単細胞ヒストーンの翻訳後修飾(sc-hPTM2)の多重解析のための自動サンプル調製

私たちは、翻訳後修飾のための全クロマチン異質性を研究する自動多重化法を用いて、単一細胞プロテオミクスを推進しています。このプロトコルが難しいのは、ピコグラムスケールのプロテオーム調製、多重標識、そして複雑な組合せ修飾ヒストンペプチドの分離にあります。まず、氷のように冷たいPBSで最終濃度200〜500細胞/マイクロリットルで肝細胞がんのG2/C3A肝細胞がん細胞を再構成します。

各ノズルのパルス幅と駆動電圧をメーカーが指定した値に設定してください。最大のピックアップ効率を得るためには、2つのノズル間のZオフセットが50マイクロメートル未満に差をつけることを心がけてください。各ノズルの最適な接点位置を特定し、ノズル設定タブのZ高表示を比較してください。

タプレックス多重方式では、1枚のスライドをフードのスライドホルダーに取り付け、それを楽器に移します。ピペットを使い、新しいPCRチューブにLCMSグレードのDMSOを150マイクロリットル分割します。チューブキャップを機器の扉に向けたウォッシュステーションの2番位置に置きます。

DMSOランを開始してください。DMSO吸引後に一度安定したドロップを得ます。PDCの透明度の変化に注目してください。

電圧を上げる必要がある場合もあります。安定性はドロップボリュームチェックで確認します。ヘッドカメラウィザードの設定を実行してカメラの位置合わせを行います。

DMSOを供給し、機器が自動的にノズルをフラッシュし、すべてのスライドで画像を撮影して品質管理できるようにします。これらの画像を確認し、すべてのスライドで均一なDMSOドロップを確認し、欠損や目標外のドロップがないか確認してください。セル懸濁液を吸引した後、1モジュールのセルを開き、背景キャプチャを行い、その後マッピングルーチンを実行して排出ゾーンを定義します。

解析を実行し、粒子のサイズと伸長に基づいてセルをゲート化します。次に、LCMSグレードの水で新鮮な消化マスターミックスを準備します。真空ポンプで氷の上で10分間溶液を脱ガスします。

消化混合物をスライドに配注した後、機器が自動的にノズルをフラッシュし、すべてのスライドを撮影します。各液滴が均一に消化混合物を受け取っているかを確認するために画像を確認しましょう。消化のために常温で一晩培養します。

蒸発運転と一晩の消化を始めたら、画像を検査してください。水滴が十分に乾いたら、走るのを止めます。もしそうでなければ、続けてさらに5分間乾燥させてください。

標識付けには、まず多重ヒストン誘導のためのストック溶液を準備します。ディスペンス後は、機器が自動的にノズルをフラッシュし、すべてのスライドを撮影します。画像を確認し、均等な分布とすべてのスライドでの滴の位置を正しく確認してください。

培養終了後、焼光用のヒドロキシアミン溶液を分散します。サンプルを取得するには、メインタブでランを選択し、ランタブでランをスタートします。ピックアップが終わったら、画像を確認して誤りがないか確認してください。

ピックアップが終わったら、ピックアッププレートのカバーを外します。その後、真空濃縮器で低温で乾燥させます。データ取得には高性能液体クロマトグラフィー法をプログラムしてください。

MS 2実験は、50質量のオーバーチャージ、高エネルギー衝突解離27%、自動利得制御目標1000%のアイソレーションウィンドウを含ませるように設定します。プレートをゴムシールマットで覆い、オートサンプラー内に置きます。生ファイルを取得した後、クロマトグラムを簡単に確認し、生データをEpiProfileバージョン2.1で実行します。正規化ヒストンのPTM存在比の出力表を確認し、下流解析に活用してください。

最初の20種類のヒストンH3ペプチドフォームを定量化し、対照および酪酸ナトリウム処理条件下での相対的な存在比を示しました。H3 K9アセチル化およびH3 K 14アセチル化は、酪酸ナトリウム処理後に相対的に高い存在比を示しました。一方、H3 K9のアセチル化は、処理細胞でさらに濃縮されているように見えました。

ナトリウムブチレート処理後、総アセチル化レベルは増加し、処理細胞は単一細胞レベルで捉えられたより高い異質性を反映した対照群に比べて誤差分布が広がりました。単一および同時出現するヒストン修飾の定量化により、組み合いアセチル化状態は酪酸ナトリウムによって最も強く影響を受けることが示されました。ブチレートナトリウム処理細胞の広範囲の分散は、球状体内の個々の細胞間の生物学的多様性の増加を示しました。

このプロトコルは、単一細胞溶液でのクロマチン状態を科学者が研究できるようにすることで、エピジェネティック研究のギャップを埋めます。このワークフローにより、高スループットのサンプル準備、サンプル多重化、無偏質量分析法が可能で、感度の高い単一細胞エピジェネティックデータと定量的なエピジェネティックデータの両方を生成できます。今後の研究では、クロマチンの調節ががん、代謝疾患、加成などの疾患状態にどのように影響しているかを探る予定です。