拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）

この高度なマルチプレックス法の全体的な目的は、サンプル誤差と分析時間を削減しつつ、同時に分析可能なタンパク質サンプルの数を増やすことです。この手法は、老化、神経変性疾患、その他の加齢に伴う疾患、およびがんの分野において、病因、進行、診断、予後、および治療標的に関連する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、多くの条件下におけるタンパク質変化の包括的なスナップショットを生成できることです。

この手法はマウスモデルにおけるアルツハイマー病の知見を提供できるだけでなく、アルツハイマー病患者やその他のさまざまな疾患の組織サンプルにも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、短時間で複数のサンプルを同時に処理する必要があるため、困難に感じると思われます。アセチル化をタンパク質ニトロ化のアイソバリックタグ法と組み合わせることができると気づいたことがこの手法の着想であり、それがすべてのペプチドに対してグローバルに機能する技術を確立させる動機となりました。

本研究では、アルツハイマー病マウスモデルおよび野生型コントロールの脳、心臓、および肝臓組織を解析します。各組織サンプル60～90 mgをライシスチューブに移し、8 M urea含有PBS 500 µLを加えます。メカニカルホモジナイザーを用いてサンプルをホモジナイズします。

溶解チューブから組織ホモジネートを取り出し、マイクロ遠心チューブに移します。溶解チューブを 8 M urea 含有 PBS 100〜500 µL で洗浄し、その洗浄液を組織ホモジネートに合わせます。組織ホモジネートを15分間遠心分離します。

各サンプルから上清を回収します。BCAアッセイでタンパク質濃度を決定した後、各サンプルから100 microgramsのタンパク質を、個別にラベルを貼ったマイクロ遠心チューブに分注します。各サンプルにジチオスレイトールを添加します。

37 °Cで2時間インキュベートします。各サンプルにヨードアセトアミド（IAM）を加え、氷上で遮光して2時間インキュベートします。次に、各サンプルにL-システインを加え、室温で30分間インキュベートします。

30分後、塩化カルシウムを含むTris緩衝液を加え、尿素の最終濃度を2 Mに希釈します。各サンプルにL1 tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone処理済みトリプシンを加え、37°Cで24時間インキュベートします。

翌日、サンプルを液体窒素で急速冷凍してタンパク質消化を停止させ、次回の処理まで-80°Cで保存します。ジメチル化標識を行う前に、テキストプロトコルに記載されている方法でペプチドサンプルの脱塩を行い、真空遠心濃縮機で乾燥させます。ジメチル化標識の手順を開始するために、HPLCグレードまたはナノピュアグレードの水に溶解した1%酢酸でペプチドを再構成します。

各サンプルから50 µg分を分注し、新しい1.5 mLマイクロセントリフュージチューブに移します。再構成したペプチドの残量は、今後の実験のために-80 °Cで保存してください。次に実演する手順では、すべてのサンプルで化学的活性化反応が同じ時間行われるよう、試薬を迅速に添加することが極めて重要です。

ライトジメチル化で標識するためのサンプルに、60 mM ホルムアルデヒド溶液を 8 µL 加えます。ヘビージメチル化で標識するためのサンプルに、60 mM 13C・重水素標識ホルムアルデヒド溶液を 8 µL 加えます。ライトジメチル化で標識したサンプルに、24 mM シアノホウ水素化ナトリウムを 8 µL 加えます。

重水素化ジメチル化標記をしたサンプルに、24 mMのシアノホウ素化ナトリウムを8 µL加えます。サンプルをボルテックスし、その後、チューブシェーカーを用いて室温で約10分間穏やかに振盪します。1%アンモニアを16 µL加え、5分間静置して反応を停止させます。

5%ギ酸を8 µL添加して、反応混合物を再酸性化させます。軽鎖および重鎖のジメチル化ペプチドを混合し、計6つのサンプルを作成します。テキストプロトコルに従い、サンプルの脱塩を行います。

そして、真空遠心濃縮機を用いてサンプルを乾燥させます。ジメチル化サンプルのアイソバリックタグ付けを開始するために、まず、100 µgのジメチル化ペプチドをトリエチルアンモニウムビカルボネート（TEABバッファー）で再構成します。次に、アイソバリックタグキットの製造元のプロトコルに従って、アイソバリック試薬を調製します。

適切な量（この場合は41 µL）の溶解済みアイソバリックタグ試薬を各ペプチドサンプルに加え、約10秒間ボルテックスします。マイクロ遠心チューブシェーカーを用いて、室温で約1時間サンプルを振盪します。反応を停止させるため、各サンプルに8 µLのヒドロキシルアミンを加えます。

サンプルを室温で15分間インキュベートします。ラベル付けした6つのサンプルを単一の混合物にまとめ、脱塩します。0.1% formic acidを含む質量分析グレードの水でペプチドを再構成し、液体クロマトグラフィー用の準備をします。

0.65 µmフィルターを入れたマイクロ遠心チューブに、再構成したペプチドを加えます。その後、12,000 ×gで1分間遠心分離します。フィルターを取り出し、廃棄してください。

ろ過したペプチドをオートサンプラーバイアルに移します。各強陽イオン交換分画サンプルの6 µLをトラップカラムに注入します。C18材料を用いて2 cmまで充填します。

分析分離およびデータ収集の質量分析法を実行します。アルツハイマー病マウスモデルおよび野生型コントロールの脳、心臓、および肝臓組織を用いて、12プレックスのcPilot分析を行いました。前駆体データでは、m/z 643.854および647.875のピークで示される軽鎖および重鎖のジメチル化ペプチドが確認されました。

これらのペプチドを選択し、独立して単離し、衝突誘起解離（CID）を用いて断片化することで、これらのスペクトルを生成しました。検索の結果、ピークがホスホグリセレートキナーゼ1タンパク質のペプチドに由来することが示されました。これらのピークをさらに単離し、高エネルギー衝突解離（HCD）タンデム質量分析を行ったところ、図に示すようにレポーターイオンが観察されました。

12個のサンプルに関する情報を得るためには、2組の3段階質量分析スペクトルの両方が必要です。この例では、脳、肝臓、および心臓組織において、アルツハイマー病群と野生型コントロール群のイオン比が2つの生物学的レプリケート間で類似しています。各比較におけるフォールドチェンジ値は、脳と心臓におけるphosphoglyerate kinase oneのレベルがアルツハイマー病マウスで高く、肝臓では低いことを示唆しています。

この手法を習得すれば、適切に実施した場合、約5時間で完了させることができます。この手順を行う際は、サンプルの取り扱いに十分注意することが重要です。また、本手順に強陽イオン交換法や高pH分画法などの分離手法を組み込むことで、1日あたりの解析深度とカバレッジを向上させることができます。

このビデオを視聴することで、C-Pilotを用いたサンプルのマルチプレキシングを向上させる方法について十分に理解することができます。