拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）
May 1st, 2017
組み合わせ前駆同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）は、アイソバリックタグのサンプル多重化機能を強化し、定量プロテオミクス戦略です。このプロトコルは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの組織へのcPILOTの適用を説明しています。
この強化されたマルチプレックス分析法の全体的な目標は、サンプルエラーと装置時間を減らしながら、同時に分析できるタンパク質サンプルの数を増やすことです。この方法は、老化、神経変性疾患、その他の加齢性疾患、および病因、進行、診断、予後、および治療標的に関連する癌の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、多くの条件にわたるタンパク質の変化の包括的なスナップショットを生成できることです。
この方法は、マウスモデルでアルツハイマー病に関する洞察を得ることができますが、アルツハイマー病やその他のさまざまな疾患の患者の組織サンプルにも適用できます。一般に、この方法に不慣れな人は、短時間で同時に処理するサンプルが複数あるため、難しいと感じるでしょう。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、アセチル化をタンパク質ニトロ化のためのアイソベリックタグと組み合わせることができることを認識したときで、この手法をすべてのペプチドに対してグローバルに機能させる動機となりました。
この研究では、アルツハイマー病マウスモデルおよび野生型コントロールからの脳、心臓、および肝臓組織を分析します。各組織サンプルの60〜90ミリグラムを溶解チューブに移し、500マイクロリットルのPBSと8モル尿素を加えます。機械式ホモジナイザーを使用してサンプルを均質化します。
組織ホモジネートを溶解チューブから取り出し、微量遠心チューブに移します。溶解チューブを100〜500マイクロリットルのPBSと8モル尿素ですすぎ、リンス溶液を組織ホモジネートと組み合わせます。組織ホモジネートを15分間遠心分離します。
各サンプルから上清を掴みます。BCAアッセイを実施してタンパク質濃度を測定した後、各サンプルから100マイクログラムのタンパク質を、個別に標識した微量遠心チューブに加えます。各サンプルにジチオスレイトールを添加します。
そして、摂氏37度で2時間インキュベートします。ヨードアセトアミド(IAM)を各サンプルに加え、暗所で氷上で2時間インキュベートします。次に、各サンプルにL-システインを添加し、室温で30分間インキュベートします。
30分後、塩化カルシウムを含むトリスバッファーを添加し、尿素を最終濃度2モルまで希釈します。L1トシリメトフェニルエチルコラーメチルケトン処理トリプシンを各サンプルに加えます。そして、摂氏37度で24時間インキュベートします。
翌日、サンプルを液体窒素で急速凍結してタンパク質消化を急冷し、さらなる処理まで摂氏マイナス80度で保存します。ジメチル化標識に先立ち、ペプチドサンプルをテキストプロトコールに記載されているように脱塩し、真空遠心分離により乾燥します。ジメチル化標識手順を開始するには、HPLCまたはナノピュアグレードの水に溶解した1%酢酸にペプチドを再構成します。
各サンプルの50マイクログラムの部分を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。再構成したペプチドの残りは、将来の実験のために摂氏マイナス80度で保存します。次に説明する手順では、試薬を迅速に追加して、化学反応がすべてのサンプルに対して同じ時間行われるようにすることが重要です。
60ミリモルのホルムアルデヒド溶液を8マイクロリットルサンプルに加えて、軽いジメチル化で標識します。60ミリモルの炭素13重水素標識ホルムアルデヒド溶液を8マイクロリットルサンプルに加えて、重いジメチル化で標識します。8マイクロリットルの24ミリモルシアノ水素化シヤノボウ素ナトリウムを、光ジメチル化で標識したサンプルに加えます。
24ミリモルのシアノボロドデリドナトリウムを8ミリリットルで、重いジメチル化で標識したサンプルに加えます。サンプルをボルテックスし、チューブシェーカーで室温で約10分間静かに振とうします。16マイクロリットルの1%アンモニアを5分間加えて反応を急冷します。
5%ギ酸の8マイクロリットルを添加することにより、反応混合物を再酸性化します。軽質ジメチル化ペプチドと高ジメチル化ペプチドを組み合わせて、合計6つのサンプルを生成します。テキストプロトコルで説明されているように、サンプルの脱塩を実行します。
そして、真空遠心分離によってサンプルを乾燥させます。ジメチル化サンプルの等重体標識であるためには、まず、100マイクログラムのジメチル化ペプチドと重炭酸トリエチルアンモニウム、またはTEAB緩衝液を再構成します。次に、アイソバリックタギングキットのメーカーのプロトコルに従ってアイソバリック試薬を調製します。
適切な容量、この場合は41マイクロリットルの可溶化同重体標識試薬を各ペプチドサンプルに加え、約10秒間ボルテックスします。微量遠心チューブシェーカーでサンプルを室温で約1時間振とうします。反応を急冷するには、各サンプルに8マイクロリットルのヒドロキシルアミンを加えます。
そして、サンプルを室温で15分間インキュベートします。標識された6つのサンプルを1つの混合物にプールし、脱塩します。液体クロマトグロフィ用のペプチドを調製するには、0.1%ギ酸を含む質量分析グレードの水でペプチドを再構成します。
再構成したペプチドを、0.65μmフィルターが入った微量遠心チューブに加えます。そして、12, 000倍gで1分間遠心分離します。フィルターを取り外して廃棄します。
ろ過したペプチドをオートサンプラーバイアルに移します。各強陽イオン交換派閥サンプルの6マイクロリットルをトラップカラムに注入します。カーボン18素材で2センチに詰めます。
分析分離およびデータ取得質量分析計メソッドを実行します。アルツハイマー病マウスモデルおよび野生型コントロールからの脳、心臓、および肝臓組織の12プレックスcPilot解析を実施しました。プリカーサーデータでは、m/z 643.854 および 647.875 のピークで表される軽度および重質のジメチル化ペプチドが示されました。
これらのペプチドを選抜し、独立して単離し、共謀による解離により断片化してこれらのスペクトルを生成しました。検索結果から、ピークはタンパク質ホスホグリセリン酸キナーゼ1のペプチドに属していることが示されました。これらのピークは、高エネルギーの共謀解離タンデム質量分析のためにさらに分離され、レポーターイオンが示されているように観察されます。
12個のサンプルに関する情報を取得するには、両方のトリプルステージ質量分析スペクトルのセットが必要です。この例では、アルツハイマー病と野生型の制御イオン比は、脳、肝臓、および心臓組織の 2 つの生物学的複製で類似しています。各比較の倍率変化値は、脳と心臓のホスホグリレートキナーゼ1レベルがアルツハイマー病マウスでは高いが、肝臓では低いことを示唆しています。
このテクニックは、一度マスターすれば、適切に行えば約5時間で習得できます。この手順を試行する際は、サンプルの取り扱いに注意することを覚えておくことが重要です。この手順に組み込まれると、日当の深さとカバレッジを拡大するために、強陽イオン交換や高pH分画などの分離方法を実行できます。
このビデオを見れば、C-Pilotを使用してサンプルマルチプレックスを強化する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
Combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) は、サンプルの多重化能力を向上させる定量的プロテオミクス戦略です。この方法は、アルツハイマー病マウスモデルと野生型コントロールの組織に適用されます。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- プロテオミクス
- アルツハイマー病研究
背景
- cPILOT は同時に分析されるタンパク質サンプルの数を増加させます。
- サンプルエラーと機器時間を減少させます。
- この方法は老化と神経変性疾患の重要な問題に対応します。
- アルツハイマー病以外の様々な障害にも適用できます。
研究の目的
- 条件間のタンパク質変化の包括的なスナップショットを提供します。
- 病因と治療標的の理解を深めます。
- 神経変性疾患の研究を促進します。
使用された方法
- マウスモデル組織へのcPILOTの適用。
- アセチル化と等質タグ付けの組み合わせ。
- 複数のサンプルを同時に処理すること。
- タンパク質硝化に関する洞察を生成すること。
主な結果
- cPILOTは多重化能力を成功裏に向上させます。
- アルツハイマー病に関連するタンパク質変化に関する洞察を提供します。
- より広範な研究のために患者の組織サンプルに適用可能です。
- 様々な加齢関連疾患の分析を促進します。
結論
- cPILOTは定量的プロテオミクスの価値あるツールです。
- 神経変性疾患の研究を進める可能性を提供します。
- サンプル処理の複雑さにより、新規ユーザーには課題が存在します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Enhanced sample multiplexing addresses the biopharma need for high-throughput, cost-effective proteomic profiling across diverse biological conditions. By enabling simultaneous analysis of 12 or more samples, cPILOT reduces experimental variability and accelerates target validation in neurodegenerative disease research. This capability supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative protein abundance data across genotypes, treatments, and time points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by comparing protein expression across disease models and controls.
- Operational Value: Reduces sample handling error and instrument time through increased multiplexing capacity.
- Strategic Value: Supports portfolio triage by generating comprehensive protein change snapshots across multiple conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative proteomic data suitable for assay development and biomarker discovery.
- Operational Value: Enables reproducible sample preparation workflows compatible with downstream liquid chromatography and mass spectrometry.
- Strategic Value: Facilitates screening readiness by allowing comparison of biological replicates, drug treatments, and genotypes in a single run.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant protein expression data from mouse tissues that can inform translational biomarker alignment.
- Operational Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent protein quantification across sample sets.
- Strategic Value: Enhances risk-adjusted advancement decisions by reducing biological noise in comparative analyses.
Pipeline & Workflow Integration
cPILOT integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by delivering multiplexed proteomic readouts that inform biological de-risking and target confidence.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via quantitative comparison of protein abundances across Alzheimer's disease and wild-type tissues.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible sample labeling and desalting steps that ensure consistent peptide preparation.
- Analytics: Generates reporter ion data from isobaric tags that allow direct comparison of relative protein abundance across 12 experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by providing protein expression data from brain, heart, and liver tissues relevant to neurodegenerative disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable proteomic capability applicable to diverse sample types including cells, tissues, bodily fluids, and whole organisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing experimental bias through simultaneous multi-sample analysis.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability of proteomic workflows through defined chemical labeling protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by decreasing per-sample instrument time and enabling higher throughput in discovery campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative protein data across genotypes, treatments, and biological replicates for informed go/no-go decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomic sample preparation, including tissue homogenization, protein digestion, and peptide labeling techniques.
- Depends on access to mass spectrometry instrumentation capable of detecting isobaric tag reporter ions and performing tandem mass spectrometry fragmentation.
- Necessitates cross-team standardization of reagent handling and timing controls to ensure consistent labeling efficiency across samples.
- Involves adaptation considerations for different sample input types, as global cPILOT applies to cells, tissues, bodily fluids, or whole organisms with protocol adjustments for lysis and digestion.
- Involves practical limitations related to sample handling complexity, particularly when processing multiple samples simultaneously under time-sensitive chemical reaction conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Protein Extraction and Generation of Peptides for Chemical-tagging
2:05
Sample Digestion
3:16
Dimethylation Labeling (N-termini)
5:13
Isobaric Tagging (Lys residues)
6:12
Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) and MS3
7:02
Results: cPILOT Can Be Used to Analyze Tissues from an Alzheimer's Disease Mouse Model and Wild-type Controls
8:23
Conclusion
