Name: 拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T10:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学ぶcPILOT法による組織の多重化定量プロテオミクス。マウスのアルツハイマー病モデルと野生型対照の脳・心臓・肝臓組織を用いて、タンパク質変化を網羅的に解析し、神経変性疾患の病態解明と治療標的発見に貢献する。

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著者はRASRにピッツバーグ大学のスタート・アップ・ファンドおよびNIH、NIGMS R01の助成金（GM 117191から01）を認めます。

倫理文：マウスは、独立した非営利生物医学研究機関から購入し、ピッツバーグ大学の実験動物資源部門に収容しました。全ての動物プロトコルは、ピッツバーグ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 化学タギング1.タンパク質抽出およびペプチドの生成<ol><li> 組織、細胞、または体液からタンパク質を抽出します。 <ol><li>機械式ホモジナイザーを用いて8 M尿素（500μL）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）で組織の60〜90 mgの（ 例えば 、脳、心臓、および肝臓）を均質化します。必要であれば、プロテアーゼまたはホスファターゼ阻害剤を緩衝液に添加してもよいです。このプロジェクトでは、彼らが使用されませんでした。ホモジナイザーは、次のパラメータを使用する：行列Aビーズ、4メートル/秒、20秒を溶解します。心臓組織は、均質化の最大9サイクルが必要な場合があります。 注：プロテアーゼまたはホスファターゼ阻害剤<html>必要であれば、Sがバッファに追加されてもよいです。彼らは、この研究で使用されませんでした。 <ol><li>溶解チューブから組織ホモジネートを取り外し、マイクロ遠心チューブに移します。 8 M尿素を含むPBSの100-500μLで管を溶解リンスし、組織ホモジネートと共にリンス液を組み合わせます。 </li></ol></li><li>ホモジナイズした組織を遠心分離（9447×gで、4℃、15分）し、上清を集めます。 </li></ol></li><li> 製造業者の指示に従ってビシンコニン酸（BCA）アッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。 注：タンパク質濃度が高すぎると、バッファとのさらなる希釈が必要な場合があります。これらの組織からの試料について得られた濃度は6-13μgの/μLの間にありました。 <ol><li>オプション：比1μgの標準と内部品質管理基準（ 例えば 、ウシ、アルファカゼインまたはその他の外因性タンパク質）を追加します：100μgタンパク質サンプル。 </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 2。試料分解<ol><li>個々のマイクロ遠心管を標識するために、各試料からのタンパク質の100μgの（100×10 -6 g）を加えます。ボリュームは、タンパク質濃度に依存している（ステップ1.2参照）。 </li><li>各サンプルに：（モル比をサンプリングする1試薬40）ジチオスレイトール（DTT）を加えます。 2時間37℃でインキュベートします。モル比の計算は、66.5×10 3グラム/モルであるウシ血清アルブミン（BSA）のタンパク質の質量をオフに基づいています。 </li><li>各サンプルに：（モル比をサンプリングする1試薬80）ヨードアセトアミド（IAM）を加えます。 2時間暗所で氷上でインキュベートします。この反応は、副反応を防止するために、2時間氷上で行われます。 </li><li>各サンプルに：（モル比をサンプリングする1試薬40）L-システインを加えます。室温で30分間インキュベートします。 </li><li> 2 Mの最終濃度となるように尿素を希釈するために10mMのCaCl 2を液（pH 8.2）を含む20mMトリス緩衝液を加えます</li><li> 50（トリプシン - 処理L-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン（TPCK）を追加：モル比を酵素に1基板）を各試料に24時間37℃でインキュベートします。 </li><li>フラッシュ凍結さらに処理するまで-80℃で液体窒素とストア内のサンプルによるタンパク質消化をクエンチします。 </li></ol> 3.サンプルの脱塩<ol><li>ギ酸（FA）を添加することによって、サンプルを再酸性化します。 0.1％の最終濃度を得るために十分なFAを追加します。サンプルは-80℃で、元々ある場合は、再酸性化の前に氷上でサンプルを解凍。 </li><li>以前に16を説明したようにC 18の親水性親油性バランス（HLB）10 mgのカートリッジを用いて脱塩ペプチド。 </li><li> 〜10μLの体積に真空遠心分離（5トル、45℃、77 XG）によって試料を乾燥させます。 </li></ol> 4.ジメチル化標識（N末端） <ol><li>高速液体クロマトグラフィー（HPLC）またはナノ純グレードの水に溶解し、1％酢酸（0.25μgの/μL）でペプチドを再構成します。 50μを削除;グラム新しい微量遠心管に部分（1.5 mL）に溶解し、-80℃で剰余を格納します。 </li><li>それぞれ、軽鎖または重ジメチル化で標識するためのサンプルに60 mMの8μL（4％）CH 2 O（37％重量/ V）または60 mMの（4％）13 CD 2 O（20％重量/体積）を追加。典型的には、試薬の4μLは、ペプチドの25μgの（ステップ4.2、4.3、4.6）ごとに添加されます。 </li><li>それぞれ、軽鎖または重ジメチル化で標識された試料に24ミリモルのNaBH 3 CNまたは24 mMのNaBD 3 CNの8μLを加えます。 </li><li>ボルテックスし、室温で約10分間、チューブシェーカーで振ります。 </li><li> 5分間、1％のアンモニア（〜28から30パーセントのV / V）の16μLを添加することにより反応をクエンチしました。典型的には、試薬の8μL、ペプチド25μgのあたりに添加されます。 </li><li> 5％FA（98％v / v）での8μLを添加することにより反応混合物を再酸性化。 </li><li> 6個のサンプルの合計を生成するために、軽鎖および重ジメチルペプチド（ 図1）を結合します。 表1を参照してください。 </stronG&gt;サンプルのタグ付けとプールの説明については、この研究のために使用されます。 </li><li>ステップ3.2及び3.3に従ってサンプル脱塩を行います。 </li></ol> 5.同重体タギング（リジン残基） <ol><li>トリエチルアンモニウム重炭酸塩（TEAB）緩衝液（pH約8.5）を100mMにジメチル化ペプチド100μgの（を1μg/μL）を再構成します。 </li><li>製造業者のプロトコルに記載の同重体試薬を調製し（ 材料/試薬の表を参照のこと）。 </li><li>ペプチドおよび〜10秒間ボルテックスに可溶化されたアイソバリック試薬（41μL）を追加します。約1時間のマイクロ遠心チューブシェーカー上でサンプルを振ります。 8μLヒドロキシルアミン（w / vの10％）で反応をクエンチし、室温で15分間、サンプルをインキュベートします。 </li><li>さらに使用するまで-80℃でプール単一の混合物に6つの標識された試料と（ステップ3.1-3.3）を脱塩またはストア。 注：プロテオームカバレッジ及び深さを向上させるために、多次元分離戦略が提案されています以下のような強カチオン交換（SCX）。 </li></ol> 6.強カチオン交換<ol><li>製造業者のプロトコルに従ってSCXを行う（ 材料表を参照）。 <ol><li>ギ酸アンモニウム溶液の約1ミリリットル（20ミリメートル、40ミリメートル、60ミリメートル、80ミリメートル、100ミリメートル、150ミリメートル、250ミリメートル、および500 mM）の10％アセトニトリル（ACN）、0.1％FA（PH 3）とを準備します。 </li><li>ピペットチップの上部から赤色キャップを取り外し、梱包材料がピペットチップの底部に向かっていることを確実にするためにスラリーを充填してピペットチップをタップ。 注：重要：プロトコルの最後までピペットチップを捨てないでください。 </li><li>マイクロ遠心チューブ（2 mL）中の上部に遠心アダプタを配置し、内部ピペットチップを固定します。 </li><li>ピペットチップにSCXの再構成緩衝液の150μLを追加します。 </li><li>室温（4,000 XG）で6分間、ピペットチップを遠心。このステップをさらに2回繰り返し、廃棄物を捨てます。 </li><li> Pを溶かしますSCXの再構成緩衝液の150μLでeptides。 pHが3であることを確認してください。 </li><li>ピペットチップ、遠心分離機（6.1.5を参照）にペプチドを追加し、溶離液を保持します。 </li><li>新しいマイクロ遠心チューブ（2 mL）中にフィルタやピペットを転送し、20mMギ酸アンモニウム溶液の150μLを加えます。室温（4,000 XG）で6分間遠心分離し、溶出液を保ちます。 </li><li>繰り返しステップ6.1.8さらに7回、ギ酸アンモニウムの連続濃度（ すなわち、40ミリメートル、60ミリメートル、80ミリメートル、100ミリメートル、150ミリメートル、250 mMの500 mm）を使用。 </li></ol></li><li>マイクロ遠心チューブ（1.5 mL）を8つのSCX画分を移し、遠心蒸発を使用してそれらを濃縮する（ステップ3.3参照）。 </li></ol> 7.液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS / MS）及びMS 3 <ol><li> 0.1％FA、フィルターで質量分析グレードの水でペプチドを再構成し、オートサンプラーバイアルに入れます。 follとしてフィルターペプチドOWS： <ol><li> （ 材料表を参照） を 0.65μmのフィルターを含むマイクロ遠心チューブに再構成されたペプチドを加えます。 </li><li> 1分間12,000×gで遠心分離したペプチド。 、フィルターを取り外し廃棄し、そしてオートサンプラーバイアルに濾過ペプチドを追加します。 </li></ol></li><li>次のように移動相緩衝液を調製する：3％、0.1％FA（A）と（v / v）のACNから100％ACNと0.1％FA（B）と。 </li><li> C 18材料（5μM、200オングストロームの細孔サイズ）で2 cmの充填トラップカラム上に各SCX画分試料の6μLを注入します。 注：次のようにトラップで洗浄サンプル：3分、0％B。 2次元液体クロマトグラフィーシステムを使用して、3μL/分（ 材料表を参照）。 </li><li>分析分離方法を実行します。 C 18材料を充填した75μmのID X 13.2センチメートルレーザプルチップ溶融シリカ毛管カラム（5μM、100オングストローム）を使用します。勾配がある：0~5分、10％B。 5~40分、10~15％B。 40~90分で15~25％のB; 90から115分、25-30％B。 115-130分30〜60％のB。 130-135分、60~80％B。 135-145分、80％のB、145-150分、80から10パーセントのB。 150-180分、10％B。 300 NL /分、180分。 </li><li>分析分離法が実行されている間、質量分析計のためのデータ収集を実行します。 注：次のようにMSサーベイスキャンのパラメータは、400-1,600 のm / z、60,000解像度、自動利得制御（AGC）1×10 6イオン、最大注入時間500ミリ秒を標的とします。次のようにCID-MS / MSのためのパラメータは、次のとおりトップ1-7又はトップ8-14データ依存取得（DDA）3 のm / zの分離幅、500最小信号、35％の正規化衝突エネルギー（NCE）、0.25起動Q 、10ミリ秒の起動時間、3×10 4 AGC、50ミリ秒の最大注入時間。次のようにHCD-MS 3のパラメータは、次のとおり200最小信号4 のm / z分離幅、60％NCE、0.1起動時間、3×10 5 AGC、250ミリ秒IT、300-1,300 のm / z MS / MS選択範囲、非断片化された親イオンを除外する。 </li><li&gt;は、トップ1-7とトップ8-14の実行の両方に重複して各解析を実行します。 注：サンプルはオービトラップ又はtribrid質量分析計を含む器具の新しいモデル上で実行するため、DDAパラメータが変化し、より多くのMS / MS及びMS 3スキャンを含むように最適化することができます。また、tribrid器具ため、同期前駆選択（SPS）は、3を使用しなければならない-MS。 </li></ol> 8.データ分析16 <ol><li>例えば、マウスUNIPROTなど適切なデータベース、に対して、タンパク質解析ソフトウェアを使用してRAWファイルを検索します。 注：これは、軽および重ジメチル化ペプチドを探索するために、各RAWファイル用の2つのワークフローを作成することが重要です。 </li><li>以下のパラメータを用いてRAWファイルを検索2つの逃し切断、ペプチドの質量範囲300-6,000 DA、15ppmの親質量公差、1つのダフラグメンテーション公差とトリプシン。静的変更：光ジメチル化（28.031、ペプチドN末端）またはheavyジメチル化（36.076 DA、ペプチドN末端）、カルバミドメチル（57.021 DA、C）。 注：時々重ジメチル化ピークは約7 DA（35.069 DA、ペプチドN末端）は、光ジメチルピークからなっているので、重ジメチル化ペプチドの探索ワークフローに組み込まれるべきです。動的変更：酸化（15.995 DA、M）、6重アイソバリックタグ（229.163 Daの、K）。アイソバリックタグのレポーターイオン強度を検索するための偽発見率（ 例えば 1〜5％）および定量ノードを生成するおとりデータベース検索を含めます。 </li><li>統計<ol><li>タンパク質レポーターイオン値を正規化するために、電子スプレッドシートプログラムにデータをエクスポートします。各タンパク質について、それぞれ、内部標準の内部標準又は生レポーターイオン強度の中央値比によりメディアンレポーターイオン比または生レポーターイオン強度のいずれかを分割します。そのような電子スプレッドシートプログラム、ペールスとして適切な統計ソフトウェアを使用してくださいサンプル条件の間で有意な変化を決定するために、EUS、又はR。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者は何の競合する利害を持っていません。

cPILOTは12個の以上のユニークなサンプルの同時測定が可能になります。ペプチドの両方のN末端及びリジン残基で成功したタグを確保するためには、反応の各セットのための正しいpHを有し、かつ第一のペプチド標識のためのジメチル化反応を行うことが不可欠です。 N末端での選択的ジメチル化は、（±0.2）〜2.5でpHを有することによって行われます。これは、リジンおよびN末端にアミノ基のpKaのの違いを利用することによって達成されます。 pHが2.5で、リジンが非アクティブである（PKA〜10.5）。 pHが弱酸性である場合は、（ すなわち pHが5-7）、または基本的な、両方のN末端およびリジン残基がジメチル化されます。同重体標識は、低pHで最初に実行された場合に加えて、N末端は、等圧のラベルとリジン残基がジメチル化されなければなりません。これは、Bイオンを選択する必要があるようにMS 3のために選択される以下のフラグメントを生じ得ます。ジメチルの相対的なコストエーションの反応は、市販のアイソバリック試薬に比べて安価です。 1が100μgのあたり全体のアイソバリック試薬のバイアルを使用することができます...

プロテオミクスは、多くの場合、より良い疾患プロセスを理解するために使用される多くのサンプルを、酵素反応速度、翻訳後修飾、環境刺激に反応し、治療処置、バイオマーカーの発見、または薬物のメカニズムへの応答の分析を含みます。定量的な方法は、サンプルを横切るタンパク質レベルの相対的差異を測定するために使用することができ、ラベルフリーであるか、または同位体標識（代謝的、化学的、または酵素）を含むことができます。彼らは多くのサンプルを同時に分析することを可能にし、異なる細胞、組織、体液、または生物全体からのサンプルに適しているので、安定同位体標識法は、人気が成長しています。同位体標識法1、2、3、4、5、6、7増加実験スループット、取得時間、コスト、および実験誤差を低減します。これらの方法は、ペプチドピークからのタンパク質の相対存在量を測定するために、前駆体の質量スペクトルを使用します。対照的に、同重体標識試薬は、8、9、10は、いずれかのMS / MS又はMS 3スペクトル11で検出され、これらのピークは、タンパク質の相対存在量について報告するために使用されるレポーターイオンを生成します。 現在の最先端のプロテオミクス多重では、10プレックス12または12重アイソバリックタグの分析13のいずれかです。強化サンプル多重化（ すなわち &gt; 10個のサンプル）の方法は、セル18の分析のために他の人が組織14、15、16、17のために我々の研究室によって開発された、とされています</SUP&gt;、19、20、21、または標的化ペプチド22を組織します。私たちは、アイソバリックタグ（cPILOT）との組み合わせ前駆同位体標識と呼ばれる強化多重化技術を開発しました。グローバルcPILOTは、異なる試料条件（≥12）14を横切る全てのタンパク質の相対濃度に関する情報を取得するために有用です。 図1は、一般的cPILOTワークフローを示します。トリプシンまたはLys-Cペプチドは、選択的に低pH 2を用いてジメチル化とN末端と高いpHを使用して6-プレックス試薬とリジン残基で標識されます。この戦略は、実験的なコストを削減するのに役立ち、さらに、実験の手順や時間を削減するアイソバリック試薬を用いて分析することができ、サンプルの数が2倍になります。 我々は、酸化翻訳後MODIを研究するために他の方法を開発してきたようcPILOTは柔軟性があります3-ニトロチロシン修飾タンパク質14およびS-ニトロシル化（oxcyscPILOT）23とシステインを含むペプチドを含むfications、。我々はまた、アミノ酸の選択的アプローチ、システインcPILOT（cyscPILOT）17を開発しました。トップイオン11または選択-Y 1 -イオン法15とMS 3獲得は、レポーターイオンの干渉を軽減し、cPILOTの定量精度を向上させることができます。低解像度のイオントラップ機器は、24を動作することができるものの、取得方法におけるMS 3の使用は、オービトラップ質量分析器と高分解能機器を必要とします。 以前は、cPILOTは、アルツハイマー病のモデルマウスからの肝臓タンパク質16を研究するために使用されてきました。ここでは、peripheの役割を研究するために、脳、心臓、肝臓ホモジネートを使用してグローバルcPILOT分析を実行する方法について説明しますアルツハイマー病におけるRY。この実験は、生物学的複製を内蔵しています。そのためcPILOTの汎用性、興味のあるユーザーは、生物学的な問題やシステムの範囲のために他の組織を研究するために技術を使用することができます。

<table><tbody><tr><td>水 - MS グレード</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>W6-4</td><td>4 L 量は必要ありません</td></tr><tr><td>アセトニトリル - MS グレード</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>A955-4</td><td>4 L 量は必要ありません</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>J.T. ベイカー</td><td>9508-01</td><td></td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム溶液 (28 - 30%)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸アンモニウム</td><td>アクロス オーガニックス</td><td>208-753-9</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>フルカ アナリティカル</td><td>94318-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>BCA タンパク質アッセイキット</td><td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>バイオラッド</td><td>161-0731</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>バイオラッド</td><td>161-0716</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイオトール (DTT)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド (IAM)</td><td>Acros Organics</td><td>144-48-9</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Aldrich, Chemistry</td><td>168149-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK) treated Trypsin from usvine pancreas</td><td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>T1426-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド (CH2O) 溶液; 36.5 - 38% in H2</td>O <td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>F8775-25ML</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド (13CD2O) 溶液; 20 wt % D<>sub2O 中、98 原子 % D、99 原子 % 13C</td><td>Sigma Aldrich、化学</td><td>596388-1G</td><td></td></tr><tr><td>シアノ水素化ホウ素ナトリウム; 試薬グレード、95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156159-10G</td><td></td></tr><tr><td>シアノホウ素添加ナトリウム; 96 原子 % D、 98% CP</td><td>Sigma Aldrich, Chemistry</td><td>190020-1G</td><td></td></tr><tr><td>強陽イオン交換 (SCX) スピンチップ サンプル調製キット</td><td>Protea BioSciences</td><td>SP-155-24kit</td><td></td></tr><tr><td>トリエチルアンモニウム重炭酸塩 (TEAB) バッファー</td><td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 反応 (1 x 0.8 mg)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロキシルアミン塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich, Chemistry</td><td>255580-100G</td><td></td></tr><tr><td>標準ボルテックスミキサー</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>2215365</td><td>どのミキサーでも使用可能</td></tr><tr><td>オアシスHLB 1cc(10mg)抽出カートリッジ</td><td>ウォーターズ</td><td>186000383</td><td>これらはC18カートリッジです</td></tr><tr><td>Visiprep SPE真空マニホールド、DL(使い捨てライナー)、24ポートモデル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>57265</td><td>12ポートモデルでも十分</td></tr>です <tr><td>Speed-vac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD1010</td><td>どのブランドのスピードvacでも十分です</td></tr><tr><td>ウォーターバスチャンバー</td><td>Thermo Scientific</td><td>2825/2826</td><td>&nbsp; 温度が制御されたウォーターバスチャンバーで十分です。</td></tr><tr><td>メカニカルホモジナイザー (つまり FastPrep-24 5G)</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler</td><td>Sciex</td><td>-</td><td>このモデルはもう利用できません。オートサンプラーを備えたnano LCであれば十分です。</td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos 質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td> <td>-</td> <td>このモデルは販売を終了しました。その他の高分解能装置(Orbitrap Elite、Orbitrap Fusion、Orbitrap Fusion Lumosなど)も使用できます。</td></tr><tr><td>タンパク質ソフトウェア(例: Proteome Discoverer)</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGABSFAKJMAUH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>分析天びん</td><td>メトラー・トレド</td><td>AL54</td><td></td></tr><tr><td>攪拌板</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>どのブランドの攪拌板でも十分</td></tr><tr><td>pHメーター (トリス互換性)</td> <td>フィッシャー・サイエンティフィック (アキュメット)</td> <td>13-620-183</td><td>どのブランドの pH メーターでも十分</td></tr><tr><td>pH 10 バッファー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>06-664-261</td><td>どのブランドの pH バッファー 10 でも十分な</td></tr><tr><td>pH 7バッファー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>06-664-260</td><td>任意のブランドのpHバッファー7で十分</td></tr><tr><td>1.5 mLエッペンドルフチューブ、500 pk</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>05-408-129</td><td>1.5 mL エッペンドルフチューブの任意のブランドで十分</td></tr><tr><td>0.6 mL エッペンドルフチューブ、500 パック</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>04-408-120</td><td>0.6 mL エッペンドルフチューブの任意のブランドで十分です</td></tr><tr><td>0.65 &micro;m Ultrafree MC DV 遠心フィルターユニット</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30DV00</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 微量遠心チューブ、72 ユニット</td><td>Thermo Scientific</td><td>69720</td><td></td></tr><tr><td>C18 梱包材 (5&nbsp;&マイクロ;メートル、100 &Aring;)</td><td>Bruker</td><td>PM5/61100/000</td><td>この商品はBrukerからの取り扱いは終了しました。記載されている仕様の代替梱包材は、</td></tr><tr><td>C18梱包材で十分です(5&nbsp;&マイクロ;メートル、200 &Aring;)</td><td>Bruker</td><td>PM5/61200/000</td><td>この商品はBrukerからの取り扱いは終了しました。記載されている仕様の代替梱包材で十分です</td></tr></tbody></table>

拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cpilot）

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

病気の理解とバイオマーカー探索のために多くの生物学的サンプルを分析するための需要が高まっています。複数のサンプルの同時測定を可能に定量プロテオミクス戦略が普及し、大幅に実験的なコストと時間を削減しています。私たちの研究室では、伝統的な同位体ラベルまたはアイソバリックタグ付けアプローチのサンプル多重化を強化する同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）を組み合わせ、前駆体と呼ばれる技術を開発しました。グローバルcPILOTは、細胞、組織、体液、または生物全体に由来するサンプルに適用し、異なる試料条件を横切る相対タンパク質存在量に関する情報を提供することができます。 cPILOTは（ 材料/試薬の表を参照） を選択dimethylateペプチドのN末端に低pH緩衝液条件を使用し、2）市販のアイソバリック試薬とリジン残基の一級アミンを標識するために高pH緩衝液条件を使用して）1によって働きます。度利用可能なサンプルの多重化が使用される前駆体ラベルおよび同重体標識試薬の数に依存します。ここでは、1回の分析でのマウス組織からの12個のサンプルを分析するために六プレックスアイソバリック試薬と組み合わせ軽および重ジメチル化を使用して、12プレックス分析を提示します。強化多重化は、実験の時間とコストを削減し、より重要なことには、より少ない実験バイアスとエラーを有する多くのサンプル条件を横断比較（生物学的複製、病期、薬物治療、遺伝子型、又は長手方向時点）を可能にするために有用です。この作品では、グローバルcPILOTアプローチは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの生物学的複製を越え、脳、心臓、および肝臓組織を分析するために使用されます。グローバルcPILOTは、他の生物学的プロセスを研究するために適用され、20個の以上のサンプルにサンプル多重化を増大させるために適合させることができます。

cPILOTは、N末端およびリジン残基のラベルペプチドを化学的にアミン系化学物質を使用し、サンプル多重化機能を強化します。 図2は、アルツハイマー病のマウスモデルおよび野生型対照からの脳、心臓、および肝臓組織の12プレックスcPILOT分析から得られた代表的なMSデータを示します。 表1に示されているように、アルツハイマー病および野生型マウスのための2つの生物学的反復は、この12-プレックス解析に含まれています。 図2Aは、ペプチドに組み込まれた単一ジメチル基を表す4 のm / z間隔によって分離されて二重荷電ピークのペアを示しています。光このペアの重ジメチル化ピークの両方は、独立して単離し、CIDと断片化されています。ジメチル化ペプチドのそれぞれのためのMS / MSデータは、 図2BおよびCに示されています。検索結果は、このパイを示していますピークのrがT（ジメチル）ELNYFAK...

組み合わせ前駆同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）は、アイソバリックタグのサンプル多重化機能を強化し、定量プロテオミクス戦略です。このプロトコルは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの組織へのcPILOTの適用を説明しています。

拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

この高度なマルチプレックス法の全体的な目的は、サンプル誤差と分析時間を削減しつつ、同時に分析可能なタンパク質サンプルの数を増やすことです。この手法は、老化、神経変性疾患、その他の加齢に伴う疾患、およびがんの分野において、病因、進行、診断、予後、および治療標的に関連する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、多くの条件下におけるタンパク質変化の包括的なスナップショットを生成できることです。この手法はマウスモデルにおけるアルツハイマー病の知見を提供できるだけでなく、アルツハイマー病患者やその他のさまざまな疾患の組織サンプルにも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、短時間で複数のサンプルを同時に処理する必要があるため、困難に感じると思われます。アセチル化をタンパク質ニトロ化のアイソバリックタグ法と組み合わせることができると気づいたことがこの手法の着想であり、それがすべてのペプチドに対してグローバルに機能する技術を確立させる動機となりました。本研究では、アルツハイマー病マウスモデルおよび野生型コントロールの脳、心臓、および肝臓組織を解析します。各組織サンプル60～90 mgをライシスチューブに移し、8 M urea含有PBS 500 µLを加えます。メカニカルホモジナイザーを用いてサンプルをホモジナイズします。溶解チューブから組織ホモジネートを取り出し、マイクロ遠心チューブに移します。溶解チューブを 8 M urea 含有 PBS 100〜500 µL で洗浄し、その洗浄液を組織ホモジネートに合わせます。組織ホモジネートを15分間遠心分離します。各サンプルから上清を回収します。BCAアッセイでタンパク質濃度を決定した後、各サンプルから100 microgramsのタンパク質を、個別にラベルを貼ったマイクロ遠心チューブに分注します。各サンプルにジチオスレイトールを添加します。37 °Cで2時間インキュベートします。各サンプルにヨードアセトアミド（IAM）を加え、氷上で遮光して2時間インキュベートします。次に、各サンプルにL-システインを加え、室温で30分間インキュベートします。30分後、塩化カルシウムを含むTris緩衝液を加え、尿素の最終濃度を2 Mに希釈します。各サンプルにL1 tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone処理済みトリプシンを加え、37°Cで24時間インキュベートします。翌日、サンプルを液体窒素で急速冷凍してタンパク質消化を停止させ、次回の処理まで-80°Cで保存します。ジメチル化標識を行う前に、テキストプロトコルに記載されている方法でペプチドサンプルの脱塩を行い、真空遠心濃縮機で乾燥させます。ジメチル化標識の手順を開始するために、HPLCグレードまたはナノピュアグレードの水に溶解した1%酢酸でペプチドを再構成します。各サンプルから50 µg分を分注し、新しい1.5 mLマイクロセントリフュージチューブに移します。再構成したペプチドの残量は、今後の実験のために-80 °Cで保存してください。次に実演する手順では、すべてのサンプルで化学的活性化反応が同じ時間行われるよう、試薬を迅速に添加することが極めて重要です。ライトジメチル化で標識するためのサンプルに、60 mM ホルムアルデヒド溶液を 8 µL 加えます。ヘビージメチル化で標識するためのサンプルに、60 mM 13C・重水素標識ホルムアルデヒド溶液を 8 µL 加えます。ライトジメチル化で標識したサンプルに、24 mM シアノホウ水素化ナトリウムを 8 µL 加えます。重水素化ジメチル化標記をしたサンプルに、24 mMのシアノホウ素化ナトリウムを8 µL加えます。サンプルをボルテックスし、その後、チューブシェーカーを用いて室温で約10分間穏やかに振盪します。1%アンモニアを16 µL加え、5分間静置して反応を停止させます。5%ギ酸を8 µL添加して、反応混合物を再酸性化させます。軽鎖および重鎖のジメチル化ペプチドを混合し、計6つのサンプルを作成します。テキストプロトコルに従い、サンプルの脱塩を行います。そして、真空遠心濃縮機を用いてサンプルを乾燥させます。ジメチル化サンプルのアイソバリックタグ付けを開始するために、まず、100 µgのジメチル化ペプチドをトリエチルアンモニウムビカルボネート（TEABバッファー）で再構成します。次に、アイソバリックタグキットの製造元のプロトコルに従って、アイソバリック試薬を調製します。適切な量（この場合は41 µL）の溶解済みアイソバリックタグ試薬を各ペプチドサンプルに加え、約10秒間ボルテックスします。マイクロ遠心チューブシェーカーを用いて、室温で約1時間サンプルを振盪します。反応を停止させるため、各サンプルに8 µLのヒドロキシルアミンを加えます。サンプルを室温で15分間インキュベートします。ラベル付けした6つのサンプルを単一の混合物にまとめ、脱塩します。0.1% formic acidを含む質量分析グレードの水でペプチドを再構成し、液体クロマトグラフィー用の準備をします。0.65 µmフィルターを入れたマイクロ遠心チューブに、再構成したペプチドを加えます。その後、12,000 ×gで1分間遠心分離します。フィルターを取り出し、廃棄してください。ろ過したペプチドをオートサンプラーバイアルに移します。各強陽イオン交換分画サンプルの6 µLをトラップカラムに注入します。C18材料を用いて2 cmまで充填します。分析分離およびデータ収集の質量分析法を実行します。アルツハイマー病マウスモデルおよび野生型コントロールの脳、心臓、および肝臓組織を用いて、12プレックスのcPilot分析を行いました。前駆体データでは、m/z 643.854および647.875のピークで示される軽鎖および重鎖のジメチル化ペプチドが確認されました。これらのペプチドを選択し、独立して単離し、衝突誘起解離（CID）を用いて断片化することで、これらのスペクトルを生成しました。検索の結果、ピークがホスホグリセレートキナーゼ1タンパク質のペプチドに由来することが示されました。これらのピークをさらに単離し、高エネルギー衝突解離（HCD）タンデム質量分析を行ったところ、図に示すようにレポーターイオンが観察されました。12個のサンプルに関する情報を得るためには、2組の3段階質量分析スペクトルの両方が必要です。この例では、脳、肝臓、および心臓組織において、アルツハイマー病群と野生型コントロール群のイオン比が2つの生物学的レプリケート間で類似しています。各比較におけるフォールドチェンジ値は、脳と心臓におけるphosphoglyerate kinase oneのレベルがアルツハイマー病マウスで高く、肝臓では低いことを示唆しています。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、約5時間で完了させることができます。この手順を行う際は、サンプルの取り扱いに十分注意することが重要です。また、本手順に強陽イオン交換法や高pH分画法などの分離手法を組み込むことで、1日あたりの解析深度とカバレッジを向上させることができます。このビデオを視聴することで、C-Pilotを用いたサンプルのマルチプレキシングを向上させる方法について十分に理解することができます。

enhanced-sample-multiplexing-tissues-using-combined-precursor

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

免疫組織化学は、タンパク質の局在と組織内での発現を評価するための強力な実験室技術です。現在の半自動定量法は主観性を招き、再現性のない結果をもたらすことがよくあります。ここでは、マルチスペクトルイメージングを用いたマルチプレックス免疫組織化学の方法と、タンパク質の発現と共局在の客観的定量方法について説明します。...

多重化された免疫組織化学染色およびマルチスペクトルイメージングを用いたタンパク質発現と共局在の定量

正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス...

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル

このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。...

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行う迅速な染色法について述べます。...

凍結組織切片の多スペクトル蛍光イメージングの迅速な方法

前駆体同位体標識とアイソバリックタグ(cPILOT)は、利用可能なアイソバリックタグで同時に分析できるサンプル数を増やすことができる、強化されたサンプル多重化戦略です。ロボットプラットフォームの組み込みにより、実験のスループット、再現性、定量的精度が大幅に向上しました。...

組み合わせ前駆体等位同位体ラベリングとアイソバリックタギング(cPILOT)を使用した自動サンプル多重化

多重バーコード画像解析により、最近、腫瘍微小環境の特性評価が改善され、細胞組成、機能状態、および細胞間相互作用の包括的な研究が可能になりました。本明細書では、高次元画像解析技術の使用を可能にする、オリゴヌクレオチド結合抗体およびサイクルイメージングのバーコードを用いた染色およびイメージングプロトコルについて説明する。...

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片におけるタンパク質イメージングマスサイトメトリーによるマルチプレックスmRNA検出の方法論を詳述しています。...

デュアルモダリティ分子地図作成:マルチプレックスmRNA検出とタンパク質イメージングマスサイトメトリーの統合

ここでは、同位体2重ラベリング戦略とArgC消化を用いて、単細胞ヒストンの翻訳後修飾解析を自動化するプロトコルを紹介します。このワークフローにより、クロマチンの異質性およびエピジェネティック応答の定量的かつ再現性が高く高感度なプロファイリングが単一細胞分解能で実現します。...

単細胞ヒストーンの翻訳後修飾(sc-hPTM2)の多重解析のための自動サンプル調製

本研究は、組織切片の直接的な空間バーコードと単一細胞マルチオーム解析を組み合わせた空間的Trekker–CUT&amp;Tagマルチオームプロトコルを提示します。このアプローチにより、遺伝子発現とヒストンH3K27ac修飾の空間的に分解された単一細胞プロファイリングを同時に可能にし、組織微細解剖学の文脈における遺伝子調節に関する機構的洞察を提供します。...

凍結組織切片におけるトランスクリプトームおよびエピゲノム標的の空間的に分解された統合マルチオミクスプロファイリング

学ぶcPILOT法による組織の多重化定量プロテオミクス。マウスのアルツハイマー病モデルと野生型対照の脳・心臓・肝臓組織を用いて、タンパク質変化を網羅的に解析し、神経変性疾患の病態解明と治療標的発見に貢献する。

拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）

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