Name: 超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-15T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 学ぶ細菌細胞壁の分離と調製法を用いたネuropeptide組成解析。SDS溶解、pronase E消化、UPLCによる定量分析により、ペプチドグリカンの架橋度やグリカン鎖長を評価する。

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この作品は、NIHディレクターの新しいイノベーター賞DP2OD006466(K.C.H.)によって支えられていました。 著者らは、この方法の実践的なデモンストレーションと科学的な議論のためにラッセル・モンズに感謝する。

1. 一晩で2.5 mlの培地で細菌培養を成長させる
バック希釈培養 1:100 から 250 ml の新鮮な培地に、0.7-0.8 の OD600 に成長します。6%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の溶液を水中に調製する。
注意:SDS粉末は危険です - SDS粉末を吸入しないでください。鼻と口の上にマスクを着用してください。
2. 1日目 - 細菌培養を一日と一晩にわたって行う
<ol><li>希釈された培養物が成長している間、1 Lビーカーのホットプレートに熱湯浴を設置します。水が沸騰したら、6%SDSのアリコート6mlを50mlポリプロピレンチューブに加え、各チューブに小さな炒め棒を1つ加え、チューブの蓋を指密に固定し、チューブを水浴に入れ、ホットプレートで500rpmに攪拌します。</li>
	<li>室温で10分間5,000×gで250ml培養物を収穫し、3mlの培地または1xリン酸緩衝生理食塩水でペレットを再懸濁します。ピペットセルは、6%の沸騰SDSで50mlチューブにゆっくりとピペットセル懸濁液を使用して細胞をライスし(最終濃度4%SDS)、チューブは沸騰水浴中に沈み、蓋を指密に再密閉します。細胞懸濁液は、再懸濁後に沸騰SDSに素早く移す必要があります。突然の環境変化は、細胞壁構造の誤った変化を引き起こす可能性がありますので、避けるべきです。
</li>
	<li>沸騰水浴を覆い、細胞が3時間沸騰させ、定期的に水位をチェックし、必要に応じて水浴を補充します。3時間後、ホットプレートの発熱体をオフにし、500rpmで一晩撹拌し続ける。</li>
</ol>3. 2日目 - 酵素消化は1日の間に行われます
<ol><li>SDSが一晩50mlチューブに沈殿した場合は、水浴を1〜2時間沸騰させます。ヒートブロックを60°Cに切り上げる。 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0.06% w/v NaClでプロナーゼEの1mg/mlストックを準備し、少なくとも30分間60°CでプロナーゼEを活性化します。</li>
	<li>400,000×gに設定された超遠心分離機を使用して、大きなPGポリマーをペレット化し、他の細胞成分から精製するために、室温で20分間サンプルを回転させます。上清を慎重に取り出し、室温超純水中の各ペレットを再懸濁します。注:再懸濁液の量は、使用される超遠心チューブの体積に依存します。チューブを少なくとも半分の方法で満たすが、チューブの最大体積を超えないボリュームを使用してください。再懸濁中に水が気泡を形成しなくなるまで遠心分離/洗浄を繰り返し、SDSが完全に除去されたことを示します(通常は3回の洗浄)。白色の沈殿物が形成された場合はペレットの洗浄を中止し、これは、サキュリが一緒に凝集していることを示している。凝集は壊滅的ではありませんが、塊はプラスチックやガラス製品に非常に強く結合し、大きなサンプル損失を引き起こします。この場合、束状のサキュリサンプルを用いてプロトコルを進める。</li>
	<li>最後の遠心分離/洗浄ステップで、サンプルを10 mM Tris-HCl(pH 7.2)+0.06%w/v NaClの900 μlで再中断し、以前に小さな針で上部に穴を開けて突いた2mlチューブに移します。各サンプルに1mg/ml活性化プロナーゼE(100μg/ml最終濃度)の100 μlを加え、60°Cで2時間インキュベートします。別のヒートブロックを100°Cに設定します。</li>
	<li>プロナーゼEの消化を各サンプルに200 μlの6%SDSを加えて、100°Cのヒートブロックで30分間沸騰させます。異なるヒートブロックを37°Cに設定し、50 mMリン酸緩衝液(pH 4.9)に1mg/mlのムラミドーゼ(ムタノリシン)ストックを作ります。</li>
	<li>ステップ3.2のように、400,000×gに設定された超遠心分離機を使用して、室温で20分間サンプルを回転させ、SDSが完全に除去されるまで室温の超純水で洗浄します(通常は3回の洗浄)。リサスペンションの体積は、使用される超遠心管の体積に依存します。チューブを少なくとも半分の方法で満たすが、チューブの最大体積を超えないボリュームを使用してください。</li>
	<li>最後の遠心分離/洗浄ステップで、サンプルを50 mMリン酸ナトリウムバッファー(pH 4.9)の200 μlで再中断します。この体積は、試料中のペプチドグリカンの量に応じて調整することができ、種依存であってもよい。対象となる種のHPLC分析に関する報告が以前に公表されている場合、この量は、これらの定量に基づいて推定することができます(HPLC PG研究のコンパイルは、参照7の補足情報で見つけることができます)。他の種の場合、このステップまでサキュラスの準備を実行することができ、PGが溶液にとどまることを可能にする最小量を決定するために、サンプルを複製するために異なる量の再懸濁液量を追加することができます(さらなる推定値については、議論を参照)。サンプルにペプチドグリカンが多く含まれている場合は、再懸濁液の体積を増やします。サンプルにペプチドグリカンがほとんどない場合は、再懸濁液の体積を最低50 μlに減らします。</li>
	<li>サンプルを1.5mlチューブに移し、1mg/mlのムラミデを加え、最終濃度40μg/mlを与えます。6-8時間または37°Cで一晩インキュベートする。</li>
</ol>4. 3日目 - UPLCのサンプルの準備は最終日に行われます
<ol><li>ヒートブロックを100°Cに切り上げる。 SDSを使用せずにサンプルを5分間煮て、ムラミドーゼの消化を止めます。遠心分離機サンプルを室温で16,000×gで10分間、上清(ムロペプチドは現在溶けやすい)を13mm x 100mmのガラス管に移します。できるだけ多くの上清を回復してみてください, それを乱すことなく、ペレットに非常に近づく.</li>
	<li>500 mM ホウ酸塩バッファー (pH 9) をサンプルに加えて、最終濃度の 100 mM のホウ酸塩バッファーを調整します。ホウ酸塩緩衝液は、還元剤のホウ水素化ナトリウムと相性がある。1~2粒のホウ水素化ナトリウムを加えて各試料を減らし、室温で少なくとも30分間反応を進めます。注意:水素化水素ナトリウムは非常に反応性が高く、取り扱いに危険です - 皮膚との接触を避け(手袋を着用)、目との接触を避けてください(安全眼鏡を着用)。</li>
	<li>pHインジケーター用紙で測定したpH 6まで20μlの増分を使用して50%v/vオルトリン酸を用いてpH 3-4(ムロペプチド等電点は〜3.5)にサンプルを調整し、2 μlインクリメントを使用します。注意:オルソリン酸は腐食性であり、扱いに危険です - 皮膚との接触を避け(手袋を着用)、目との接触を避けてください(安全眼鏡を着用)。サンプルは、オルトリン酸の添加に応答して気泡する必要があります。サンプルがバブリングを停止すると、通常は pH 6 に達したことを示します。試料中にバブリングが起こらない場合、これは、添加されたホウ化水素ナトリウムの量が少なすぎることを示している可能性がある。この場合、pHの低下を止め、1粒または2粒のホウ化水素ナトリウムを慎重に加え、5〜10分間反応させてから、pH調整を再開する。</li>
	<li>0.22 μmのシリンジフィルターを通して、サンプルをUPLCバイアルに直接フィルターします。沈殿物が形成された場合は、濾過する前に炎を通していくつかのパスでチューブを加熱します。サンプルが一日以内にUPLC装置に注入されない場合は、一晩で-20°Cで凍結してください。サンプルは-80 °Cで1年間まで保存することができます。 試料は、炎を数回通過させることによって解凍することができます。</li>
	<li>各サンプルの10 μlを、C18 1.7 μm反転相カラムと202-208 nmを監視するように設定された吸光度検出器を備えたUPLC機器に注入します。サンプルは順次注入されますが、オートサンプラー機能を使用すると、最大 96 個のサンプルをバッチで処理できます。50 mM リン酸ナトリウム (pH 4.35) + 0.4% v/v 溶媒のアジドナトリウム、75 mM リン酸ナトリウム (pH 4.95) + 15% v/v メタノールを溶媒 B.流れを0.25 ml/minに設定し、25分以上の線形勾配を使用して、100%の溶媒Bと30分以内のムロペプチドの順次溶出を達成します。UPLC後のムロペプチドを特徴付けるために質量分析を使用する場合は、分画集電体で目的のピークの分画を収集し、遠心エバポレーターを使用して分画を乾燥させます。</li>
</ol>

<ol><li>den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+rod-shaped+sacculi%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of rod-shaped sacculi.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).</li>
<li>Holtje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+the+stress-bearing+and+shape-maintaining+murein+sacculus+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).</li>
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<li>Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPLC%3A+a+preeminent+technique+in+pharmaceutical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Poloniae+Pharmaceutica%22%5BJournal%5D)">UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis.</a> Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).</li>
<li>Wilson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+%26%2334%3Bultra+performance%26%2334%3B+liquid+chromatography+coupled+to+oa-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+differential+metabolic+pathway+profiling+in+functional+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">High resolution &#34;ultra performance&#34; liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies.</a> J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).</li>
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</ol>

この記事の生産コストはウォーターズコーポレーションが後援しました。

この手順の重要なステップは、サンプル調製の2日目のステップ3.1です。SDSが一晩沈殿した場合、またはサンプルが室温で数週間4%のSDSに保存されている場合、サンプルを再溶解させるために少なくとも1時間再沸騰させる必要があります。SDS沈殿の一般的な原因はカリウム塩を含む培地の使用であるため、可能であればカリウムは培地で避けるべきです。代表結果セクションで述べたように、ムロペプチドの等電点内(〜3.5)以内にpHを調整することも重要であるが、pH3より低すぎず、または物質が沈殿する可能性がある。最後に、試料の再懸濁は、研究者によって判断されなければならないリン酸ナトリウム緩衝液(ステップ3.5)の適切な容積で起こらなければならない。リン酸ナトリウムバッファーの再懸濁液量を選択する際には、特定の細菌培養物からどれくらいのムロペプチド物質が生成される可能性が高いかを考慮することが重要です。例えば、最終培養量が250mlの場合、上記で概説したように、サンプルは少なくとも200μlのリン酸ナトリウムバッファーに再懸濁されなければならない。研究者が50ml培養液に変更を加えた場合、サンプルは100μl以下のリン酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁され得る...

本明細書に記載されている方法の目的は、無傷の細菌細胞壁(sacculi)を分離し、超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)がムロペプチド成分の同一性とその濃度、グリカン鎖の平均長さ、および鎖間の架橋に関与する材料の割合などの情報を提供するために使用できるようにペプチドグリカン(PG)を消化することです。PG生化学およびムロペプチド種の詳細な議論のために、PG構造および感染、抵抗性、形態形成、および成長におけるその役割を1〜6に記述するいくつかの優れたレビューがある。PG分析のための高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は、1980年代にグラナーとシュワルツによって最初に開発され、最近ではミゲル・デ・ペドロとワルデマール・ヴォルマーの研究室で広く強化され、適用されています。これまでの方法では、アミノ酸分析またはペーパークロマトグラフィー、細胞壁成分の正確または完全な評価を得ない時間と退屈な技術を使用しました。
UPLC分析は、超遠心分離機やUPLCにアクセスできる基礎研究所で簡単に実装できます。以下に提示するUPLC法は、完全なサキュリを分離し、その中のすべての化学種に関する包括的かつ定量的な情報を提供する。この方法は、20分UPLCラン内のすべての細菌集団にわたってすべてのムロペプチドの正確な定量化をもたらす。この方法の実装は、材料に多額の財政的投資をすることなく、基本的な実験室のスキルのみを含みます。この方法のステップを実行するためには、研究者はピペット処理、バッファーおよび酵素の調製、およびpHの調整に熟練するだけで、幅広い科学的分野にアクセス可能になります。このプロトコルで使用される酵素の選択は、分析される細菌の種に依存します。ここで説明するプロトコルは 、大腸菌に有用であり、一般的に他のグラム陰性生物からサキュリを単離するのに適していることが分かってきた。グラム陽性菌にこの方法を適用する場合は、文献との相談をお勧めします。これらの種では、伝統的に糖分精製がより困難であった。特に、この方法は、グラム陽性菌のテイコ酸などの厚い壁および補助ポリマーに対応するために、酵素の選択および消化時間の長さの点で変更されなければならない。このプロトコルの最初の酵素は、外膜リポタンパク質(ブラウンのリポタンパク質、またはLppなど)をペプチドグリカンに切断し、それによって細胞壁からLppのC末端ジ(またはトリ)ペプチドを除くすべてを放出する。このステップは腸内細菌を調べるときに必要ですが、他の多くのグラム陰性菌にはLpp相当物がないため、このステップはスキップできます。第2酵素は、ペプチドグリカンのムラミン酸成分の後に特異的に切断し、ムロペプチド種を形成する二糖サブユニットを可溶化する。PGのアーキテクチャの正確な評価を提供するために、クロスブリッジまたはペプチドステムの他の部分の切断を防ぐために、サキュリを消化する際に注意する必要があります。
100種以上の菌種からペプチドグリカンの化学組成をHPLCで分析したが、UPLC技術では分析は行われていない。さらに、以前の研究では、細菌ドメインのごく一部からペプチドグリカンを特徴付けており、一部はHPLCのスループットによって制限されています。したがって、この方法をできるだけ多くの研究者に広め、UPLCプラットフォーム上での実施は、ペプチドグリカンがまだ分類されていない細菌種の大部分の生理学的研究を促進するために重要である。

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr> 水素<tr><td>化ホウ素ナトリウム (NaBH4)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>水素化ホウ素ナトリウムは反応性が高く、オルトリン酸の取り扱いには危険</td></tr>です<tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79607</td><td>オルトリン酸は腐食性があり、取り扱いが危険</td></tr>です <tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31146</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>アジ化ナトリウムは毒です</td></tr><tr><td>四ホウ酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>Millex 0.22 &mu;mシリンジフィルター</td><td>フィッシャー</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>pHストリップ(pH範囲0-6)</td><td>フィ</td><td>ッシャーM95863</td><td></td></tr><tr><td>50 mlポリプロピレンファルコンチューブ</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>13 mm x 100 mmガラスチューブキン</td><td>ブルチェイス</td><td>60CM13</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 32 mmスクリューネックガラス回収バイアル</td>ウォーター<td>ズ</td><td>186000327C</td><td></td></tr>ド<tr><td>デシル硫酸</td>ナトリウム<td>アンビオン</td><td>AM9820</td><td>SDS 粉末は危険な</td></tr><tr><td>装置</td><td></td><td></td><td></td></tr>です <tr><td>Waters Acquity UPLC H-Class システムには、次のものが含まれます:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC H-Class サンプルマネージャー FTN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC H-Class クオータナリーソルベントマネージャー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18 1.7 &m カラム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC PDA 検出器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters フラクションコレクター III</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC 30 cm カラムヒーター/クーラー</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

細菌細胞壁は、成長および分裂時の細胞形状の決定に重要であり、大きさの複数の雰囲気のターゴール圧力に直面して細胞の機械的完全性を維持する。細菌の王国の多様な形状と大きさにわたって、細胞壁は、短いペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成されています。細菌生理学におけるペプチドグリカンの中心的な重要性は、抗生物質標的としての使用の根底にあり、成長と分裂の間にどのように強固に組み立てられるかの遺伝的、構造的、細胞生物学的研究を動機づけている。それにもかかわらず、ペプチドグリカン合成における主要な酵素活性と細菌細胞壁の化学組成を完全に特徴付けるためには、依然として広範な調査が必要である。ハイパフォーマンス液体クロマトグラフィー(HPLC)は、様々な環境・遺伝的条件下で増殖する細菌の壁の化学組成の違いを定量化するための強力な分析方法ですが、そのスループットは、多くの場合、制限されています。ここでは、HPLC用6,000 psiと比較して、ポンプを利用して最大15,000 psiの超高圧を供給するHPLCの拡張であるHPLCおよび超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)を介したペプチドグリカンの生物学的分析のための細菌細胞壁の単離および調製のための簡単な手順を提示します。ここで紹介する細菌細胞壁の調製と組み合わせて、少量のサンプルインジェクター、高いサンプリングレート、より小さいサンプル量、およびUPLCの短い実行時間を備えた検出器は、超遠心分離機およびUPLCへのアクセスを持つほとんどの生物学的実験室でのペプチドグリカン組成物および基本的な細菌細胞生物学の新しい発見のための高解像度およびスループットを可能にする。

図1に示す手順を使用して、最終的なサンプルは、UPLCバイアルに直接フィルタリングされた少なくとも200 μlのクリアソリューションで構成されている必要があります(ステップ4.4)。細菌サンプル中の様々なムロペプチドのUPLC分離は、液体移動相とカラムの静止相との間の相対的な溶解性に依存する。逆相C18カラムは、疎水性およびサイズ8に基づいてムロペプチド種を分離する強力な疎水性マトリックスを提供する。極性、低分子量モノマーは最初に溶出し、そして非極性、より高い分子量オリゴマーは後にエルテする(図2)。典型的なUPLC結果は、特定のムロペプチドの保持時間を確立する時間の関数として202〜208nmのUV吸光度を介した検出を有する図2に示されている。この代表的な結果は、ほとんどのムロペプチド種とスペクトル全体の強い信号強度の間の明確な解像度を示し、これは、アナリシスを可能にし、平均グリカンストランド長さを示す。
図 1で概説した最...

細菌細胞壁はペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成される。超高性能液体クロマトグラフィーは、ペプチドグリカン組成物の新しい発見に高解像度とスループットを提供します。細胞壁(sacculi)の分離とUPLCによる分析のためのその後の準備のための手順を提示する。

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

この手順の全体的な目的は、細菌の細胞壁を単離および消化し、異なるニューロペプチドの正体と相対的な分率を決定することです。UPLC分析を用いることで、まず細菌サンプルを硫酸ナトリウムエコールで煮沸して溶解させます。SDSを洗浄した後、第2ステップとしてサンプルをプロナーゼEで消化し、グラム陰性菌の外膜を精製して除去します。次に、サンプルをmeaseで消化し、ペプチドグリカンを個々のニューロペプチドに可溶化します。最終ステップでは、ニューロペプチドを還元し、pHをニューロペプチドの等電点に調整します。最終的に、UPLCを用いてニューロペプチドをサイズと疎水性に基づいて分離し、架橋度や平均グリカン鎖長などの重要な細胞壁特性の定量化を可能にします。この手法は、形態形成、細胞壁構造、免疫系の活性化、および病原性の間の関係など、微生物学分野における重要な疑問に対する答えを明らかにするのに役立ちます。本手法はグラム陰性菌のペプチドグリカンを精製するために開発されましたが、いくつかの酵素の添加と化学処理を加えることで、グラム陽性菌にも適用可能です。細菌培養物を再増殖させるには、 overnight 培養物を新鮮な培地 250 milliliters に 1対100 の割合で希釈し、600 nanometers における目的の吸光度に達するまで培養します。希釈した培養物の増殖に合わせて、1 liter のビーカーに入れたホットプレート上の沸騰水浴を準備します。水が沸騰したら、6% sodium dyl sulfate（SDS）を6 mLずつ50 mLポリプロピレンチューブに分注します。各チューブに小型の撹拌子を1本ずつ加え、チューブの蓋をしっかりと手で締め付けます。チューブを沸騰させたウォーターバスに入れ、ホットプレート上で500 RPMで撹拌します。250 mLの培養液を、室温で5,000 ×gで10分間遠心分離して回収します。ペレットを3 mLの培地または1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で再懸濁します。細胞懸濁液を、6%沸騰SDSが入った50 mLチューブにゆっくりとピペッティングして細胞を溶解させます。この際、チューブを沸騰水浴に浸し、蓋を指で締まる程度にしっかりと閉めてください。沸騰水浴を蓋で覆い、細胞を3時間沸騰させます。その際、定期的に水位を確認し、必要に応じて水を補充してください。3時間後、ホットプレートの加熱を停止し、500 RPMで一晩撹拌し続けます。一晩経った後、50 milliliterチューブ内でSDSが析出している場合は、さらに1〜2時間沸騰水浴で加熱してください。ここに、一晩の溶解後の正常な培養液の外観を示します。SDS中では、沈殿に伴う不透明さとは対照的に、透明であることに注意してください。プロテアーゼKバッファーを調製し、ヒートブロックを用いて60 °Cで少なくとも30分間、プロテアーゼKを活性化させます。超遠心機を400,000 ×gに設定し、室温で20分間サンプルを遠心分離して、巨大なペプチドグリカン（PG）高分子を沈殿させ、他の細胞成分から精製します。上清を慎重に取り除き、各ペレットを室温の超純水で再懸濁します。再懸濁液の量は、使用する超遠心管の容量に応じて調整してください。チューブの少なくとも半分まで満たし、かつチューブの最大容量を超えない量を使用します。再懸濁時に気泡が発生しなくなるまで、遠心分離と洗浄を繰り返します。気泡が出なくなれば、この時点でSDSが完全に除去されたことを示します。サンプルを900 µLのTris-HCl緩衝液で再懸濁し、あらかじめ蓋に穴を開けておいた2 mLチューブに移します。細い針を用いて、各サンプルに活性化プロナーゼEを100 µL加え、60 °Cで2時間インキュベートします。各サンプルに6% SDSを200 µL加えてプロナーゼ消化を停止させ、100 °Cのヒートブロックで30分間煮沸します。前と同様に、400,000 ×gに設定した超遠心機を用いて室温で20分間遠心分離し、最後の遠心洗浄ステップでSDSが完全に除去されるまで室温の超純水で洗浄します。その後、サンプルを200 µLの50 mMリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁します。この容量はサンプル中のペプチドグリカン量に応じて調整でき、種によって異なる場合があります。サンプルにペプチドグリカンが多く含まれている場合は、懸濁液の容量を増やしてください。サンプル中のペプチドグリカンが少ない場合は、再懸濁液の量を最小で 50 µL まで減らします。サンプルを 1.5 mL チューブに移し、最終濃度が 40 µg/mL になるように 1 mg/mL の mease を加えます。37 °C のヒートブロックで 6〜8 時間または一晩インキュベートします。UPLC用のサンプルを調製するため、ヒートブロックを100 °Cに設定して電源を入れます。SDSを含まないサンプルを5分間加熱し、酵素消化を停止させます。その後、室温で16,000 ×gで10分間、サンプルを遠心分離します。ニューロペプチドは現在、上清中に存在しています。上清を13 by 100 millimeterのガラスチューブに移します。ペレットを乱さないよう注意しながら、可能な限り上清を回収してください。サンプルに500 millimolar ホウ酸緩衝液を添加し、最終濃度が100 millimolar ホウ酸緩衝液となるようにpHを調整します。ホウ酸緩衝液は、還元剤である水素化ホウ素ナトリウムと適合します。還元のため、各サンプルに水素化ホウ素ナトリウムを数粒加え、室温で少なくとも30分間反応させます。次に、20 microliter ずつ正リン酸を加え、pH指示紙で測定してサンプルのpHを6に調整します。正リン酸の添加に伴い、サンプルから気泡が発生します。通常、pHが6に達するとサンプルの気泡が出なくなります。その後、正リン酸を用いて2 µLずつ加え、サンプルのpHを3から4の間になるまで調整し続けます。サンプルを0.22 micronのシリンジフィルターでろ過します。UPLCバイアルに直接ろ過します。UPLCバイアルに移した後にサンプル中で沈殿が再形成した場合は、バイアルを炎に通して数回加熱してください。UPLCバイアルをオートサンプラーにセットし、各サンプルを10 µLずつUPLC装置に注入します。C 18逆相UPLCカラムを装着し、吸光度検出器を202〜208 nmに設定して監視します。サンプルを順次注入します。流量を0.25 mL/minに設定し、25分間で溶媒Bを100%にする線形グラジエントを用い、30分以内にニューロペプチドを順次溶出させます。UPLC後に質量分析を用いてニューロペプチドの特性解析を行う場合は、フラクションコレクターで目的のピークの画分を回収し、それらを1.5 milliliterチューブに移した後、遠心濃縮機を用いて乾燥させます。MS分析の前に、画分を脱塩する必要があります。この典型的なUPLCの結果では、202 to 208 nanometersでのUV吸光度による時間関数的な検出により、特定のニューロペプチドの保持時間が決定されます。ほとんどのニューロペプチド種の間で明確な分離と、全スペクトルにわたる強い信号強度が観察され、これによりクロスリンクの程度、平均糖鎖長、およびニューロペプチドの同定とその濃度を分析することが可能になります。ここでは、ニューロペプチドのC沈殿を反映したクロマトグラムの例を示します。ピークが認められなかったため、PG組成に関するデータは得られませんでした。UPLC分析で識別可能なピークが現れない場合、サンプルの過剰濃縮、あるいはpHをニューロペプチドの等電点より大幅に低く調整しすぎたことが原因である可能性があります。本手順に従って適切に実施すれば、非常に多忙ではありますが、この手法を3日間で完結させることができます。また、本手法の確立後には、質量分析などの他の手法を用いて、質量に基づいたニューロペプチド種の確定的な同定が可能です。この手法により、微生物学分野の研究者が、多種多様な種や変異株における主要な細胞壁酵素の生化学的機能や、化学的阻害剤の作用機序を探索するための道が開かれました。

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化学

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