高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）とグルコシノレートの抽出および分析のための簡単な方法
March 15th, 2017
ここでは、地上の植物材料からグルコシノレートを抽出するための確立された堅牢なプロトコルを非常に詳細に説明しています。抽出物のオンカラムスルファターゼ処理後、デスルホグルコシノレートを溶出し、高圧液体クロマトグラフィーで分析します。
このプロトコルの全体的な目標は、植物やその他の生物学的サンプル中のグルコシノレートの簡単でわかりやすい分析を行うことです。グルコシノレートを抽出して分析するこの方法は、植物昆虫生態学、植物病理学、植物育種、および食品科学における主要な質問に答えるために使用できます。この手法の主な利点は、十分に検証されており、幅広い生物学的サンプルに広く適用できることです。
この方法は主に植物材料中のグルコシノレートを定量するために使用されますが、土壌や調理済み食品にも適用できます。この抽出手順は、主に標準的なラボ機器を使用するため、ほとんどすべてのラボで実行できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、少なくとも一度は映画を読んで観察すると、分析と検査をより適切に実行できます。
手順を開始するには、10グラムのG-25架橋デキストリンゲルを125ミリリットルの超純水と混合します。混合物をキャップ付きのボトルに摂氏4度で保管します。次に、10, 000単位のH-1アリールスルファターゼを30ミリリットルの超純水に溶解します。
これに30ミリリットルの無水エタノールを加え、混合物をよく攪拌する。混合物をGの2,650倍で室温で20分間遠心分離します。上清をビーカーで90ミリリットルの無水エタノールと組み合わせます。
新しい遠心分離管を混ぜて注ぎます。混合物をGの1,030倍で室温で15分間遠心分離する。上清を捨てます。
ペレットを合計25ミリリットルの超純水に溶解して混合します。混合物をよくボルテックスし、次に混合物を1ミリリットルのチューブに移します。硫酸塩サンプルは摂氏20度で最大1年間保管してください。
次に、約90ミリグラムのシノグラムの重量を量り、その重量を1マイクログラムの精度で記録します。次に、シノグラム・モノハイドレートを10ミリリットルの超純水に溶解します。このシノグラムストック溶液から、50〜750マイクロモルの範囲の濃度の5つの参照溶液を調製します。
参照溶液は、摂氏20度で1.5ミリリットルのチューブに保管してください。次に、各サンプルとリファレンスについて、カラムラックの位置にある2ミリリットルの微量遠心チューブを標識します。各微量遠心チューブキャップに解剖針を刺し、後で凍結乾燥させます。
ラベル付きチューブを、ラベル付き列と同じ構成と間隔でブロックに配置します。ガラスピペットカラムを準備するには、木製またはガラス棒を使用して、1 cm x 1 cmのグラスウールをピペットにそっと押し込みます。ピペットバレルからステムへの移行時にグラスウールを詰めます。
ラック上のラベル付きの各位置にピペットカラムを置きます。ラックを廃棄物トレイの上に置きます。プラスチック製の1ミリリットルピペットチップの端を切り取ります。
準備したデキストリンゲルをよく振ってください。次に、幅を広げたピペットチップを使用して、準備したデキストリンゲルを0.5ミリリットルを各カラムにロードします。デキストリンゲルが漏れていないかカラムを確認し、漏れているカラムを交換します。
すべてのカラムにデキストリンゲルを充填したら、各カラムを1ミリリットルの超純水で洗浄します。50〜100ミリグラムのフリーストライドの重量を量り、安全キャップ付きの2ミリリットルの反応チューブで細かく粉砕された植物材料を計量し、0.1ミリグラムの精度で重量を記録します。各チューブに直径3mmの金属球を2つ入れます。
各チューブに1ミリリットルの70%メタノールを超純水に加え、各混合物を短時間ボルテックスします。追加の安全キャップでチューブを閉じ、すぐに摂氏90〜92度の水浴に入れます。のこぎりが沸騰し始めるまでチューブを加熱します。
チューブを超音波浴に移し、サンプルを15分間音波加熱します。超音波処理中に、硫酸塩サンプルとシノグラム参照の解凍を開始します。超音波処理後、サンプルを室温で10分間Gの2,700倍で遠心分離します。
上清と解凍したシノグラムリファレンスを対応するカラムにロードし、植物性物質をピペットに引き込まないように注意します。各チューブに1ミリリットルの70%メタノールを追加します。混合物を渦巻きにします。
そして、混合物を15分間超音波加熱します。以前と同じ条件でチューブを再度遠心分離します。上清を対応する列にロードします。
各カラムに70%メタノールの1ミリリットル部分を2つ追加し、各部分間でカラムを乾燥させます。各カラムの残留メタノールを1ミリリットルの超純水で洗い流します。次に、各カラムを 20 ミリモル酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 5.5) の 2 つの 1 ミリリットル部分で洗浄します。
酢酸ナトリウムバッファーの最後の部分が廃棄物ラックに排出されたら、ラックを廃棄物トレイから取り外し、ラックの足をティッシュで乾かします。ラベル付き微量遠心チューブのブロックの上にラックを置き、カラムの先端が対応するチューブにくるようにします。20マイクロリットルの硫酸塩溶液を各カラムにロードし、溶液がカラム材料の表面に到達することを確認します。
硫酸塩溶液を 50 マイクロリットルの酢酸ナトリウム緩衝液でカラム材料に洗い流します。硫酸塩がカラムに洗い流されることは非常に重要です。酵素は、カラムに結合した無傷のグルコシノレートに反応するためにカラム上に存在する必要があります。
硫酸塩溶液を各カラムに洗い流したら、カラムをアルミホイルで覆います。柱を一晩放置します。次に、各カラムからの脱スルホグルコシノレートを、2つの0.75ミリリットルの超純水でほのめ
かします。カラムが乾いたら、カラムラックを取り外し、各チューブにキャップをします。チューブを液体窒素で、または摂氏80度で少なくとも30分間凍結します。サンプルを12〜24時間凍結乾燥します。
各残留物を1ミリリットルの超純水に溶解します。次に、各サンプルと参照をラベル付きHPLCサンプルバイアルに移します。逆相CATカラムで抽出物を分離します。
検出波長は229ナノメートルです。HPLCで分離すると、グルコシノレートは、保持時間とUVスペクトルを既知のグルコシノレート標準と比較することで同定できます。サンプル中のグルコシノレート濃度は、シノグラムの検量線とレスポンスファクターの文献値から計算されます。
これにより、元の植物サンプル中のグルコシノレート濃度を決定できます。使用されるHPLC条件下では、不健康なプロゴイトリンはかなり早い段階で言及し、生物学的に有益なグルコラファニンから分離されます。エンドグルコシノレートもよく分離されています。
Lyotropic系列は、アルコノール、メチルフォール-アルコノール、および長鎖メチル-ソルフィノール-グルコシノレートの側鎖リンクの増加とともに観察されます。したがって、未知のグルコシノレートは、UVスペクトルと組み合わせたこれらのリオトロピックシリーズに基づいて暫定的に分類できます。適切な準備をすれば、1営業日で1人で150〜200のサンプルを抽出できます。
カラムでサンプルを凍結乾燥し、HPLC用に準備するには、さらに1日かかります。この手順に続いて、LCMSなどの他の方法を適用して、クロマトグラム中の未知のデスルホグルコシノレートを同定できます。このビデオを見れば、生物学的サンプルからグルコシノレートを抽出し、HPLCで分析する方法を十分に理解できるはずです。
メタノールでの作業は非常に危険であり、常にドラフトの下で行う必要があることを忘れないでください。
概要
この記事では、植物材料からグルコシノレートを高圧液体クロマトグラフィーを使用して抽出するための詳細なプロトコルを提示しています。この方法は、様々な生物学的サンプルに適用できるように設計されています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 植物-昆虫生態学
- 植物病理学
- 食品科学
背景
- グルコシノレートは植物の重要な化合物です。
- それらは植物の防御メカニズムで役割を果たします。
- その濃度の理解は様々な生物学的研究に役立ちます。
- このプロトコルは幅広いサンプルで検証されています。
研究の目的
- グルコシノレートの抽出と分析のための信頼できる方法を提供すること。
- 植物関連分野での研究を促進すること。
- 多様なサンプルにおけるグルコシノレートの定量化を可能にすること。
使用した方法
- デキストリンゲルとスルファターゼ溶液の調製。
- メタノールとソニケーションによるサンプル抽出。
- 分析のための高圧液体クロマトグラフィー。
- 保持時間とUVスペクトルを標準物質と比較すること。
主な結果
- 植物材料からのグルコシノレートの成功的な抽出。
- 様々な生物学的サンプルにわたる方法の検証。
- HPLCによるグルコシノレートの同定。
- 生態学および食品科学における潜在的な応用。
結論
- このプロトコルはグルコシノレート分析に効果的です。
- 様々な研究設定で使用できます。
- さらなる研究により植物科学における応用が拡大できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of glucosinolates supports target validation in plant-based bioactive compound discovery, enabling mechanistic de-risking of nutraceutical and crop protection candidates. This method provides predictive confidence in identifying beneficial versus detrimental glucosinolate profiles, informing lead identification and portfolio triage in agricultural biotechnology and functional food development. Its broad applicability across plant tissues and biological samples enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific glucosinolate structures to biological activities such as progoitrin (detrimental) or glucoraphanin (beneficial).
- Operational Value: Supports biological de-risking through reliable quantification of intact glucosinolates after myrosinase inactivation and sulfatase treatment.
- Predictive Value: Facilitates predictive confidence in target validation by generating quantitative data for structure-activity relationship analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering desulfoglucosinolates suitable for HPLC-based detection and quantification.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through sinigrin-based calibration curves and established response factors.
- Scalability: Enables processing of 150–200 samples per person per day, supporting high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase glucosinolate profiling to preclinical validation through disease-relevant systems in plant pathology and food sciences.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying harmful breakdown products (e.g., nitriles) versus beneficial ones (e.g., isothiocyanates) based on glucosinolate profiles.
- Biomarker Alignment: Enables translational biomarker development by correlating glucosinolate concentrations with phenotypic outcomes in ecological and breeding studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical support, particularly in nutraceutical and crop trait development pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying glucosinolate profiles that determine bioactive breakdown product formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs via HPLC with PDA/UV detection, enabling reliable compound evaluation across diverse plant matrices.
- Analytics: Provides measurable readouts (retention times, UV spectra, concentration calculations) that allow cross-condition comparison and structure-based classification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through applications in food safety and plant health, where glucosinolate breakdown products influence biological outcomes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical platform due to its reliance on standard lab equipment and broad sample compatibility (plant, soil, foodstuffs).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in bioactive compound identification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across laboratories using accessible equipment.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in bioactive compound development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated glucosinolate quantification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant sample preparation, enzymatic treatment, and HPLC operation.
- Depends on access to centrifuges, water baths, ultrasonic baths, freeze-dryers, and HPLC systems with PDA/UV detection.
- Necessitates cross-team standardization of extraction timing, sulfatase incubation, and reference curve preparation.
- Involves adaptation considerations for varying plant matrices (leaf, seed, root) and non-plant samples (soil, foodstuffs).
- Includes practical limitations such as methanol handling hazards requiring fume hood use and the 12–24 hour freeze-dry step affecting turnaround time.
