超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

この手順の全体的な目標は、細菌の細胞壁を分離して消化し、さまざまな神経ペプチドの同一性と相対的な画分を決定することです。UPLC分析を使用して、これは最初にエコル硫酸ナトリウムで沸騰させて細菌サンプルを溶解することによって達成されます。SDSを洗い流した後、2番目のステップは、プロナーゼEでサンプルを消化し、グラム陰性菌の外膜を精製することです。

次に、サンプルをミーズで消化し、ペプチドグリカンを個々の神経ペプチドに可溶化します。最後のステップは、神経ペプチドを減らし、pHを神経ペプチド等電点に調整することです。最終的に、UPLCはサイズと疎水性に応じて神経ペプチドを分離するために使用され、架橋の程度や平均糖鎖長などの重要な細胞壁特性の定量化が容易になります。

この方法は、形態形成、細胞壁構造、免疫系の活性化、病因の関係など、微生物学の分野における重要な問題に対する答えを明らかにするのに役立ちます。この方法はグラム陰性ペプチジルグリカンを精製するために開発されましたが、いくつかの酵素と化学処理を添加してグラム陽性菌にも適用できます。細菌培養物を成長させるためには、一晩で1〜100の新鮮な培地を250ミリリットルに希釈し、希釈した培養物が成長している間、600ナノメートルで所望の光学密度に成長します。1リットルのビーカーのホットプレートに沸騰したお湯浴をセットします。

水が沸騰したら、6ミリリットルの6%ジル硫酸ナトリウムまたはSDSを50ミリリットルのポリプロピレンチューブに分注します。各チューブに小さな攪拌棒を1本追加し、チューブの蓋を指でしっかりと締めます。チューブを沸騰水浴に入れ、ホットプレート上で500RPMで攪拌します。

室温で10分間、Gの5, 000倍で回転させることにより、250ミリリットルの培養物を収穫します。ペレットを3ミリリットルの培地または1 x リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁します。細胞懸濁液を6%沸騰SDSを含む50ミリリットルチューブにゆっくりとピペットで移し、チューブを沸騰水浴に浸し、蓋を再び閉じて指でしっかりと

沸騰した水浴に蓋をして細胞を3時間沸騰させ、定期的に水位をチェックし、必要に応じて水浴を補充します。3時間後、ホットプレートの火を止め、500RPMで一晩攪拌を続けます。SDSが50ミリリットルのチューブに一晩沈殿した場合は、ウォーターバスをさらに1〜2時間沸騰するように設定します。

ここに示されているのは、一晩寝かせた後の正常な培養物の様子です。SDS では、降水量と相関する不透明性とは対照的に、透明度に注意してください。傾向のあるEバッファーを準備し、ヒートブロック内で摂氏60度で傾向のあるEを少なくとも30分間活性化します。

Gの400,000倍に設定された超遠心分離機を使用して、室温で20分間サンプルを遠心し、大きなペプトールグリカンまたはPG高分子をペレット化し、それによって他の細胞成分からそれらを精製します。上清を慎重に取り除き、各ペレットを室温で再懸濁します。超純水蘇生懸濁液容量は、使用する超遠心チューブの容量に依存します。

チューブの少なくとも半分まで満たされるが、チューブの最大体積を超えないボリュームを使用します。Resus懸濁液中に水が泡を形成しなくなるまで遠心分離と洗浄を繰り返し、この時点でSDSが完全に除去されたことを示します。Resusは、サンプルを900マイクロリットルのトリスHCLバッファーに懸濁し、上部に穴が開いた2ミリリットルのチューブに移します。

小さな針を使用して、100マイクロリットルの活性化プロナーゼEを各サンプルに加えてから、摂氏60度で2時間インキュベートします。各サンプルに200マイクロリットルの6%SDSを追加し、摂氏100度のヒートブロックでサンプルを30分間煮沸することにより、消化不良を止めます。前と同様に、400、000倍Gに設定された超遠心分離機を使用して、サンプルを室温で20分間回転させ、最後の遠心分離洗浄ステップでSDSが完全に除去されるまで室温の超純水で洗浄し、サンプルを200マイクロリットルの50ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液に懸濁します。

この容量は、サンプル中のペプト糖鎖の量に応じて調整でき、種によって異なる場合があります。サンプルに含まれるPEPグリカンが多い場合は、懸濁液の量を増やします。サンプルにペプチドグリカンがほとんど含まれていない場合。

蘇生懸濁液の容量を最小50マイクロリットルに減らします。サンプルを1.5ミリリットルのチューブに移し、ミリリットルミーズあたり1ミリグラムを追加して、1ミリリットルあたり40マイクログラムの最終濃度を得ます。摂氏37度のヒートブロックで6〜8時間または一晩インキュベートします。

UPLC用のサンプルを調製するには、ヒートブロックを摂氏100度にオンにします。SDSなしでサンプルを5分間煮沸して、16, 000回で10分間サンプルを停止します。Gを室温で。

神経ペプチドは現在、上清中にあります。上清を13 x 100 mmのガラス管に移します。できるだけ多くの上清を回収し、口蓋を邪魔することなく非常に近づく

500ミリモルのホウ酸緩衝液をサンプルに添加してpHを調整し、最終濃度が100ミリモルのホウ酸緩衝液ボア8の緩衝液は還元剤に適合します。水素化ホウ素ナトリウムを数粒加えて各サンプルを減らし、室温で少なくとも30分間反応を進めます。次に、オルトリン酸を含むpH指示紙で測定したようにサンプルをpH 6に調整し、20マイクロリットル刻みで、オルトリン酸の添加に応じてサンプルが泡立つはずです。

通常、サンプルはpHが6に達するとバブリングを停止します。次に、オルトリン酸を使用して、サンプルをpH 3から4に調整し続けます。0.22ミクロンのシリンジでサンプルをろ過します。

A-U-P-L-Cバイアルに直接ろ過します。UPLCバイアルに移されたサンプルで沈殿物が再形成された場合は、炎を数回通過させてバイアルを加熱します。UPLCバイアルをオートサンプラーにセットし、各サンプルの10マイクロリットルをA-U-P-L-C装置に注入します。

C 18逆相UPLCカラムとモニター用吸光度検出器を装備し、202〜208ナノメートルのサンプルを順次注入します。流量を0.25ミリリットル/分に設定し、25分間にわたって線形グラジエントを使用して、30分以内に神経ペプチドの100%溶媒BとシーケンシャルEを達成します。

質量分析を使用してUPLC後の神経ペプチドの特性評価を行う場合は、目的のピークのフラクションをフラクションコレクターに収集し、フラクションを1.5ミリリットルチューブに移し、遠心エバポレーターを使用してフラクションを乾燥させます。MS分析の前にフラクションを脱塩する必要があります。この典型的なUPLCの結果では。時間の関数として202〜208ナノメートルのUV吸光度による検出により、特定の神経ペプチドの保持時間が確立されます。

ほとんどの神経ペプチド分子種間で明確な分解能とスペクトル全体での強いシグナル強度が観察されるため、架橋の平均糖鎖長の程度、神経ペプチドの同一性、およびそれらの濃度の解析が可能になります。神経ペプチドのC沈殿を反映したクロマトグラムの例をここに示します。ピークは言及されていないため、PG組成に関するデータは存在しません。

UPLC分析で識別可能なピークが見つからないのは、サンプルを過度に濃縮した結果、またはpHを神経ペプチドの等電点より十分に低く調整した結果として発生する可能性があります。一度習得すると、このテクニックは3日で行うことができますが、多忙なものではありますが、この手順に従って適切に実行されました。質量分析などの他の方法を使用して、質量に基づいて神経ペプチド種を確実に同定できます その開発後。

この技術は、微生物学の分野の研究者が、主要な細胞壁酵素の生化学的機能と、さまざまな種や変異体における化学阻害剤の作用機序を探求する道を開きました。