ショウジョウバエの訓練と記憶の尺度としてのコンディショニング

求愛条件付けは、非受容的な女性による性的拒絶後の男性の求愛行動の減少に基づく、古典的なショウジョウバエの学習および記憶アッセイです。このアッセイは、学習、短期記憶、および長期記憶のテストに使用できます。この手法は、学習と記憶の根底にある基本的なメカニズムを明らかにし、さまざまな遺伝的条件や環境条件が学習や記憶に及ぼす影響を調べるために利用することができます。

この手法の主な利点は、学習と記憶を堅牢に評価することです。これは、自然に発生する形態の行動可塑性を利用し、最小限の実験設定で実施できます。実験的なオスのハエを収集する11日前に、5〜20の野生型培養を開始し、それぞれに60〜100匹のハエの性別が混在しています。

蛹化のための表面積を拡大するために、一枚の濾紙でパワーフードを使用して各培養バイアルを準備します。パワーフードを使用することは、事前に交配した女性を大量に生産するための重要なステップです。男性被験者を収集する10日前に、フライフードボトルに濾紙を追加し、少なくとも6つの通常の食品175ミリリットルバイアル培養を確立します。

次に、各ボトルに約20人の男性と30〜70人の処女女性を追加します。この実験では、新しい実験的な住宅ブロックを紹介します。実験の2日前までに、これらのブロックを準備します。

パワーフードを溶かし、リピーターピペットを使用して96ウェル平底ブロックの各ウェルに半ミリリットルを追加します。食品が固まったら、ブロックをPCR粘着フィルムで覆います。次に、0.8ミリメートルゲージの針を使用して、各ウェルに少なくとも4つの呼吸穴を突き刺します。

次に、ウェル間のフィルムを縦にカットしますが、完全にはカットしません。プレートの一方の端に無傷のフィルムストリップを残します。ブロックは摂氏4度で最大2日間保存できます。

実験的なオスのハエを収集する1日前に、ハエの主観的な夜明けの2〜5時間前に、野生型のパワーフードカルチャーから成虫のハエをすべて取り除き、廃棄します。次に、2〜3時間ごとに、二酸化炭素を使用してこれらの培養物から新たに閉じた成体を採取します。最大200匹のハエを濾紙で補った新しいパワーフードバイアルにハエを溜めます。

これらの交配バイアルを4日間インキュベートして、すべての雌が交配したことを確認します。今後のすべてのトレーニングとテストのステップのために十分な女性を集めてください。この文化の質は、この実験の成功にとって重要です。

閉じたばかりのハエのみを移し、古いハエ、幼虫、蛹は移さないでください。また、すべての女性と交尾するのに十分な男性がいることも重要です。翌日、主観的な夜明けの2〜3時間前に、通常の食品培養バイアルの他のセットをクリアして、男性の被験者を収集します。

二酸化炭素を使用してすべての成人に麻酔をかけ、バイアルから廃棄します。その後、次の5〜6時間で、20〜30分ごとに閉じたばかりのオスのハエを収集します。オスは、淡い色素沈着と半透明の腹部に胎便が存在することを示す、新たに閉じている必要があります。

次に、吸引器を使用して個々のオスを住宅ブロックの井戸に移動します。テスト対象の実験条件ごとに最大48人のオスを収集します。ハウジングブロックをPCRフィルムでしっかりと再シールしてください。

オスを生後4日になるまで隔離して孵化させます。その後、トレーニングを開始します。実験のトレーニング段階を設定するには、まず、生後4日間の交配バイアルからすべての成体に麻酔をかけます。

性別を分離し、単一の事前交配された女性をハウジングブロックの1列の12ウェルのそれぞれに移します。次に、麻酔なしで吸引器を使用して、ナイーブなオスを自宅の井戸から取り出し、事前に交配したメスを含む井戸に移します。このプロセスを 2 行目で繰り返して、さらに 12 個のペアを設定します。

学習や短期記憶をテストするには、夜明けにこの設定を行い、トレーニング期間を1時間にします。長期記憶をテストするには、主観的な夜明けの4時間前にペアを設定し、トレーニングを8時間続けます。学習と記憶が確立されるためには、オスが交尾に失敗することが重要です。

トレーニング期間中は、ペアを定期的にチェックして、オスが拒否されていることを確認してください。トレーニング期間が終了したら、二酸化炭素麻酔ではなく吸引器を使用してオスをウェルからそっと取り出します。オスを新しいハウジングブロックにロードします。

学習実験では、トレーニング後すぐに男性を休憩時間なしでテストします。短期記憶実験では、テストステージを開始する前にオスに1時間の休息をとらせます。長期記憶実験では、次の主観的な夜明けまでオスを休ませます。

実験のテスト段階に備えるために、交配済みの女性に麻酔をかけ、それらを新しい通常の食品バイアルに移します。ハエが麻酔から回復するまで少なくとも1時間待ちます。次に、テストのセットアップを準備します。

求愛アリーナでの活動を記録するために、ビデオレコーダーを準備してください。テストを開始するには、穏やかな吸引を使用して、仕切りを閉じた状態でテストオスをハウジングブロックから求愛アリーナに移します。アリーナ間のエントリーホールを移動させ、18のアリーナすべてに男性が1人ずつロードされるまで待ちます。

次に、同じ手法を使用して、個々のプレメイトされたメスを18のアリーナのそれぞれに移しますが、仕切りの反対側に移します。次に、求愛アリーナを慎重に裏返し、井戸の開口部を白いベンチの表面に向けてビデオカメラの下に置きます。次に、仕切りを取り外して、ビデオ録画を開始します。

少なくとも 10 分間のアクティビティを記録します。実験が終了したら、バエを掃除機でアリーナから取り除き、求愛室を少なくとも10分間換気してから再利用します。記載された手順を用いて、ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼまたはDhap-atのニューロン特異的RNAiノックダウンにより、ハエの短期記憶および長期記憶を試験した。

コントロールは、nemotode zinc finger遺伝子を標的とする非特異的RNAiを発現しました。どちらのテストでも、訓練されたコントロールは、ナイーブなコントロールよりも求愛指数の中央値が低かったが、これは通常のハエに期待される結果である。それに比べて、訓練を受けたDhap-atノックダウンオスは、長期記憶テストではナイーブフライと変わらなかった。

記憶の定量的分析は、学習インデックススコアです。この指標は、Dhap-atノックダウン雄に見られる長期記憶の欠損を反映しています。日によって通常見られるばらつきを示すために、両方のテストを2日または3日連続で実施しました。

日々の変動にもかかわらず、各試験日の赤字を再現することは可能でした。このビデオを見た後、求愛条件付けパラダイムを使用して、学習、短期記憶、長期記憶を分析する方法をよく理解しているはずです。一度習得すると、求愛条件付けは、学習、短期、または長期記憶を評価する際に、6〜8つの遺伝子型について並行してテストできます。

初期培養が確立されてから、実験が完了するまでに約20日かかります。動物の行動はかなり変動する可能性があります。したがって、光、温度、湿度の違いなど、潜在的な環境要因を排除することが重要です。

同様に、ハエを一貫して穏やかに扱うことが重要です。特定の変異体で学習障害と記憶障害が特定されたら、追加の方法を使用して、根本的なメカニズムを理解できます。例えば、遺伝子発現解析や遺伝的相互作用実験などです。