成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング

この細胞培養技術の全体的な目的は、骨髄神経前駆細胞を濃縮し、それらを機能的なシュワン細胞へと分化させることです。本手法は、幹細胞および再生医療における重要な課題、すなわち、限られた神経前駆細胞源を用いてどのようにグリア細胞を生成し、外傷後の軸索再成長および脱髄後の再髄鞘化を補助させるかという点に取り組むものです。この技術の利点は、効率的な培養条件を用いることで、骨髄間葉系幹細胞から神経細胞の増殖を促進させ、自己細胞治療に利用できる点にあります。

培養2日後、使用済み培地と非接着細胞の75%を除去し、接着細胞を10 mLのPBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、PBSを10 mLの骨髄間葉系幹細胞（MSC）増殖培地と交換し、培養物をインキュベーターに戻します。6日から7日までに目視でコロニーが確認できるはずです。

10日目に、新鮮なPBSで培養物を洗浄し、1.5 mLの組換え酵素細胞解離試薬を用いて細胞を剥離させます。37°Cで5分間静置した後、3 mLのMSC増殖培地を加えて反応を中和し、遠心分離によって剥離した細胞を回収します。ペレットを5 mLの新鮮なMSC増殖培地で再懸濁し、新しい10 cm組織培養プレートに4 × 10⁴ cells/cm²の密度で細胞を播種します。

細胞は継代から2日以内に80～90%のコンフルエンシーに達する必要があります。低酸素プレコンディショニングを行うには、まずリングクランプを外し、露出した部分を70% ethanolで清掃します。さらに低酸素チャンバーを構成部品に分解し、ラミナーフローフード内に入れてUVライトで15分間滅菌します。

次に、先ほど示したように、80から90%までコンフルエントになったMSC培養物を10 millilitersのPBSで洗浄し、25 millimolarのhepesを添加した新鮮なMSC増殖培地で処理します。処理した培養物を再組み立てした低酸素チャンバーに入れ、リングクランプを締めます。ガス漏れがないようチャンバーの接続端を密閉し、99%窒素と1%酸素の混合ガスを10 liters per minuteの流量でチャンバー内に流します。

5分後、チャンバーを細胞培養インキュベーターに入れ、16時間静置します。翌朝、先ほど示した方法で細胞を剥離し、遠心分離によって回収します。ペレットを神経前駆細胞培地で再懸濁し、低接着6ウェルプレートに1cm²あたり6×10³個の細胞を播種し、37°C、5% CO2の条件下で12日間培養します。

6日目から7日目までに、かなりの大きさの非接着性の細胞球が観察されるはずです。10日目から12日目にかけて、常酸素条件の培養よりも低酸素条件の培養において、より多くのニューロスフィアが認められます。12日目に、10 mLピペットを用いてニューロスフィアを15 mLコニカルチューブに移し、遠心分離によってニューロスフィアを回収します。

球体をDMEM/F12で再懸濁し、ポリ-D-リシンおよびラミニンでコーティングした6ウェルプレートに、1ウェルあたり1.5 mLのグリア誘導培地を用いて、1 cm²あたり5〜10個のニューロスフィアを播種する。培地を3日ごとに交換しながら、球体細胞培養を少なくとも7日間維持する。後根神経節を回収するため、最初の胚を解剖顕微鏡下で腹臥位のまま室温のPBSを含む10 cm培養皿に移し、脊髄の両側にマイクロ解剖用ピンセットを挿入する。

鈍的剥離を用いて、ピンセットで脊髄を周囲の軟組織から分離し、首の切開部と尾の切り口に沿って脊髄を摘出します。遊離させた脊髄から、脊髄、神経根、および付着している後根神経節のみが残るまで、残存する軟組織を除去します。個々の後根神経節を、接続されている神経根から切り離します。

次に、1 mLのピペットチップを装着したピペットペンを使用して、最大100個の後根神経節をPBSを含む1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。遠心分離により神経節を回収し、チューブあたり200 µLの組換え酵素細胞解離試薬でペレットを再懸濁します。37 °Cで10分間置いた後、後根神経節を再度遠心分離し、200 µLのピペットチップを用いて後根神経節ニューロン維持培地中でペレットを穏やかにトリチュレーションします。

ポリ-D-リシンおよびラミニンでコートした6ウェルプレートに、背根神経節細胞を5×10³ cells/cm²の密度で、1ウェルあたり1.5 mLの背根神経節ニューロン維持培地を用いて播種します。37 °C、5% CO2の条件下で2日間培養した後、細胞を洗浄し、新鮮な背根神経節ニューロン精製培地を用いてニューロン細胞培養物をインキュベーターに戻し、さらに2日間培養します。維持および精製サイクルを3〜4回繰り返すと、背根神経節細胞培養物はニューロンマーカーであるTuj-1に陽性、グリア細胞マーカーであるS100 betaに陰性を示すはずです。

シュワン細胞様細胞の培養7日目に、PBSで細胞を洗浄し、続いて1ウェルあたり0.5 mLの組換え酵素細胞解離試薬を用いて37 °Cで5分間解離させます。細胞ペレットを共培養培地で再懸濁し、精製した後根神経節ニューロン培養上に、1 × 10³ cells/cm²の密度でシュワン細胞様細胞を播種し、37 °C、5% CO2条件下で14日間共培養します。健康なMSCは、継代回数が多く多能性を失ったMSCの四角い外観とは対照的に、細長い形態を示します。

拡張されたMSCコロニーは、MSCマーカーの発現、造血幹細胞マーカーの欠如、および脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞への分化能を示す必要があります。低酸素プレコンディショニングを施した健全なMSC培養では、ニューロスフェアの数およびサイズの両方が増大することが確認されます。後根神経節ニューロンネットワークの純度は、ニューロンマーカーTuj-1の発現および、それに伴うシュワン細胞マーカーS100の欠如によって確認できます。

後根神経節ニューロンとの14日間の共培養後、シュワン細胞様細胞は、分化運命が決定した成熟シュワン細胞の特性および機能的特性を獲得します。この手法を習得すれば、細胞増殖技術を適切に実施することにより、ヒトまたはラットのBMSC内で神経前駆細胞サブポピュレーションを10日間で増殖させることができます。この手順を行う際は、BMSCサンプルにnestin陽性の神経前駆細胞が含まれていること、およびCD45陽性の造血前駆細胞がすべて除去されていることを確認することが重要です。

このビデオを視聴することで、BMSCの採取方法、神経前駆細胞サブポピュレーションの濃縮方法、および神経前駆細胞を運命決定したシュワン細胞へ分化誘導する方法について、十分に理解することができます。これにより、外傷後の軸索再生および再髄鞘化の促進に利用することが可能になります。この手順に従うことで、成熟シュワン細胞などの髄鞘形成グリア細胞を誘導でき、末梢および中枢神経系の両方における脱髄損傷や疾患の治療法開発に活用することが可能です。