拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）

この強化されたマルチプレックス分析法の全体的な目標は、サンプルエラーと装置時間を減らしながら、同時に分析できるタンパク質サンプルの数を増やすことです。この方法は、老化、神経変性疾患、その他の加齢性疾患、および病因、進行、診断、予後、および治療標的に関連する癌の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、多くの条件にわたるタンパク質の変化の包括的なスナップショットを生成できることです。

この方法は、マウスモデルでアルツハイマー病に関する洞察を得ることができますが、アルツハイマー病やその他のさまざまな疾患の患者の組織サンプルにも適用できます。一般に、この方法に不慣れな人は、短時間で同時に処理するサンプルが複数あるため、難しいと感じるでしょう。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、アセチル化をタンパク質ニトロ化のためのアイソベリックタグと組み合わせることができることを認識したときで、この手法をすべてのペプチドに対してグローバルに機能させる動機となりました。

この研究では、アルツハイマー病マウスモデルおよび野生型コントロールからの脳、心臓、および肝臓組織を分析します。各組織サンプルの60〜90ミリグラムを溶解チューブに移し、500マイクロリットルのPBSと8モル尿素を加えます。機械式ホモジナイザーを使用してサンプルを均質化します。

組織ホモジネートを溶解チューブから取り出し、微量遠心チューブに移します。溶解チューブを100〜500マイクロリットルのPBSと8モル尿素ですすぎ、リンス溶液を組織ホモジネートと組み合わせます。組織ホモジネートを15分間遠心分離します。

各サンプルから上清を掴みます。BCAアッセイを実施してタンパク質濃度を測定した後、各サンプルから100マイクログラムのタンパク質を、個別に標識した微量遠心チューブに加えます。各サンプルにジチオスレイトールを添加します。

そして、摂氏37度で2時間インキュベートします。ヨードアセトアミド(IAM)を各サンプルに加え、暗所で氷上で2時間インキュベートします。次に、各サンプルにL-システインを添加し、室温で30分間インキュベートします。

30分後、塩化カルシウムを含むトリスバッファーを添加し、尿素を最終濃度2モルまで希釈します。L1トシリメトフェニルエチルコラーメチルケトン処理トリプシンを各サンプルに加えます。そして、摂氏37度で24時間インキュベートします。

翌日、サンプルを液体窒素で急速凍結してタンパク質消化を急冷し、さらなる処理まで摂氏マイナス80度で保存します。ジメチル化標識に先立ち、ペプチドサンプルをテキストプロトコールに記載されているように脱塩し、真空遠心分離により乾燥します。ジメチル化標識手順を開始するには、HPLCまたはナノピュアグレードの水に溶解した1%酢酸にペプチドを再構成します。

各サンプルの50マイクログラムの部分を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。再構成したペプチドの残りは、将来の実験のために摂氏マイナス80度で保存します。次に説明する手順では、試薬を迅速に追加して、化学反応がすべてのサンプルに対して同じ時間行われるようにすることが重要です。

60ミリモルのホルムアルデヒド溶液を8マイクロリットルサンプルに加えて、軽いジメチル化で標識します。60ミリモルの炭素13重水素標識ホルムアルデヒド溶液を8マイクロリットルサンプルに加えて、重いジメチル化で標識します。8マイクロリットルの24ミリモルシアノ水素化シヤノボウ素ナトリウムを、光ジメチル化で標識したサンプルに加えます。

24ミリモルのシアノボロドデリドナトリウムを8ミリリットルで、重いジメチル化で標識したサンプルに加えます。サンプルをボルテックスし、チューブシェーカーで室温で約10分間静かに振とうします。16マイクロリットルの1%アンモニアを5分間加えて反応を急冷します。

5%ギ酸の8マイクロリットルを添加することにより、反応混合物を再酸性化します。軽質ジメチル化ペプチドと高ジメチル化ペプチドを組み合わせて、合計6つのサンプルを生成します。テキストプロトコルで説明されているように、サンプルの脱塩を実行します。

そして、真空遠心分離によってサンプルを乾燥させます。ジメチル化サンプルの等重体標識であるためには、まず、100マイクログラムのジメチル化ペプチドと重炭酸トリエチルアンモニウム、またはTEAB緩衝液を再構成します。次に、アイソバリックタギングキットのメーカーのプロトコルに従ってアイソバリック試薬を調製します。

適切な容量、この場合は41マイクロリットルの可溶化同重体標識試薬を各ペプチドサンプルに加え、約10秒間ボルテックスします。微量遠心チューブシェーカーでサンプルを室温で約1時間振とうします。反応を急冷するには、各サンプルに8マイクロリットルのヒドロキシルアミンを加えます。

そして、サンプルを室温で15分間インキュベートします。標識された6つのサンプルを1つの混合物にプールし、脱塩します。液体クロマトグロフィ用のペプチドを調製するには、0.1%ギ酸を含む質量分析グレードの水でペプチドを再構成します。

再構成したペプチドを、0.65μmフィルターが入った微量遠心チューブに加えます。そして、12, 000倍gで1分間遠心分離します。フィルターを取り外して廃棄します。

ろ過したペプチドをオートサンプラーバイアルに移します。各強陽イオン交換派閥サンプルの6マイクロリットルをトラップカラムに注入します。カーボン18素材で2センチに詰めます。

分析分離およびデータ取得質量分析計メソッドを実行します。アルツハイマー病マウスモデルおよび野生型コントロールからの脳、心臓、および肝臓組織の12プレックスcPilot解析を実施しました。プリカーサーデータでは、m/z 643.854 および 647.875 のピークで表される軽度および重質のジメチル化ペプチドが示されました。

これらのペプチドを選抜し、独立して単離し、共謀による解離により断片化してこれらのスペクトルを生成しました。検索結果から、ピークはタンパク質ホスホグリセリン酸キナーゼ1のペプチドに属していることが示されました。これらのピークは、高エネルギーの共謀解離タンデム質量分析のためにさらに分離され、レポーターイオンが示されているように観察されます。

12個のサンプルに関する情報を取得するには、両方のトリプルステージ質量分析スペクトルのセットが必要です。この例では、アルツハイマー病と野生型の制御イオン比は、脳、肝臓、および心臓組織の 2 つの生物学的複製で類似しています。各比較の倍率変化値は、脳と心臓のホスホグリレートキナーゼ1レベルがアルツハイマー病マウスでは高いが、肝臓では低いことを示唆しています。

このテクニックは、一度マスターすれば、適切に行えば約5時間で習得できます。この手順を試行する際は、サンプルの取り扱いに注意することを覚えておくことが重要です。この手順に組み込まれると、日当の深さとカバレッジを拡大するために、強陽イオン交換や高pH分画などの分離方法を実行できます。

このビデオを見れば、C-Pilotを使用してサンプルマルチプレックスを強化する方法について十分に理解できるはずです。