寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

この方法は、好中球、単球、樹状細胞などの骨髄系細胞の産生と機能を研究する血液学者や免疫学者に役立つ可能性があります。この手法の主な利点は、以前の戦略よりも骨髄系前駆細胞サブセットをより正確に同定できることです。磁気活性化細胞選別(MACS)により前駆細胞の骨髄細胞を濃縮するには、細胞を遠心分離によりペレット化し、ペレットを7つの骨髄細胞の10倍あたり40マイクロリットルのMACS染色緩衝液に再懸濁します。

分化した系統陽性細胞を枯渇させるには、7つの細胞に10×10あたり10マイクロリットルのビオチン抗体カクテルを加え、ピペッティングで摂氏4度で10分間インキュベーションして混合します。インキュベーション終了時に、7つの細胞に1×10あたり30マイクロリットルの染色緩衝液を混合しながら加え、続いて7つの細胞に1×10あたり20マイクロリットルの抗ビオチンマイクロビーズを添加します。摂氏4度で15分後、7つの細胞に1×10あたり1ミリリットルの染色緩衝液で細胞を洗浄し、ペレットを500マイクロリットルの新鮮な染色緩衝液に再懸濁します。

次に、製造元の指示に従って自動磁気セパレーターをセットアップし、ラベルされたセルのチューブをセパレーターに入れます。ネガティブセレクションプログラムを開始して、祖先が豊富な系統のネガティブセルを含むネガティブフラクションを収集します。系統陰性細胞を遠心分離によりペレット化し、白色になったペレットをマウス1匹あたり2ミリリットルの染色緩衝液に再懸濁してカウントします。

骨髄系前駆細胞をFACSで単離するには、電圧選択と色補償のために、8本のコントロールマイクロ遠心チューブのそれぞれに5系統目のネガティブ細胞に1回10個を加え、残りの細胞サンプルを9本目のマイクロ遠心チューブに添加して、前駆細胞の同定と選別のために目的の7つの表面マーカー抗体すべてで染色します。細胞を遠心分離によりペレット化し、コントロールペレットを100マイクロリットルのFACS染色緩衝液に再懸濁し、実験サンプルペレットを100マイクロリットルの染色緩衝液に再懸濁し、6つの細胞に10倍ごとに5倍ずつ加えます。次に、抗CD16/CD32抗体をFcガンマ受容体シングルステインチューブとサンプルチューブに添加します。

穏やかにボルテックスし、サンプルを摂氏4度で10分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、他の抗体を適切な対応するシングルステインチューブとサンプルチューブに加え、穏やかなボルテックスの後、サンプルを摂氏4度で15分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、コントロールチューブに900マイクロリットルの染色バッファーを、7つの細胞に10×10あたり1ミリリットルの染色バッファーを遠心分離用のサンプルチューブに加えます。

コントロールペレットをチューブあたり200マイクロリットルの新鮮な染色緩衝液に再懸濁し、実験ペレットを2.5×10あたり500マイクロリットルで7つの細胞に再懸濁し、標識した細胞を個々の対応する5ミリリットルのFACSチューブに移します。次に、標準プロトコルに従ってフローサイトメーターをセットアップし、未染色および単一染色コントロールを使用して電圧と色補正を設定します。骨髄系前駆細胞を同定して単離するには、実験細胞サンプルをサイトメーターにロードし、前方散乱領域と側方散乱領域のプロットを作成し、破片と死細胞を除外するようにゲートします。

生細胞の前方散布図の高さと前方散布図の幅のプロットを作成し、ダブレットを除外するためのゲートを作成します。このプロセスを、前方散乱シングレットとゲートの側面散乱光の高さと側面散乱幅のプロットで繰り返して、ダブレットを除外します。Sca-1 対 c-Kit プロットを作成し、c-Kit 陽性の Sca-1 陰性前駆細胞を選択するためのゲートを作成します。

次に、CD-34 対 FC ガンマ受容体プロットを作成し、混合された一般的な骨髄性前駆細胞と混合顆粒球単球前駆細胞集団を選択するためのゲートを作成します。混合総骨髄性前駆細胞と混合顆粒球単球前駆細胞集団をできるだけ正確にゲートすることが重要です。擬似カラー密度プロットまたは等高線プロットを使用すると、より正確なゲーティングが可能になります。

混合された共通骨髄系前駆細胞ゲート内の細胞を使用して、CD115対Flt3プロットを作成し、ゲートを使用して、共通骨髄系前駆体Flt3陽性CD115低細胞、共通骨髄系前駆体Flt3陰性CD115低細胞、およびFlt3陽性CD115高単球樹状細胞前駆細胞を選択する。混合顆粒球単球前駆細胞ゲートの細胞を使用して、Ly6C対FCガンマ受容体プロットを作成し、ゲートしてLy6C陰性細胞とLy6C陽性細胞を選択します。次いで、各ゲート混合顆粒球単球前駆細胞亜集団についてCD115対Flt3プロットを作成し、Ly6C陰性Flt3陰性CD115低顆粒球単球前駆細胞、Ly6C陽性Flt3陰性CD115低顆粒球前駆細胞、およびLy6C陽性Flt3陰性CD115高単球前駆細胞をゲートする。

最大系統枯渇は、分化細胞を枯渇させ、c-Kit陽性前駆細胞を濃縮するのに効率的です。系統陰性画分にはまだいくつかのc-Kit陰性細胞が含まれていますが、これらの細胞はその後のフローサイトメトリーゲーティングステップで排除されます。FACSソーティング後のプロデニター収量は、使用するソーターの設定によって異なりますが、各マウスから10〜4番目の細胞の1倍から4倍の間で、各フラクションについて95%を超えるソート後の純度で取得できるはずです。

良好な染色は、集団のクリーンな分離に不可欠です。最適な分離を確保するために、抗体を滴定したり、異なる蛍光色素を選択したりする必要があるかもしれません。このプロトコルは、前駆細胞の同定、サンプル間の骨髄組成の違いの評価、分子分析のための前駆細胞の単離、または骨髄細胞を産生する能力の評価に使用できます。