潜在的細胞質置換療法のための骨髄間葉系幹細胞からの血漿膜小胞の調製

この手順の全体的な目標は、原形質膜小胞、またはマウス骨髄間葉系幹細胞または BMSC に由来する PMV を使用して、マウスの腓腹筋に新しい細胞質補充療法を提供することです。この方法は、PMV融合を介して他のBMSCからの若い細胞質を細胞に補給することで質問に答えるのに役立ちます。これにより、年齢に関連する表現型を改善または逆転させることができます。この技術の主な利点は、BMSCサイトゾルのPMVカプセル化と、機械的な押し出しによって即座に誘導できることです。

この方法を実証しているときは、実際に所有するためにテストして学ぶのが難しいステップを押し出し、構築しているため、非常に重要です。PMVを生成するには、まず、摂氏37度、二酸化炭素5%の加湿インキュベーター内の6ウェルプレートの1ウェルで、マウスBMSCを完全なDMEM培養培地で培養します。細胞が90%の密度に達したら、0.5ミリリットルのカルシウム遊離PBSでウェルをすすぎ、0.5ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAで細胞を剥離します。

摂氏37度で3分間後、手のひらでプレートを数回叩くと、細胞の解離が促進され、1ミリリットルの培地で消化が止まります。細胞を5ミリリットルの円錐管に移して遠心分離し、ペレットを4ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁します。次に、新しい6ウェルプレートの2つのウェル間で細胞を分割し、プレートを細胞培養インキュベーターに24時間戻します。

翌日、先ほど示したようにトリプシン消化により、1つのウェルから細胞を採取します。遠心分離による回収後、ペレットを0.5ミリリットルの新鮮培地に再懸濁します。細胞を1ミリリットルのインスリン注射器にロードし、注射器をフィルターユニットに取り付けます。

プランジャーをすばやく押し下げてセルをフィルターに押し込み、押し出した培地を廃棄します。次に、先ほど示したように、0.5ミリリットルの余分な培地をフィルターに通して分注し、2回目の押出成形から培地を収集します。収集した培地150マイクロリットルを35ミリリットルのガラス底皿に播種し、小胞を約10分間沈殿させます。

次に、CCDカメラを搭載した倒立位相差顕微鏡で、対物レンズ20倍を用いてPMVの存在を確認します。PMVのミトコンドリア囲いと膜電位を追跡するには、90%コンフルエントなBMSC培養物を適切なミトコンドリア色素またはミトコンドリア膜電位プローブでそれぞれ新鮮な培地で37°Cで30分間染色します。次に、洗浄ごとに0.5ミリリットルのPBSで細胞を3回すすぎ、共焦点顕微鏡による視覚化で示したように、PMV生成のためのトリプシン消化によって細胞を回収します。

PMVタンパク質の細胞質局在を追跡するには、まず、EGFP発現カセット用の2マイクログラムのスーパーコイルプラスミドDNAと6マイクロリットルのカチオン性トランスフェクション試薬を、50マイクロリットルの無血清DMEMを含む個々の0.5ミリリットルチューブで希釈します。チューブをボルテックスし、続いて短時間の遠心分離を行います。次に、トランスフェクション試薬を希釈したDNA溶液の入ったチューブに滴下します。

DNAトランスフェクション混合物を1分間強力にボルテックスし、その後、室温で10分間のインキュベーションで短時間スピンします。次に、30%コンフルエントなBMSC培養物を2ミリリットルの新鮮な培地を含む6ウェルプレートに供給し、DNA混合物を細胞に滴下します。トランスフェクションの48時間後、トリプシン消化によってBMSCを回収し、示したようにPMVを調製します。

その後、PMVは、100倍のオイル対物レンズを使用した共焦点顕微鏡で分析できます。PMVを注入する前に、BMSC培養物を1ミリリットルの新鮮培地で摂氏37度で30分間染色する膜で蛍光細胞トラッカー色素を標識し、トリプシン消化によって細胞を回収します。標識した細胞を、1マイクログラムのポリエチレンアミンを添加した0.5ミリリットルの新鮮培地に再懸濁し、実証されているようにPMVを調製します。

次に、遠心分離によってPMVを濃縮し、ペレットを100マイクロリットルの新鮮な培地に再懸濁し、穏やかに渦巻きます。次に、30ゲージの針を備えた1ミリリットルのインスリン注射器に細胞をロードし、麻酔したBALB/cマウスの腓腹筋の外側を75%エタノールで消毒します。次に、PMVの全量を筋肉にゆっくりと注入し、動物がヒートランプの下で回復するのを待ちます。

12時間後、筋肉全体に75%エタノールを振りかけ、はさみで皮膚を開き、両端の腓腹筋全体を採取します。筋肉をPBSですすぎ、蛍光顕微鏡の下に置きます。20倍の対物レンズを使用して、鋭利なカミソリの刃で非蛍光性の筋肉組織片を取り除き、残りの強い赤色の蛍光片を約9立方ミリメートルの立方体に細かく刻みます。

各キューブを最適な切断温度の媒体に埋め込みます。次に、キューブを液体窒素に5分間沈めます。そして、組織サンプルは分析まで摂氏マイナス20度で保管します。

BMSCから生成されたPMVは、主に直径約3マイクロメートルの範囲のサイズを示し、20倍対物レンズを使用した位相差顕微鏡で調べられます。蛍光発現カセットを用いたBMSCトランスフェクションを48時間行ったところ、PMVによるEGFPタンパク質の細胞質カプセル化が示されています。さらに、蛍光ミトコンドリア色素で立っていると、PMVの大部分がミトコンドリアを含んでいることが明らかになります。

その大部分は、ミトコンドリアの機能性を示すミトコンドリア膜電位色素に対して陽性染色します。ポリエチレンアミンを生体内投与前に処理することで、細胞成分除去のための遠心濃縮中にPMVの凝集を防ぎます。PMV生成前にBMSCをメンブレン色素で標識すると、蛍光追跡可能なPMVの生成が容易になります。

実際、標識されたPMVの筋肉内送達後の腓腹筋の凍結切片の視覚化は、おそらくエンドサイトーシスを介して筋肉細胞質へのPMV送達を示しています。PMV生成手順を試みるときは、フィルターを介して細胞を洗い流すときにプランジャーをすばやく押し下げるために、シリンジに適切な数の細胞をロードすることを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、幹細胞治療の分野の研究者がマウスの加齢性疾患の治療を探求する道を開きました。

このビデオを見た後、マウスの腓腹筋に細胞質を送達するためにBMSCからPMVを準備する方法についてよく理解しているはずです。