Name: 単細胞ヒストーンの翻訳後修飾(sc-hPTM2)の多重解析のための自動サンプル調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 学ぶ単細胞ヒストーン翻訳後修飾の自動多重解析法。Hep G2/C3A細胞を用いた同位体二重標識により、クロマチン異質性を高感度・再現性良く定量解析し、エピゲネティクス研究の効率化に貢献する。

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<ol><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+workflow+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+using+bottom-up+mass+spectrometry%3A+from+histone+extraction+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis.</a> J Vis Exp. (111), e54112(2016).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biol. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell protein analysis by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 60 (1), 1-9 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Khoury, L., Cantlon, J., Khan, S., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+sample+preparation+for+multiplexed+single-cell+proteomics+using+nPOP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP.</a> Nat Protoc. 19 (12), 3750-3776 (2024).</li>
<li>Lund, P. J., Kori, Y., Zhao, X., Sidoli, S., Yuan, Z. F., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labeling+and+quantitative+proteomics+of+acetylation+on+histones+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isotopic labeling and quantitative proteomics of acetylation on histones and beyond.</a> Methods Mol Biol. 1977 (1), 43-70 (2019).</li>
<li>Cutler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+profiling+of+single-cell+histone+post-translational+modifications+to+dissect+chromatin+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity.</a> Nature Communications. , (2025).</li>
<li>Davie, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate.</a> J Nutr. 133 (7 Suppl), 2485S-2493S (2003).</li>
<li>Stransky, S., Cutler, R., Aguilan, J., Nieves, E., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+reversible+histone+acetylation+and+dynamics+in+gene+expression+regulation+using+3D+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Investigation of reversible histone acetylation and dynamics in gene expression regulation using 3D liver spheroid model.</a> Epigenetics Chromatin. 15 (1), 35-35 (2022).</li>
<li>Stransky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+phenotypic+analysis+of+functional+3D+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Semi-automated phenotypic analysis of functional 3D spheroid cell cultures.</a> J Vis Exp. (1), e65086(2023).</li>
<li>Yuan, Z. F., Sidoli, S., Marchione, D. M., Simithy, J., Janssen, K. A., Szurgot, M. R., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブ</td><td>バイオ・ラッド</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro;L幅のパイプ先端はL幅が広い</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;L幅のパイプ先端はL幅が広い</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>384井戸PCRプレート Lo Bind&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>30129547</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル真空マニホールド</td><td>ミリポール</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル、オプティマ LC-MS/MS グレード</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>接着式PCRプレートホイル</td><td>サーモ・フィッシャー</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>無水アセトニトリル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>AA42311AK</td><td>バルク用のストック溶液をラベル付け</td></tr><tr><td>Arg-C Ultra、質量分析グレード</td><td>プロメガ</td><td>VA1831</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養グレードの水</td><td>コーニング</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>セレンヴィアル</td><td>スキエニオン</td><td>/</td><td>カタログ番号には引用文が付いています</td></tr><tr><td>DMSO、無水</td><td>サーモ・フィッシャー</td><td>D12345</td><td>ラベル ストック溶液</td></tr><tr><td>DTT</td><td>シグマ</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改良鷲の中型(DMEM)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>胎児用牛血清</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>蟻酸</td><td>熱力学</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>蟻酸 98%&ndash;LC-MSリクロプルに100%賛成</td><td>シグマ</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>ハンクのバランスソルトソリューション(HBSS)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(ウルトラピュア)</td><td>サーモ・フィッシャー</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>HPLCグレードアセトニトリル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLCグレードの水</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロキシルアミン溶液はH2O中に50&nbsp;wt.%を含んでいます</td><td>シグマ</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>n-ドデシルベータ-マルトシド(DDM)洗剤</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BN2005</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>オービトラップ・エクスプロリス480質量分析計</td><td>サーモ・フィッシャー</td><td>BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>パラホルマルデヒド 16%水溶液 EMグレード</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>PDC-CM(タイプ2コーティング)</td><td>スキエニオン</td><td>/</td><td>カタログ番号には引用文が付いています</td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、10x、pH 7.4、RNaseフリー</td><td>サーモ・フィッシャー</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>ピアースジメチルスルホキシド(DMSO)、LC-MSグレード</td><td>サーモ・フィッシャー</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>ピペットガン</td><td>エッペンドルフ</td><td>Z666467(ミリポール・シグマ)</td><td></td></tr><tr><td>プロピオン無水物&99%</td><td>シグマ</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>プロピオン無水物-d10 &ge;98原子 % D、および ge;99%(共産党)</td><td>シグマ</td><td>615692-1G</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>熱力学</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>SciCHIP H1コーティングガラススライド</td><td>スキエニオン</td><td>/</td><td>カタログ番号には引用文が付いています</td></tr><tr><td>SpeedVac真空濃縮器(96ウェル板)</td><td>熱力学</td><td>15308325</td><td>サヴァントSPD1010</td></tr><tr><td>無菌フード</td><td>熱力学</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>滅菌血清学的ピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX グリーンデッドセル染色、フローサイトメトリー用</td><td>サーモ・フィッシャー</td><td>S34860</td><td></td></tr><tr><td>TrypLEエクスプレス酵素(1X)、フェノールレッドなし</td><td>サーモ・フィッシャー</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>渦</td><td>シグマ</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>水浴</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr></tbody></table>

単細胞ヒストーンの翻訳後修飾(sc-hptm2)の多重解析のための自動サンプル調製

Automated Sample Preparation for the Multiplexed Analysis of Single-Cell Histone Post-Translational Modifications (sc-hPTM2)

単細胞ヒストンプロテオミクスワークフローの応用を示すために、5 mMのブチ酸ナトリウムで処理されたHepG2/C3A細胞の球状体を24時間解析しました。LC-MS/MS取得後、生データをEpiProfileで処理し、軽度(プロピオン酸無水物)および重度(プロピオン無水物-d10)の標識を行い、ペプチドおよびヒストンマークの存在比を示す正規化データを得ました。その後、QuantQC Rパッケージを用いて液体ハンドラーの取得メタデータをEpiProfile出力にマッピングし、各細胞のペプチド含有量および関連存在比の情報を取得し、少なくとも50%の単一細胞で一貫して検出されないペプチドフォームをフィルタリングし、単一細胞の強度の信号が空格の150%信号より大きくないペプチドフォームを除外しました。その後、データはlog(1+x)変換を用いて正規化され、下流解析に用いられる結果表が得られます。このテーブルは、さまざまなペプチドフォームの列と、各セルごとに同定されたペプチドフォームの存在比を示す列から成ります。
図7A は、定量化さ...

単細胞ヒストーンの翻訳後修飾(sc-hPTM2)の多重解析のための自動サンプル調製

Histone post-translational modifications (hPTMs) are central regulators of chromatin organization and gene expression. Their dysregulation is implicated ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このプロトコルは、質量分析（MS）を用いて、ヒストンの翻訳後修飾を特徴付けるための完全に統合されたワークフローの概要を説明します。ワークフローは、ナノ流液体クロマトグラフィーおよびデータ分析のための命令を使用して、細胞培養物または組織、ヒストン誘導体、消化、MS分析から、ヒストンの精製を含みます。 3日 - プロトコルは2以内に完了するために設計されています。...

ヒストンの抽出からデータ解析まで：ボトムアップ質量分析法を用いてヒストンの翻訳後修飾の解析のための完全なワークフロー

この原稿では、ヒストンとその翻訳後修飾を認識する抗体の特異性プロファイリングにペプチドマイクロアレイ技術を適用する方法が記載されています。...

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

この資料の目的は、ヒストン H3、H4...

H3 ・ H4 ヒストン蛋白質細胞および脳組織におけるアセチル化ヒストンの定量化の浄化

このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。...

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

ここで著者らは、網膜におけるトランスクリプトームおよびクロマチンアクセシビリティプロファイルを特徴付ける際の表現型決定およびその後のscRNA-seqおよびscATAC-seqのペアに対するMULTI-seqの有用性を示す。...

scRNA-SeqおよびscATAC-Seqを用いた網膜遺伝子発現およびクロマチンアクセシビリティの多重化解析

このプロトコルは、3次元細胞培養システムを使用して、ほぼ生理学的状態のクロマチン修飾をモデル化、処理、および分析する方法を概説しています。...

肝組織の3D細胞培養モデルにおけるヒストン翻訳後修飾のグローバルレベルの定量化

この研究は、単離された脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いた全体的なヒストン修飾の定量化のためのプロトコルについて説明しています。この研究には、データ収集に使用されたミクログリア分離プロトコルも含まれています。...

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光、飛行時間型質量分析(LC-TIMS-ToF...

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光分析、飛行時間型質量分析を用いたヒストン修飾スクリーニング(英語)

このプロトコルにより、さまざまな臨床サンプルから効率的なヒストン抽出が可能となり、その後の翻訳修飾解析(LC-MS/MS)が可能となります。主要なヒストン修飾の堅牢な検出を促進することで、大規模な臨床コホートにおける包括的なエピジェネティックプロファイリングの貴重なツールとなります。...

質量分析によるエピジェネティックプロファイリングのための臨床標本からヒストン抽出

ヒトのスピンドリンファミリーメンバー4(SPIN4)における遺伝的変異が最近、骨の過剰増殖という新しい発達障害の患者で確認されました。ヌクレオソームの文脈における修飾ヒストンの生化学的同定をSPIN4結合基質として記述するプロトコルと新しい結果が提示されています。...

ペプチドアレイおよびネイティブヌクレオソームプルダウンによるヒトスピンドリンファミリーメンバー4(SPIN4)の結合基質としての修飾ヒストンの同定

本研究は、組織切片の直接的な空間バーコードと単一細胞マルチオーム解析を組み合わせた空間的Trekker–CUT&amp;Tagマルチオームプロトコルを提示します。このアプローチにより、遺伝子発現とヒストンH3K27ac修飾の空間的に分解された単一細胞プロファイリングを同時に可能にし、組織微細解剖学の文脈における遺伝子調節に関する機構的洞察を提供します。...

凍結組織切片におけるトランスクリプトームおよびエピゲノム標的の空間的に分解された統合マルチオミクスプロファイリング

学ぶ単細胞ヒストーン翻訳後修飾の自動多重解析法。Hep G2/C3A細胞を用いた同位体二重標識により、クロマチン異質性を高感度・再現性良く定量解析し、エピゲネティクス研究の効率化に貢献する。

単細胞ヒストーンの翻訳後修飾(sc-hPTM2)の多重解析のための自動サンプル調製

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