Name: 成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶ骨髄間質細胞の低酸素プレコンディショニングによる神経前駆細胞の増殖とシュワン細胞への分化誘導法。この技術は再生医療における自己細胞治療の応用可能性を示しています。

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著者らは、低酸素室装置を提供してくれたNai-Sum Wong博士と技術サポートのためのAlice Luiさんに感謝したいと思います。

動物を含むすべての処置は、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイドに厳密に準拠して実施され、香港大学の医学のLi Ka Shing教授のための生きた動物の使用に関する委員会によって承認された。インフォームドコンセントを得た後、健康なドナーの腸骨稜からヒト骨髄サンプルを得た。議定書は、香港大学の制度審査委員会の承認を受けています。 1.ラットMSC培養液の調製<ol><li> 大腿骨からのMSCの収穫 <ol><li>使用前に少なくとも2時間、180°Cですべての切開ツール（ すなわち、はさみ、鋭い切開はさみ、および歯を切った鉗子）をオートクレーブする。 </li><li> 15％ウシ胎仔血清（FBS）およびペニシリン/ストレプトマイシン（P / S、1％v / v）を補充した最小限の必須培地α修飾（αMEM）を含むMSC増殖培地を調製する。）。 </li><li>ペントバルビタールの過剰投与（240mg / kg体重、腹腔内）により、若い雄Sprague Dawleyラット（体重200〜250g）を犠牲にする。 注：異なるラットの骨髄サンプルは別々に処理する必要があります。 </li><li>犠牲動物を仰臥位に置く。腹部と下肢を70％エタノールで完全にきれいにする。 </li><li>細かい切開はさみと鉗子を使用して、内側の太ももの上の皮膚と皮下組織を削除します。大腿筋が露出するまで、大腿筋を円周方向に外します。膝と股関節が見えるまで、この近位および遠位に継続する。大腿骨を股関節と膝関節に通し、鋭利な先端を切って切り取ってください。 注：この段階で大腿骨を切開して骨髄腔を露出させないでください。インタクトな大腿骨を層流組織培養フードに移し、さらなる処理を行う。 </li><li>骨幹端部を通って大腿骨の遠位端および近位端を横断するために、尖った切断されたはさみを使用する。 </li><li> 70μmセルストレーナーを50mLコニカルチューブの上に置きます。露出した大腿管にリン酸緩衝生理食塩水（PBS、10mM Na 2 HPO 4 、pH7.4）を含む21G、10mLシリンジを挿入し、洗浄を繰り返すことによって円錐管に骨髄内容物を洗い流す。 注：各大腿骨を洗い流すために約20mLのPBSを使用する。洗い流された内容物の色が血液で汚染されて濁っている場合、より大きな容積を使用することができる。 </li><li> 480 xgで5分間遠心分離して細胞を集める。上清を捨てる。細胞ペレットを10mLのMSC増殖培地に再懸濁する。 10cmの組織培養皿に細胞をプレートする。組織培養皿を細胞インキュベーター（37℃、5％CO 2 ）に入れる。メッキの最初の日を0日目として記録する。 注：遠心を含むすべてのステップで、ブレーキを最大減速に設定します。 </li></ol></li><li> MSCコロニーの設立と拡大 注：このプロトコルr骨髄腔内からMSCを選択するための手段として、組織培養プラスチック粘着性を欠く。骨髄の内容物を組織培養プラスチックに2日間付着させる。 <ol><li> 2日目に、10mLのPBSで培養プレートを3回すすぎ、非接着細胞を除去する。すすいだ後、PBSを10 mLのMSC増殖培地に交換する。細胞をPBSで洗浄し、3日ごとにMSC増殖培地を補充する。 注：MSCコロニーは、6-7日目に見えるはずです（ 図2A ）。 </li><li>増殖培地を除去し、細胞をPBSですすぐことにより、10日目までに細胞を通過させる。組換え酵素細胞解離試薬1.5mLを添加し、37℃で5分間インキュベートする。反応を中和するために3mLのMSC増殖培地を添加する。 250×gで5分間遠心分離して分離した細胞を集める。 </li><li> PBSで適切に希釈した後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。 </li><li> 40,000細胞/ cm 2の密度で継代した細胞をMSC増殖培地中の10cm培養プレートに継代した。 注：ラットのMSCは継代の2日以内に80〜90％の合流に達するはずである（ 図2B ）。細胞は、最大8継代について、工程1.2.2に記載されているように継代することができる。 MSCは、免疫細胞化学および三分化分化能力を特徴とすることができる（ 図3 ） 12 。第3および第8継代の間のMSC培養物のみが、その後の低酸素プレコンディショニングおよび神経前駆細胞濃縮の対象となる。より大きい継代数のMSCは、平らな形態をとっており（ 図2C ）、十分な数の神経前駆細胞を産生しない。これらの培養物は捨てるべきです。 </li></ol></li></ol>ヒトBMSC培養物の調製<ol><li> 1mLのヒト骨髄を9mLのMSC増殖培地で希釈し、細胞を10cmの組織培養皿上に置いた。細胞培養器（37℃、5％CO 2 ）で培養物を維持する。 </li><li> 2日後に培地を除去し、10mLのPBSで培養液を3回穏やかにすすいで非接着細胞を除去する。最後のすすぎ後、PBSを除去し、10mLのMSC増殖培地と交換する。 PBSすすぎ後の培養3日ごとに増殖培地を補充する。 注：MSCコロニーは、6-7日目まで可視でなければなりません。コロニーの数は被験者によって異なる場合があります。 </li><li>ステップ1.2.2に記載されているように、10日目に細胞を通過させる。 PBSで適切に希釈した後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。継代した細胞をMSC増殖培地中の10cm培養プレート上に40,000細胞/ cm 2の密度で播種する。 注：ヒトMSC（ 図2D ）は、ラットMSCと同様の形態を示し、同様に、継代の2日以内に80〜90％の合流に達するはずである。彼らは奇妙でなければならない免疫細胞化学および三重化分化のためのそれらの能力によって凍結される12 。ラットのMSCと同様に、第3および第8継代間のヒトMSCは、その後の低酸素プレコンディショニングおよび神経前駆細胞濃縮に供される。 </li></ol> 3.低酸素プレコンディショニング<ol><li>リングクランプを外した後、低酸素チャンバーの部品（ベース、フタ、トレイ）を分解し、70％エタノールで個々の部品をきれいに拭きます。チャンバ構成要素を、層流組織培養フード内に置き、UV光下で15分間滅菌する。 </li><li>低酸素プレコンディショニングの前に、培地を除去し、10mLのPBSでラットおよびヒトMSC培養物（セクション1および2）をリンスする。 PBSを、25mMのHEPESを補充した10mLのMSC増殖培地で置換する。 注：10cm皿上で培養されたMSCは、低酸素プレコンディショニングの対象となる前に80〜90％のコンフルエントに達しているはずです。 </li><li>カウルを置く低酸素室の中で皿を作る。チャンバーのコンポーネントを再構成し、リングクランプを締めます。 99％N 2 /1％O 2のガス混合物を10L /分の流速で5分間チャンバ内に流す。 </li><li>低酸素室の接続端をシールして、ガス漏れがないことを確認します。チャンバーを細胞インキュベーター（37℃、5％CO 2 ）の中に16時間置く。 </li><li>低酸素プレコンディショニングが完了したら、その後の神経前駆細胞濃縮培養に備えて培養液をチャンバーから取り出す。 </li></ol> 4.神経前駆細胞濃縮培養<ol><li> B27（2％v / v）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、20 ng / mL）、上皮成長因子（EGF、BGF）を補充したダルベッコ変法イーグル培地/ハム栄養混合物F12（DMEM / F12） 20 ng / mL）、およびP / S（1％v / v）であった。 </li><li>ステップ1.2.2に記載されているように、低酸素プレコンディショニングラット/ヒトMSCを分離する。250×gで5分間遠心分離して分離した細胞を集める。 PBSで適切に希釈した後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。 </li><li> 6,000細胞/ cm 2の密度で、神経前駆細胞および細胞を低付着性の6ウェルプレートに再懸濁する。培養物を細胞インキュベーター（37℃、5％CO 2 ）に12日間置く。 3日ごとに神経前駆細胞の75％を補充する。 注：サイズの大きい非接着性細胞クラスターは、6-7日目まで観察されるべきである。 10〜12日目までに、直径が100μm以上のニューロスフェアを観察することができます（ 図4 ）。低酸素プレコンディショニングMSCは正常酸素条件下で培養されたMSCと比較してより多くのニューロスフェアを生じるはずである9 。 </li><li> 10日目のピペットに吸引し、15 mLコニカルチューブに移すことにより、12日目に神経球を収集する。神経球を250xgで5分間遠心分離する。 注：ニューロスフェアは、ネスチンおよびGFAPなどの神経前駆マーカーについて12日目に特徴付けられた。 </li></ol> 5. DRGニューロンと共培養による運命決定シュワン細胞の作製<ol><li> 精製ラットDRGニューロンの調製 <ol><li>使用前に少なくとも2時間、180°Cですべての解剖器具（ すなわち、解剖はさみ、鉗子、2つの顕微解剖鉗子、およびマイクロダイシングハサミ）をオートクレーブする。 </li><li>ポリ-D-リシン（PDL、PBS中10μg/ mL）を含む6ウェル組織培養プレートを4℃で一晩コートする。 PDLを除去し、1ウェルあたり1.5mLのPBSですすぐ。 </li><li>プレートをラミニン（PBS中10μg/ mL）で37℃で2時間コーティングすることにより続行する。 1ウェルあたり1.5mLのPBSでプレートをすすぐ。 </li><li> B27（2％v / v）、L-グルタミン（1％v / v）、神経成長因子（NGF、20ng / mL）およびP / S（1％v / v）を補充した神経基底培地からなるDRGニューロン維持培地を調製する。 ％v / v）。 </li><li>B27（2％v / v）、L-グルタミン（1％）、NGF（20ng / mL）、P / S（1％）、フルオロデオキシウリジン（FDU、10）を補充した神経基底培地からなるDRGニューロン精製培地を調製する。 μg/ mL）、およびウリジン（10μg/ mL）である。 </li><li>妊娠中のラットを第14-15妊娠期にペントバルビタール過剰投与（240mg / kg体重、腹腔内）で屠殺する。 </li><li>犠牲動物を仰臥位に置く。 70％エタノールで腹部を完全にきれいにする。 </li><li>細かい切開はさみと鉗子を使用して、動物の下腹壁を縦に切る。解剖はさみを使用して子宮を特定し、除去する。子宮の壁を切断して胚を露出させ、抽出する。 PBSで満たされた滅菌10cm培養皿に胚を移す。培養皿を氷上に置きます。 </li><li>解剖用の胚をPBS（室温）で満たした滅菌10 cm培養皿に移し、解剖顕微鏡の下に置く。胚を伏せやすい位置に置いてください。 NOTE：白っぽい脊髄および付着したDRGは、その半透明な皮膚を介して、胚の背側に見える。 </li><li>脊髄のいずれかの側に沿ってmicrodissecting鉗子を挿入し、周囲の軟部組織から脊髄を分離し始めるために鈍的な解剖を使用してください。頚部の開口部と尻尾のスタブに沿ってマイクロ鉗子を使用して動物から脊髄を切断します。周囲の柔らかい組織からそれを解放するためにコードの腹側の面にさらに鈍的な解剖を行います。 </li><li>解放された脊髄の背側の面に残っている柔らかい組織を除去するためにマイクロダイシング鉗子を使用してください。 注：この段階では、脊髄、神経根、および付着したDRGのみが残るはずです。 </li><li> microdissecting鉗子を使用して、それらの接続神経根から個々のDRGを切り離します。 PBSを含む1.5mLの滅菌遠心分離管にDRGを移すために、1mL先端に取り付けられたピペットペンを使用する。 注：各1.5 mLチューブについて、最大100のDRGを収容できます。 </li><li> 5分間250xgでDRGを遠心分離し、組換え酵素細胞解離試薬（200μL/チューブ）にそれらを再懸濁する。 10分間インキュベートする（37℃、5％CO 2 ）。 250×gで5分間DRGを遠心分離し、上清を除去し、DRGニューロン維持培地に再懸濁する。 200μLピペットチップを用いて穏やかに粉砕することによりペレットを解離させる。適切な希釈後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。 </li><li> 1ウェル当たり1.5mLのDRGニューロン維持培地中のPDL /ラミニンでコーティングした6ウェルプレートに5,000細胞/ cm 2の密度で細胞を播種する。培養2日後、DRGニューロン維持培地を除去し、PBSですすぎ、DRGニューロン精製培地で置き換える。 注：精製サイクルごとに、DRG培養物を精製培地で2日間処理し、続いてメンテナンス培地で1日間インキュベートする。 3-4回の精製サイクルの後、remすべての内因性グリアの楕円形が予想される7 。これには約14日かかります。精製された培養物は、ニューロンマーカーTUJ1に対して陽性であり、S100β発現には存在しない（ 図5 ）。 </li></ol></li><li> シュワン細胞様細胞の生成 <ol><li> β-ヘレグリン（100ng / mL）、bFGF（10ng / mL）、血小板由来成長因子（PDGF-AA、5ng / mL）、FBS（10％）、及びα-D-セレクチンを補充したαMEMからなるグリア誘導培地を調製する。 P / S（1％v / v）。 </li><li> 1ウェル当たり1.5mLのグリア誘導培地中、5〜10球/ cm 2の密度で、PDL /ラミニンでコーティングした6ウェルプレート中のセクション4で調製したニューロスフェアをプレートする。 PBSで細胞をすすいだ後、グリア誘導培地を2日ごとに交換する。 注：播種されたニューロスフェアからの細胞は、2日目までに外向きに移動することが見られる。7日目までに、移動性細胞はテーパ状の外観を有し、シュワン細胞に対する免疫陽性を示すはずであるマーカーp75ニューロトロフィン受容体（p75）およびS100β7。これらのセルはSCLCと呼ばれます。 </li></ol></li><li> SCLCとDRGニューロンとの共培養 <ol><li> DRGニューロン維持培地（ステップ5.1.4）およびグリア誘導培地（ステップ5.2.1）からなる共培養培地を1：1の体積対体積比で調製する。 </li><li> FBS（5％）、β-ヘレグリン（10ng / mL）およびP / S（1％v / v）を添加したDMEM / F12からなるシュワン細胞維持培地を調製する。 </li><li> 7日目のSCLCから培地を除去し、PBSですすぎ、37℃で5分間、組換え酵素細胞解離試薬0.5 mL /ウェルと共にインキュベートする。共培養培地中にSCLCを再懸濁する。 </li><li>適切な希釈後、血球計を用いて細胞を定量する。 </li><li> SCLCを精製されたDRGニューロン培養上に1,000細胞/ cm 2の密度でシードする。共培養を14日間維持し、培地交換は2日ごとに行う。 注：共培養の間、SCLCsは、成熟シュワン細胞の典型的な紡錘体様形態を獲得した（ 図6 ）。これらの細胞は、成長因子の回収後に表現型を維持し、 インビトロおよびインビボで軸索をミエリン化することができる7,10。シュワン細胞マーカー（ すなわち、 p75およびS100β）の陽性は、免疫蛍光によってモニターされるべきである。 </li><li>共培養が完了すると、ステップ1.2.2に記載されている通り、運命決定されたシュワン細胞を通過させる。 1ウェルあたり0.5 mLの解離試薬を使用する。適切な希釈後、血球計を用いて細胞を定量する。 </li><li>運命決定されたシュワン細胞をシュワン細胞維持培地に10,000細胞/ cm 2の密度で再懸濁する。免疫蛍光のために細胞をPDL /ラミニンでコートした6ウェルプレートに植えます。 注：共培養には必然的に線維芽細胞を採取したMSCが含まれている細胞運命7 。これらの細胞は、同時培養の完了時に運命決定シュワン細胞と一緒に継代される。この線維芽細胞の上に横たわるシュワン細胞は、他の場所で記載されているように、PBSの「コールドジェット」（4℃）ですすぎ洗いした後、容易に剥がすことができる。運命決定されたシュワン細胞は、維持培地中で1ヶ月間増殖させることができる。 </li></ol></li></ol>

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この原稿のすべての著者は、宣言するための開示がありません。

低酸素プレコンディショニングおよびニューロスフェア培養を介して神経前駆細胞を濃縮する前に、MSCの「幹細胞」を保存することが不可欠です。我々の経験から、多分化能MSCは、それらの細長い線維芽様の形態によって確実に同定され得る。対照的に、顕著な細胞骨格ストレスファイバーを有するより平らな四角形形態を採用したMSCは、容易に神経細胞運命を採用せず、廃棄すべきである。一般的に、我々は、8を超える通過数を有するMSCを利用しない。それらの幹細胞性を維持するために、MSCが100％コンフルエンスに達する前に速やかにMSCを通過させることが重要である。逆に、MSCを低すぎるコンフルエントに維持することは望ましくない。私たちの経験から、40,000細胞/ cm 2の密度でMSCを播種するか、または1：2の比率で80％コンフルエントな細胞を単純に継代培養することにより、最良の結果が得られる。 DRGネットワ​​ークの適切な確立と維持は評論家です共培養の成功の決定因子である。 DRG収穫に必要な時間は最小限に抑える必要があります。個々の神経節は、神経根のみを扱うのが最善である...

神経前駆細胞およびそれらの誘導体の移植は、外傷性神経損傷1,2および神経変性3,4の後の治療戦略として有望であることを示している。臨床応用の前に、i）幹/前駆細胞の自己由来源にアクセスして拡大する方法、およびii）それらを関連する成熟細胞型に導く手段を確実にすることが不可欠である3 。脊髄損傷に対する細胞療法への関心は、成体組織からの神経前駆細胞の堅牢な自己由来の細胞供給源を模索するようになった。 MSCの亜集団は、神経堤に由来し、骨髄腔から容易にアクセス可能である。これらの細胞は、ニューロンおよびグリアを生成し得る神経前駆細胞である。脳虚血の動物モデルは、低酸素症がprolを促進することを実証する<html>脳内の神経前駆細胞の発情と多分化能6 。これは、骨髄由来神経前駆細胞を拡張する手段として低酸素プレコンディショニングを利用するための基礎となった。 損傷した脊髄へのシュワン細胞の移植は、再生を促進する2 。 SCLCは、グリオジェニック因子（ すなわち、 β-ヘレグリン、bFGFおよびPDGF-AA）を補充することによってMSCから生成され得るが、表現型の不安定性を示す。成長因子の回収時に、線維芽細胞様表現型7に戻る 。表現型の不安定性は、異常な分化および発癌のリスクのために、細胞移植において望ましくない。シュワン細胞前駆体は、胚末梢神経8内の軸索束と関連しているので、我々は、精製胚DRGニューロン7を共培養SCLCに導き、ass = &quot;xref&quot;&gt; 9。成熟シュワン細胞は運命決定されており、in vitro 7,9およびin vivo 10で機能を示す 。 MSCからの神経前駆細胞の濃縮に関する我々のプロトコールは、単純かつ効率的であり、その後のアッセイのための細胞数の増加をもたらす。共培養プラットフォームを介した運命決定シュワン細胞の誘導は、グリア分化の研究、および潜在的な臨床適用のための安定かつ機能的なシュワン細胞の生成を可能にする。

<table><tbody><tr><td>&アルファ;MEM</td><td>Sigmaaldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>サーモフィッシャー scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>神経基礎培地</td><td>サーモフィッシャー scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biosera</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>サーモフィッシャー</td><td>scientific 17504-001</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子 (EGF)</td><td>サーモフィッシャー scientific</td><td></td><td></td>PHG0313</tr><tr><td>塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)&nbsp;</td><td>ペプロテック</td><td>100-18B/100UG</td><td></td></tr><tr><td>神経成長因子(NGF)&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>血小板由来成長因子-AA (PDGF-AA)</td><td>ペプロテック</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>ヘレグリンβ-3, EGFドメイン (&beta;-Her)</td><td>ミリポア</td><td>01-201</td><td></td></tr><tr><td>ウリジン</td> シ<td>グマアルドリッヒ</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-フルロ-2' - デオキシウリジン (FDU)</td><td>シグマアルドリッヒ</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン (PDL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P7886-1G</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>接着培養</td><td>用 10 cm プレートTPP</td><td>93100</td><td>組織培養接着によるMSCの選択に使用</td></tr><tr>接着<td>培養用6ウェルプレート</td><td>TPP</td><td>92006</td> 非接着培養用の<td>継代後のMSCの拡張に使用</td></tr><tr><td>UltraLow 非接着培養用6ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3471</td><td>神経前駆細胞濃縮抗</td></tr><tr><td>ヒトCD90(Thy-1)</td><td>BDバイオサイエンス555593</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD73</td><td>に使用BDバイオサイエンス550256</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト/ラットSTRO-1</td><td>R&Dシステム</td><td>ズMAB1038</td><td></td></tr><tr><td>反ヒトネスチン</td><td>R&D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>555480</td><td></td></tr><tr><td>抗ラット CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>554895</td><td></td></tr><tr><td>抗ラット CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>551123</td><td></td></tr><tr><td>抗ラットネスティン</td><td>BD Biosciences</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>抗ラット CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>アンチS100&beta;</td><td>ダコ</td><td>Z031101</td><td></td></tr><tr><td>反 p75</td><td>ミリポア</td><td>MAB5386</td><td></td></tr><tr><td>反 GFAP</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>反クラス III-β チューブリン (Tuj-1)</td><td>コーヴァンス</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>反ヒト核</td><td>ミリポア</td><td>MAB1281</td><td></td></tr><tr><td>低酸素チャンバー</td><td>ビラップス-ローテンベルク</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>バッファーSigmaaldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

この原稿は、骨髄間質細胞（MSC）集団から神経前駆細胞を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞運命に導く手段を記載している。我々はラットおよびヒトのMSCに一時的な低酸素状態（16時間酸素1％）を与え、続いて表皮成長因子（EGF）/塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）補充を伴う低付着層上のニューロスフェアとしての拡大を行った。ニューロスフェアをポリ-D-リシン/ラミニン被覆組織培養プラスチック上に播種し、β-ヘレグリン、bFGFおよび血小板由来増殖因子（PDGF）を含有する膠原性カクテルで培養してシュワン細胞様細胞（SCLC）を生成させた。 SCLCは、E14-15妊娠Sprague Dawleyラットから得られた精製背側根神経節（DRG）ニューロンを用いて、共培養によるコミットメントを2週間行った。成熟シュワン細胞は、S100β/ p75発現の持続性を示し、ミエリンセグメントを形成することができる。このようにして生成された細胞は、脊髄損傷後の自己細胞移植における応用、ならびに疾患モデリングに有用である。

我々のプロトコルの重要なステージの概要を図1に示します。要約すると、ラットおよびヒトMSCは、組織培養プラスチックの接着によって選択される。拡張されたMSCは、低酸素状態で前処理され、次いで、ニューロスフェア形成条件に供される。ニューロスフェアをプレートし、SCLCに分化させる。 SCLCは、精製されたDRGニューロンと共培養され、運命決定されたシュワン細胞を生成する。 培養したラットおよびヒトMSCの形態を図2に示す 。彼らの健康なテーパード形態は、多分化能を失った高継代数について維持されたMSCの四角形の外観と対照的に示される。拡大したラットおよびヒトのコロニーは、造血幹細胞マーカーの欠如であるMSCマーカーの発現および三倍化のための能力を示すべきであるferentiation（ 図3</...

骨髄内には、神経ポテンシャルを有する骨髄間質細胞（MSC）が存在する。我々のプロトコルは、低酸素プレコンディショニングを介してこの細胞集団を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞にするよう指示する。

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

この細胞培養技術の全体的な目的は、骨髄神経前駆細胞を濃縮し、それらを機能的なシュワン細胞へと分化させることです。本手法は、幹細胞および再生医療における重要な課題、すなわち、限られた神経前駆細胞源を用いてどのようにグリア細胞を生成し、外傷後の軸索再成長および脱髄後の再髄鞘化を補助させるかという点に取り組むものです。この技術の利点は、効率的な培養条件を用いることで、骨髄間葉系幹細胞から神経細胞の増殖を促進させ、自己細胞治療に利用できる点にあります。培養2日後、使用済み培地と非接着細胞の75%を除去し、接着細胞を10 mLのPBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、PBSを10 mLの骨髄間葉系幹細胞（MSC）増殖培地と交換し、培養物をインキュベーターに戻します。6日から7日までに目視でコロニーが確認できるはずです。10日目に、新鮮なPBSで培養物を洗浄し、1.5 mLの組換え酵素細胞解離試薬を用いて細胞を剥離させます。37°Cで5分間静置した後、3 mLのMSC増殖培地を加えて反応を中和し、遠心分離によって剥離した細胞を回収します。ペレットを5 mLの新鮮なMSC増殖培地で再懸濁し、新しい10 cm組織培養プレートに4 × 10⁴ cells/cm²の密度で細胞を播種します。細胞は継代から2日以内に80～90%のコンフルエンシーに達する必要があります。低酸素プレコンディショニングを行うには、まずリングクランプを外し、露出した部分を70% ethanolで清掃します。さらに低酸素チャンバーを構成部品に分解し、ラミナーフローフード内に入れてUVライトで15分間滅菌します。次に、先ほど示したように、80から90%までコンフルエントになったMSC培養物を10 millilitersのPBSで洗浄し、25 millimolarのhepesを添加した新鮮なMSC増殖培地で処理します。処理した培養物を再組み立てした低酸素チャンバーに入れ、リングクランプを締めます。ガス漏れがないようチャンバーの接続端を密閉し、99%窒素と1%酸素の混合ガスを10 liters per minuteの流量でチャンバー内に流します。5分後、チャンバーを細胞培養インキュベーターに入れ、16時間静置します。翌朝、先ほど示した方法で細胞を剥離し、遠心分離によって回収します。ペレットを神経前駆細胞培地で再懸濁し、低接着6ウェルプレートに1cm²あたり6×10³個の細胞を播種し、37°C、5% CO2の条件下で12日間培養します。6日目から7日目までに、かなりの大きさの非接着性の細胞球が観察されるはずです。10日目から12日目にかけて、常酸素条件の培養よりも低酸素条件の培養において、より多くのニューロスフィアが認められます。12日目に、10 mLピペットを用いてニューロスフィアを15 mLコニカルチューブに移し、遠心分離によってニューロスフィアを回収します。球体をDMEM/F12で再懸濁し、ポリ-D-リシンおよびラミニンでコーティングした6ウェルプレートに、1ウェルあたり1.5 mLのグリア誘導培地を用いて、1 cm²あたり5〜10個のニューロスフィアを播種する。培地を3日ごとに交換しながら、球体細胞培養を少なくとも7日間維持する。後根神経節を回収するため、最初の胚を解剖顕微鏡下で腹臥位のまま室温のPBSを含む10 cm培養皿に移し、脊髄の両側にマイクロ解剖用ピンセットを挿入する。鈍的剥離を用いて、ピンセットで脊髄を周囲の軟組織から分離し、首の切開部と尾の切り口に沿って脊髄を摘出します。遊離させた脊髄から、脊髄、神経根、および付着している後根神経節のみが残るまで、残存する軟組織を除去します。個々の後根神経節を、接続されている神経根から切り離します。次に、1 mLのピペットチップを装着したピペットペンを使用して、最大100個の後根神経節をPBSを含む1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。遠心分離により神経節を回収し、チューブあたり200 µLの組換え酵素細胞解離試薬でペレットを再懸濁します。37 °Cで10分間置いた後、後根神経節を再度遠心分離し、200 µLのピペットチップを用いて後根神経節ニューロン維持培地中でペレットを穏やかにトリチュレーションします。ポリ-D-リシンおよびラミニンでコートした6ウェルプレートに、背根神経節細胞を5×10³ cells/cm²の密度で、1ウェルあたり1.5 mLの背根神経節ニューロン維持培地を用いて播種します。37 °C、5% CO2の条件下で2日間培養した後、細胞を洗浄し、新鮮な背根神経節ニューロン精製培地を用いてニューロン細胞培養物をインキュベーターに戻し、さらに2日間培養します。維持および精製サイクルを3〜4回繰り返すと、背根神経節細胞培養物はニューロンマーカーであるTuj-1に陽性、グリア細胞マーカーであるS100 betaに陰性を示すはずです。シュワン細胞様細胞の培養7日目に、PBSで細胞を洗浄し、続いて1ウェルあたり0.5 mLの組換え酵素細胞解離試薬を用いて37 °Cで5分間解離させます。細胞ペレットを共培養培地で再懸濁し、精製した後根神経節ニューロン培養上に、1 × 10³ cells/cm²の密度でシュワン細胞様細胞を播種し、37 °C、5% CO2条件下で14日間共培養します。健康なMSCは、継代回数が多く多能性を失ったMSCの四角い外観とは対照的に、細長い形態を示します。拡張されたMSCコロニーは、MSCマーカーの発現、造血幹細胞マーカーの欠如、および脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞への分化能を示す必要があります。低酸素プレコンディショニングを施した健全なMSC培養では、ニューロスフェアの数およびサイズの両方が増大することが確認されます。後根神経節ニューロンネットワークの純度は、ニューロンマーカーTuj-1の発現および、それに伴うシュワン細胞マーカーS100の欠如によって確認できます。後根神経節ニューロンとの14日間の共培養後、シュワン細胞様細胞は、分化運命が決定した成熟シュワン細胞の特性および機能的特性を獲得します。この手法を習得すれば、細胞増殖技術を適切に実施することにより、ヒトまたはラットのBMSC内で神経前駆細胞サブポピュレーションを10日間で増殖させることができます。この手順を行う際は、BMSCサンプルにnestin陽性の神経前駆細胞が含まれていること、およびCD45陽性の造血前駆細胞がすべて除去されていることを確認することが重要です。このビデオを視聴することで、BMSCの採取方法、神経前駆細胞サブポピュレーションの濃縮方法、および神経前駆細胞を運命決定したシュワン細胞へ分化誘導する方法について、十分に理解することができます。これにより、外傷後の軸索再生および再髄鞘化の促進に利用することが可能になります。この手順に従うことで、成熟シュワン細胞などの髄鞘形成グリア細胞を誘導でき、末梢および中枢神経系の両方における脱髄損傷や疾患の治療法開発に活用することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit...

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このビデオは、多能性骨髄間質細胞(BMSC)からシュワン細胞様細胞を得る方法を示しています。最初に、BMSCは低酸素治療を受け、続いてニューロン前駆細胞への指向性分化が行われます。続いて、特定の培地および培養条件を用いて、これらの前駆細胞のシュワン細胞様細胞への形質転換を誘導する。...

骨髄間質細胞からのシュワン細胞様細胞の生成

このビデオは、ラットの胚から後根神経節(DRG)ニューロンを分離し、それらをシュワン細胞前駆体と共培養して成熟したシュワン細胞を生成する手順を示しています。単離されたDRGは、ニューロンとグリア細胞を単離するために処理されます。単離された細胞を培養してニューロンを精製し、ニューロンを共培養培地でシュワン細胞様細胞(SCLC)と共培養します。DRGニューロンとの相互作用は、SCLCのシュワン細胞への成熟につながります。...

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識別し、並べ替え (MAC および FACS) 蛍光と磁気の組み合わせを使ってマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の 6 のサブセットを分離する方法を示します。このプロトコルは、体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化)、養子の転送実験生体内RNA ・...

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学ぶ骨髄間質細胞の低酸素プレコンディショニングによる神経前駆細胞の増殖とシュワン細胞への分化誘導法。この技術は再生医療における自己細胞治療の応用可能性を示しています。

成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング

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