多電極アレイ（MEA）を用いたヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（hPSC-CM）の電気生理学的解析

この手順の全体的な目標は、ヒト多能性幹細胞に由来する心筋細胞を解離し、それらを多電極アレイ上に播種して、電界電位とも呼ばれる典型的な電気信号の持続時間と周波数を測定および定量化することです。この方法は、突然変異を持つ心筋細胞とコントロールの電気生理学的違いは何かなど、この分野での重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、患者細胞に由来するヒト心筋細胞の薬物スクリーニングを可能にすることです。

この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。解離とメッキのステップは、電気信号の記録を成功させるために不可欠です。一般に、この方法に不慣れな人は、電気信号の品質が良いか悪いかを特定するのは簡単ではなく、自由電位の分析には経験が必要なため、苦労するでしょう。

この手順を開始するには、クリーンチップを標準的な直径10センチメートルのプラスチック製滅菌ペトリ皿に入れます。次に、8ミリリットルの滅菌蒸留水をペトリ皿に加えて加湿チャンバーを形成し、インキュベーターに入れたときにチップ上の少量の培地が引き出されるのを防ぎます。次に、カスタムメイドのPolyTetraFluoroEthyleneリングを使用して、電極アレイが配置されているチップの中央に心筋細胞が確実にプレーティングされるようにします。

培養フードで、エタノールからリングを取り外します。蓋のない滅菌ペトリ皿に入れ、リングをフード内で乾かします。次に、火炎滅菌ピンセットを使用してMEAチップ内にドライリングを置きます。

リング内に40マイクログラム/ミリリットルのフィブロネクチンを50マイクロリットル追加して電極をコーティングします。その後、ペトリ皿を蓋で覆い、MEAチップが入った皿をインキュベーターに慎重に移します。その後、MEAチップが入ったディッシュを細胞培養フードに移します。

MEAチップを使用する前に、P200ピペットまたはフード内の真空システムを使用して、PTFEリングをずらさずに50マイクロリットルのフィブロネクチンを吸引します。先端を傾けて、固形物が電極に触れないようにします。次に、950マイクロリットルのLI-BPEL培地を静かに追加し、均等に分散され、リングが浮かないようにします。

その後、皿をインキュベーターに戻します。これが、鼓動する心筋細胞の初期培養です。組織培養フードで、hPSC-CMs培養ウェルから培地を吸引します。

カルシウムとマグネシウムを含まないPBSを1〜2ミリリットル各ウェルに加えて、培養物を洗浄し、PBSを吸引します。その後、500マイクロリットルの解離酵素を各ウェルに加えます。サンプルを摂氏37度で5分間インキュベートします。

5分後、各ウェルに1ミリリットルのLI-BPELを加えて酵素を希釈します。hPSC-CMの単層をP1000ピペットで優しく引っ掻いて剥がします。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに集めます。

次に、1ミリリットルのLI-BPELでウェルをすすぎ、残りのすべての細胞と細胞塊を収集します。さらに2〜3ミリリットルのLI-BPELを加えて最終容量を約5〜6ミリメートルにし、5ミリリットルのピペットで3〜5回ピペットでゆっくりと上下させて細胞塊を解離します。その後、細胞を室温で300回gで3分間遠心分離します。

その後、細胞ペレットを脱落させずに上清を取り除きます。次に、細胞ペレットを250マイクロリットルのLI-BPELに再懸濁します。その後、電極アレイ上部のPTFEリングの中央に直接細胞懸濁液をピペッティングすることにより、MEAごとに50マイクロリットルの細胞懸濁液を分配します。

MEAを摂氏37度のインキュベーターに慎重に移し、細胞が一晩付着するのを待ちます。めっきの1日後、滅菌環境で滅菌ピンセットを使用してリングを慎重に取り外します。リングを80%エタノールですすいでください。

そして、80パーセントの新鮮なエタノールが入った50ミリリットルのチューブに保管してください。次に、MEAチップから500マイクロリットルの媒体を静かに取り出します。そして、それに500マイクロリットルの新鮮なLI-BPELを追加します。

これらは、リング除去後の鼓動心筋細胞です。その後、MEAを摂氏37度のインキュベーターに移します。次に、リング除去の1日後から最大1週間まで、MEA上のhPSC-CMの電気的活動を測定します。

次に、MEAセットアップにリンクされたソフトウェアスイートを起動します。次に、TCX-Controlで温度を摂氏37度に設定して、測定値を記録します。その後、MEAチップが入った皿をインキュベーターから取り出します。

皿からMEAチップを取り出し、ティッシュの上に置いて残留水分を吸収します。プレートの外部コンテキストをティッシュで慎重に拭き、100%エタノールで湿らせた綿棒を使用してプレートを清掃し、信号ノイズの原因となる可能性のある残留水や破片を取り除きます。次に、MEAプレートを摂氏37度の記録ヘッドステージに移して、自発的な活動を検出します。

MC Rackを開き、[edit]をクリックしてMEAハードウェアをロードします。新しいプロトコルを作成するには、ドロップダウンメニューの編集を使用して、プロトコルに異なるレコーダーと表示ウィンドウを追加します。その後、再生ボタンをクリックして、プロトコルを再生モードで開始します。

信号が目に見えるRピークとTピークを明確に示す場合は、適応フェーズが終了するまで10〜15分待ちます。実験を開始するには、[記録]をクリックし、ベースライン条件下で10分間データを再生して集録し、定常状態を決定します。最適な信号を持つ電極に注釈を付けると、電極を簡単に識別して、後で分析のためにエクスポートできます。

薬物反応評価のために、10分ごとに薬物の濃度を増やして追加します。「Stop」をクリックすると、プロトコルの最後に録音が終了します。以下は、MEAで記録された代表的なトレースで、RQピークとTピークがはっきりと見え、高いS/N比で良好な品質のトレースを示しています。

RQとTのピークがはっきりと見えない品質の悪いトレース また、RQとTのピークがはっきりと見えるが、信号対雑音比が低いノイズの多いトレース。そして、hPSC-CMを使用したMEA実験中に記録できる、さまざまな形態の良質な電界電位トレースの代表的な例を以下に示します。影付きの領域は、分析中に測定されたQT間隔を表しています。

MEAの電界電位は活動電位の1次導関数に似ているため、電界電位トレースの積分は、完全な活動電位の再分極に近いT波の理論的実証として計算されています。この手順を試行する際は、信頼性が高く一貫した信号を確保するために、電極の数を最も多くすることを忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、クォント脛骨時間PCRやシングルセルパッチクランプなどの他の方法を使用して、電気的表現型に関連する特定の遺伝子発現や特定のイオン電流密度などの追加の質問に答えることができます。

この技術の開発後、幹細胞の分野の研究者が、ヒト多能性幹細胞に由来する心筋細胞を用いた心不整脈や体外薬理学を探求する道を開きました。このビデオを見れば、電気生理学的測定や薬物スクリーニングのために、ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞をMEA上で解離し、プレートする方法を十分に理解できるはずです。薬物の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常に標準的なGLPなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。