視化するために調節することができます。 （D）USIを作成した核の表面層の断面図を報告画像ngのラミンチャンネルがマスクされていないDVAPと核マーカー信号と合併しました。 （EおよびF）は、同じ核の追加の区分ボリュームレンダリング。スケールバー=10μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig5large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

細胞内小器官の形態、サイズ、位置は進化的に保存されており、その機能に直接影響を与えるようです。これらのプロセスの根底にある分子メカニズムを理解することは、現代生物学の重要な目標となっています。ここでは、定量的手法の適用により、これらの研究がどのように促進されるかを示します。

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

この方法論の全体的な目標は、解剖学的形質の定量的分析を実行する方法を示すことです。ショウジョウバエの幼虫の横紋筋を持つ核の形態、サイズ、および位置に影響を与える表現型の定量化が実証されています。細胞内小器官の形態、サイズ、分布を制御する分子メカニズムを理解することは、現代生物学の最も重要な問題の1つです。これまで、実験群間および実験群内の形態学的変異は、定性的な分析のみが行われていました。ここでは、ショウジョウバエの遺伝学と形態計測定量解析を組み合わせて、筋肉内の核のサイズ、形状、分布を制御する遺伝子を特定する定量解析を提案します。この手順のデモンストレーションを手伝うのは、私の研究室の大学院生であるLeire Ledahawskiです。テキストプロトコルに従って幼虫の神経筋接合部を解剖し、染色した後、鉗子を使用して1.5ミリリットルの微量遠心チューブからサンプルを取り出し、処理スライドに置きます。マイクロ解剖ハサミを使用して、フィレの頭と尾を切り取り、内部表面を上に保ちます。次に、1センチ間隔のきれいなスライドに3本のセルローステープを巻き付けて、取り付けスライドを準備します。カバースリップをこの提供された隙間に載せて、サンプルが平らにならないようにします。次に、セルローステープストリップの間に約20マイクロリットルの封入剤を堆積させ、きれいな鉗子で培地を周囲に広げます。次に、準備から余分な組織を取り除きます。解剖した幼虫を処理スライドから埋込スライドに引きずり込み、内部表面を上に保ったまま封入媒体に引き込みます。次に、空気が溜まらないように注意しながら、カバースリップをそっと塗ります。次に、スライドを透明なネイルワニスで密封し、スライドを少なくとも10分間乾かしてからイメージングします。この解析には、DeVAP抗体、ラミン抗体、および核マーカーで染色された幼虫の体壁の筋肉を示す共焦点画像を使用します。次に、共焦点Zスタック画像をアリーナにドラッグアンドドロップします。画像をダブルクリックすると、ツールバーアイコンからアクセスできるSurpassビューで画像が自動的に開きます。Surpass ビューには、3 つの主要な作業スペース パネルがあります。ビュー領域、オブジェクトリスト、およびオブジェクトプロパティ領域。次に、3D Viewアイコンをクリックして、ボリュームレンダリングされた3チャンネル画像を作成します。次に、[オブジェクト]ツールバーから[新しい測定ポイントの追加]を選択し、[オブジェクトプロパティ]領域の作成ウィザードに従います。最初に[編集]タブを選択し、[特定のチャネル]から核マーカーまたはラミンチャネルを選択して核を強調表示します。次に、Esc タブを押してポインターを選択モードに設定し、マウス ホイールで 3D カーソル ボックスのサイズを調整して、画像内の特定の核を含めます。Shiftキーを押しながら同じ核を左クリックして、測定ポイントを追加します。次に、同じ手法を使用して、同じ筋肉の近くの核に2番目のポイントを追加します。2点の間には線が自動的に引かれ、2つの原子核間の距離が統計変数として表示および記録されます。特定の核を囲むすべての原子核について、この手順を繰り返します。次に、[統計] [詳細な距離データ] の下にある収集されたすべての測定ポイントから、最短距離を選択します。「オブジェクト・プロパティ」領域で、「タブ表示を使用して統計をファイルにエクスポート」オプションを選択します。これにより、データがスプレッドシートに保存されます。この解析では、ラミンと核マーカーで染色された体壁の筋肉の共焦点画像を使用して、核を視覚化します。筋核の形状を評価するには、核の表面積を同じ体積の球の表面積と比較する球形度を測定します。あるいは、扁平線、扁平線、または楕円体と回転楕円体を区別する楕円度を測定します。前述のようにイメージを開きます。次に、オブジェクトツールバーアイコンの「新規サーフェスを追加」をクリックします。「オブジェクトプロパティ」領域に表示される「Creation Wizard」で、核を表示するソースチャネルとして核マーカー染色を選択します。オプションの絶対強度をしきい値として設定します。ほとんどの核が滑らかでオーバーロードされていないレンダリングを示すようにするには、しきい値カーブの値を変更します。同時に、原子核の穴や不完全なマスクの存在を避けてください。次に、フィルターツールを使用して、サーフェスレンダリングからノイズを除去します。新しく作成したサーフェスレイヤーのEditタブで、誤ってレンダリングされた核サーフェスを分割します。別のオプションは、誤ってレンダリングされた原子核の表面をマージすることです。サーフェスレンダリングされた原子核の楕円率と球面の値は、[統計]タブで使用できます。このデータを分析用にエクスポートします。このプロトコルでは、核マーカーで染色され、ラミンとDeVAPに特異的な抗体で染色された体壁の筋肉を報告する共焦点画像を使用します。メインメニューの項目から目的の画像を開き、[編集]、[3Dを切り抜く]の順にクリックします。Surface Creation Wizardに従って、前のセクションで説明したように、laminチャネルを使用します。サーフェスが作成されたら、[Objects Properties] 領域の [Edit] をクリックし、[Mask All] を選択して、核内の信号を分離します。次に、DeVAP信号を選択します。Select Channel ドロップダウンメニューから Set Voxels Ouside the Surface オプションをクリックし、その値を 0 にします。これにより、Display Adjustment ウィンドウで使用できる新しいマスクされたチャンネルが作成されます。原子核内の信号の存在を視覚化するには、オブジェクトツールバーのアイコン「新しいクリッピングプレーンを追加」をクリックして、コンター平面を作成します。次に、クリッピング平面の角度とその位置をインタラクティブに調整して、原子核内の信号の分布を視覚化します。ヒトVAMP関連タンパク質Bのミスセンス変異は、ALSの病因に関与しています。記載された方法を用いて、ALSの原因となる突然変異V2601を保有するハエオルソログ遺伝子DeVAPを発現する横紋筋を、野生型DeVAPの同等レベル、または野生型DeVAPのより高いレベルを発現する対照と比較した。最近傍解析を使用して、筋線維に沿った核の分布を評価しました。変異したDeVAP導入遺伝子を発現する対照筋や、野生型タンパク質を過剰に発現する筋肉と比較して、目的の変異は核間の平均最短距離の劇的な減少を引き起こしました。次に、原子核の球形度を調べました。その結果、核の間隔を狭める導入遺伝子は、核の体積も拡大することがわかりました。核の3D再構成とボリュームレンダリングにより、関心の突然変異を発現する筋肉は、核に局在するクラスターを形成することが明らかになりました。この方法は、ミトコンドリアなどの他のオルガネラに関連する形態学的特徴の定量分析にも拡張できます。核の構造、位置、サイズの変化は、老化や、パーキンソン病やALSなどの多くの神経変性疾患と関連しています。運動障害の根底にある分子メカニズムを理解することは、効果的な治療介入のための新しい薬理学的標的の特定につながる可能性があります。

why-quantification-matters-characterization-phenotypes-at-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、分析する方法を示しています...

ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖

このプロトコルは、解剖さショウジョウバエの幼虫の免疫組織化学を実行する方法を示しています。...

ショウジョウバエ幼虫NMJ免疫組織化学

ここでは、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でシナプス伝達を測定するための電気生理学的方法を説明します。誘発放出は、運動ニューロンの軸索を刺激することによって人工的に開始され、NMJの透過は、筋肉に誘発シナプス後応答によって測定することができる。...

ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)は、シナプスの形態と機能を研究するためのモデルとして使用されます。このビデオでは、研究者がNMJを特徴付けるために定量化する重要な特徴について説明します。このプロトコル例は、定量を自動的に実行できるソフトウェアを示しています。...

ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)の定量化:シナプスの形態と機能を評価する方法

このビデオは、ショウジョウバエの背側縦筋の神経筋接合部の構造的完全性を評価するためのプロトコルを示しています。この手順では、ニューロンと筋肉を2つの異なる抗体で染色し、突然変異型と野生型のハエの蛍光パターンを比較します。突然変異型ハエのニューロン染色の減少は、神経変性を示していますが、筋肉構造は無傷のままです。...

ショウジョウバエの背側縦筋神経筋接合部の構造的完全性の評価

出典: Marinello, M., et al.共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組合せによるマウスの神経筋接合部の特性評価J. Vis.

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部の特性評価

二つの画像解析アルゴリズム、「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」および「 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測を」自動的ショウジョウバエ神経筋接合部（NMJ）の9つの形態学的特徴を定量化するために、 作成されました 。...

高スループットとのマルチパラメトリック定量化のための2個のアルゴリズム<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;神経筋接合部形態

本研究では、自由に利用可能な画像処理ツールを用いて、C.エレガンスにおけるシナプスサイズと局在化、筋肉形態、ミトコンドリア形状の定量的測定を概説する。このアプローチにより、C.エレガンスにおける将来の研究は、遺伝的変異の結果としての組織および小器官構造変化の程度を定量的に比較することを可能にする。...

カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ

このプロトコルは、SMAおよびColQ関連のCMSのマウスモデルの病理学的変化を定量化するために使用される共焦点顕微鏡とSTED顕微鏡の組み合わせによる神経筋接合部の形態測定分析の方法を説明しています。...

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

ここでは、神経筋接合部と筋細胞の微小管ネットワークを可視化するための詳細なプロトコルを紹介します。ショウ...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

学ぶショウジョウバエ幼虫神経筋接合部での核形態・大きさ・配置の定量的解析法。形態計測と遺伝学を組み合わせて核特性を制御する遺伝子を同定し、神経変性疾患研究に応用可能なロバストな手法を提供します。

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション

さらに動画を探す