Name: 腫瘍治療領域（TTFields）を用いた癌細胞の最適阻害頻度の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶ腫瘍治療領域（TTFields）を用いた癌細胞の最適阻害頻度決定法。200kHzの電場が細胞増殖を効果的に抑制し、臨床応用への指針を提供する。

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インビトロアプリケーション・システムにおいて TTFields -ベースプレート皿メンテナンス<ol><li>水道水の下で料理や皿のカバーをすすぎます。次いで、脱イオン水及び空気乾燥フェイスダウンでリンス。 </li><li>化学療法剤/薬剤は、実験前に皿に追加された場合、5％の光洗剤溶液を各皿に充填し、一晩残します。 <ol><li>皿の内側に洗剤の痕跡を避けるために、水道水の下で徹底的に料理をすすぎます。お皿をすすぎ、料理は、脱イオン水と空気乾燥フェイスダウンでカバーしています。 </li></ol></li><li>滅菌袋に彼らのカバーで清潔で乾燥したお料理を挿入します。料理は下向きで、オートクレーブ内袋を密封して配置します。 121°Cより高くないで30分間オートクレーブ。 </li><li>乾燥プログラムにオートクレーブを設定し、一部はオートクレーブドアを開け、そして30分間食器を乾燥させます。 </li><li>軽く70％エタノールで湿らせた布でベースプレートを拭きます。 </li> &lt;/ ol&gt; 2.実験セットアップ注記：このプロトコールで使用されるすべての機器および材料は、材料リストに記載されています。以下のすべてのステップは、無菌状態を維持しながら、層流キャビネット内で行う必要があります。 <ol><li>清潔で滅菌したTTFieldの皿とカバーを第1節で説明したように準備します。ベースプレートを70％エタノールで軽く湿らせた布で拭きます。 </li><li> TTFieldsディッシュをベースプレートに取り付けます。ディッシュを静かに押し、ディッシュのリムがベースプレートの3つのピンに固定されるまで時計方向に約5 mm回転させます。各皿の底に滅菌22 mmのカバーガラス（処理プラスチックまたはガラス）を置きます。 </li><li>完全増殖培地（U-87 MGおよびF98のダルベッコ変法イーグル培地; A2780およびOVCAR-3のRPMI; 材料リスト）。 注： ceLL濃度は80％-90％コンフルエントの細胞増殖を、実験の終了までに超えてはならない、細胞型および実験期間に依存します。 注意：ヒト細胞系は、生物学的ハザードを表すことができ、適切な安全対策で処理されなければなりません。 </li><li>各カバースリップの中央に低下として（倍加時間に応じて、72時間の実験のために200μLで通常5,000〜20,000細胞）の細胞懸濁液200μLを配置し、皿の蓋で覆います。 </li><li>細胞が接着するまでCO 2インキュベーター中で37℃でインキュベートします。一晩のインキュベーションは、この段階でも可能です。 </li><li> 200-または1000μLピペットを用いて滴から流体を吸引します。 </li><li>穏やか各皿を充填する完全増殖培地2mlをピペット。ピペットに無菌チップを使用して、そっと時折スライドの下でキャッチ気泡を放出するためにカバースリップの端をタップ。 </li><li>彼らのふたで料理を覆い、それらにインを置きますTTFields処理の開始まで37℃でCO 2インキュベーターでインキュベートする。 </li></ol> 3. TTFieldsアプリケーション<ol><li>添付のTTFields皿を備えたベースプレートを冷蔵CO 2インキュベーターに移す。 注： インビトロ TTFieldsアプリケーションは熱を生成します。したがって、料理の温めを補うために、冷蔵インキュベーターが必要です。より高いTTField強度はより多くの熱を生成し、インキュベーター周囲温度をより低くする必要があります（ 表1参照）。臨床的に関連するTTFieldの強度は、TTFieldのインキュベータ温度が18〜30℃の範囲にあるときに達成されます。 </li><li>フラットケーブルのメスコネクタをベースプレートに接続します。 TTFieldsジェネレータをオンに切り替えます。 </li><li> TTFields in vitroアプリケーションシステムソフトウェアを起動し、実験設定を選択します。 <ol><li>新しい実験を定義する。 expの名前を入力してくださいerimentとコンピュータ画面上のソフトウェアのユーザーインターフェイスでの実験の所有者。各皿又はベースプレートのための周波数と目標温度を調整します。 </li></ol></li><li>ソフトウェアを使用してTTFieldsアプリケーションを起動します。 </li><li>すべての料理が正しく接続されていることを確認してモニタに水色で表示されます。料理が赤枠で囲んだされた場合（それが正しく接続されていないことを意味する）、軽く下に押し、連絡先が復元されるまで、前後にゆっくりと回転させると料理が水色に表示されます。 </li><li>最大24時間のために実行されている試験管内のアプリケーションシステムで TTFieldsを残します。 </li><li>実験はそのエンドポイントに到達した場合は、ソフトウェアでのEND実験]ボタンをクリックして、実験を停止しない場合は手順5に進み、PAUSE実験をクリックしてください。 </li><li>ベースプレートからフラットケーブルコネクタを外し。クリーンベンチにインキュベーターから料理をベース板を外します。 </li><li>すべての皿にメディアを交換してください24時間毎にベースプレートを冷蔵インキュベーターに戻します。フラットケーブルを使用してベースプレートを発電機に接続します。 CONTINUEボタンをクリックして実験を続行します。 </li></ol> 4.コントロールサンプル 注： TTFieldsアプリケーションを除くTTFields処理細胞と同様の条件でコントロール細胞を増殖させる。 <ol><li> TTFields処理したサンプルをプレーティングするために使用した同じ懸濁液および同様の表面上のプレートコントロールサンプル。 </li><li>コントロール皿を37℃のCO 2インキュベーターに入れます。 </li><li> TTFieldsで処理したディッシュの培地条件と一致するように、ディッシュ中の培地を24時間ごとに交換する。 </li></ol> 5.実験終了<ol><li> END EXPERIMENTをクリックした後、ソフトウェアがシステムからすべてのレコードを取得し、レコードをコンピュータに保存するのを待ちます。 </li><li> REPORTSボタンを使用して、温度、電流、および抵抗のログfすべての料理が実験計画に従って処理されたことを検証するために、各ベースプレートのilesを作成しました。 注：すべてのレポートとログは実験終了後にコンピュータに保存され、いつでも確認することができます。 </li><li> TTFieldsジェネレータをオフにします。 </li><li>フラットケーブルをベースプレートから外し、保育器から取り出します。 </li><li>セラミック製の皿を取り外すには、押し下げて皿を反時計回りに回してベースプレートからロックを解除します。 </li><li>皿を層流キャビネットに入れ、カバースリップを無菌的に除去する。さらなる検査と評価のために新鮮な培地またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む滅菌ペトリ皿に移す。 </li></ol> 6.TTFieldの効果の評価注：TTFieldの効果は、いくつかの点で決定できます。以下の方法の1つ以上を使用して、処理細胞を未処理の対照細胞と比較する： <ol><li>細胞数<ol><li>各カバースリップ含有ディッシュから培地/ PBSを除去する。 </li><li>各ディッシュに0.25％トリプシン/ EDTA 0.5 mLを添加し、CO2インキュベーター内で37℃で10分間（ すなわち、細胞がカバーガラス表面から剥がれ始めるまで）インキュベートする。 </li><li> 0.5mLの完全増殖培地を添加してトリプシンを中和し、上下に穏やかにピペッティングすることによって細胞を再懸濁する。 </li><li>低細胞濃度（ すなわち、約20,000細胞/ mL）を計数することと適合する標準的な細胞計数技術を用いて細胞を数える。 </li></ol></li><li>クローン化アッセイ<ol><li>各ディッシュから同様の数の細胞（1皿あたり100-500細胞）を、新しい、無菌ペトリ皿または2mLの新鮮な完全増殖培地を含む6ウェルプレートにプレートする。 </li><li>約50個の細胞からなるコロニーが形成されるまで、37℃のCO 2インキュベーターで1〜3週間インキュベートする（各細胞株の特性に応じて）。細胞を評価する光顕微鏡によるコロニーあたりの数。 </li><li>培地を除去し、PBSですすいでください。 </li><li> PBSを除去し、氷冷メタノール（1 ml）を加えます。 10分以上のために-20°Cでインキュベートします。 </li><li>メタノールを除去します。 </li><li>クリスタルバイオレット溶液（水中25％v / vのメタノール中のw / vの0.1％）を添加し、20分間インキュベートします。 注意：クリスタルバイオレットは、潜在的な発がん性物質です。クリスタルバイオレットでの作業中に手袋を使用しています。 </li><li> 、クリスタルバイオレットを除去する脱イオン水で3回洗浄し、そして空気乾燥。 </li><li>各皿に形成されたコロニーを数えます。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kirson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+electric+fields+arrest+cell+proliferation+in+animal+tumor+models+and+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Alternating electric fields arrest cell proliferation in animal tumor models and human brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (24), 10152-10157 (2007).</li>
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</ol>

ポラットYaara、Giladiのモシェ、シュナイダーマンS.ローザ、BLATロニ、Shteingauzアンナ、Zeevi Einav、ミュンスターMijal、Voloshinタリ、ケイナン・ノア、タル・オーナ、およびKirson D.エイロンDはNovocure社、イスラエルの従業員を支払っています。ワインバーグウリはNovocure社、ルツェルンの有給従業員です。 Yoram PaltiはNovocure社、NYでの株主です。

TTFieldは、適切に調整された交番電界1,2,8,9,10,17の連続的な適用に基づく、新たな抗腫瘍モダリティである。抗腫瘍効果を最大にすることは、すべての治療様式にとって望ましい結果である。したがって、癌細胞増殖阻害の追加のパーセントごとに「戦う」ことは、患者の長期的な臨床結果に重要な影響を及ぼし得る。これは、TTFieldsアプリケーションの必要な連続性とその結果の累積効果のためです。 TTFieldアプリケーションの最大化は、（1）電界強度の増加、（2）治療期間の延長、（3）最も効果的な組み合わせの発見最適な周波数1,2,4,6,7を規定する他の治療様式18,19 、および（4）を使用している。腫瘍の部位での電場強度を最大にすることは、患者の皮膚上のアレイの位置を最適化することによって達成される。これは、患者20の個々の解剖学的構造に基づいて腫瘍への最大電界強度の送達を可能にする。治療期間の延長は、主に患者の治療遵守に依存している（少なくとも18時間/日）。他の治療法との適切な組み合わせを見出し、最適な頻度を決定することは、TTFields治療結果のための有効なマーカーが現在利用可能でないため、 インビトロの結果に大きく依存する。この作業では、実験的なproceduresはTTFields インビトロのアプリケーションシステムを使用して、癌細胞株に対する最適TTFields周波数を決定するために必要。ここに記載された方法は、潜在的にTTFieldsと他の癌治療法の組み合わせ（ 例えば、化学療法剤または放射線照射）をスクリーニングするために、各特定の併用治療のためのTTFields投与のための最適な周波数を決定するために用いることができます。 以前の刊行物に沿って、ここに示す結果は、両方の神経膠腫細胞および卵巣癌細胞の治療のための最適な周波数は、200 kHzの1、7であることを実証しています。本研究では、クローン原性の可能性を低減するための最適なTTFields周波数が最大の細胞毒性効果につながる頻度と関連していることを初めて実証しました。 TTFields（ すなわち、細胞傷害性およびクローン原性）の効果を定量化するために、この研究で使用される方法A治療成果を評価するための多くの可能な標準的エンドポイントアッセイのうちの2つだけである。さらなる治療成果検査には、（1）細胞内構造の可視化のために細胞を顕微鏡で覆うカバースリップを固定し、染色し、マウントすること、 （2）TTFields皿自体から、または新しい使い捨て皿にカバースリップを移した後に、タンパク質およびRNA抽出物のアッセイを行う; （3）フローサイトメトリー分析のために染色された細胞をトリプシン処理すること。 慎重な実験計画は、TTFieldの送達後の治療成果に影響を与える。重要なステップは、鋭敏な細胞株に適用すると高すぎる強度が必要なアッセイのために必要なアッセイのために少なすぎる結果になるため、実験を通して細胞増殖が過増殖に至らず適切な電場強度を使用することを保証することを含む最適な周波数。逆に、非常に低い強度で適用されたTTFieldより感受性の低い細胞株では、固有の変異によってマスクされ得る小さな効果が生じる。治療ログは、実験を通して、各皿ごとに温度安定性、電流、および抵抗に関する貴重な情報を調べるべきである。治療開始時に誤った皿を交換し、所望の治療パラメータを満たさない皿からのデータを除外することは、複製間の変動性を最小にする。 要約すると、TTFieldsは臨床現場ですでに有効性と安全性が証明されている新たな抗がん治療法である8,9,10。ここに記載されているプロトコルを使用してインビトロ設定でTTFieldを試験することは、臨床設定におけるTTFields処置パラメータの最適化を可能にし、基礎となる作用機序の理解を広げる可能性がある。

腫瘍を治療する腫瘍（TTFields）は、多形性グリア芽細胞腫および潜在的に他の種類の癌の治療のための抗有糸分裂様式である。これらのフィールドは、低強度（1-3V / cm）、中間周波数（100-500kHz）の交番電場を腫瘍領域1,2に連続的に印加することによって供給される。 インビトロおよびインビボでの TTFieldsの適用は 、様々な癌細胞株の増殖およびいくつかの動物腫瘍モデル1,2,3,4,5,6,7における腫瘍の進行の両方を阻害することが示された。グリア芽細胞腫および非小細胞肺癌を含む固形腫瘍患者のパイロット臨床試験およびより大きなランダム化研究では、連続TTFieldsアプリケーション8,9,10の安全性と有効性を評価しました。 TTFieldの有効性は、（1）周波数依存性であり、特定の最適な頻度で異なる起源1,2,4,5,6,7から細胞株の細胞数が最も減少すること; （2）電界強度に依存し、約1V / cmでの活動の最小閾値およびより強力なより高い強度1,2,7,11; （3）処置期間がより長くなると増強される; 5 。 （4）2方向TTFieldが各Othに垂直に適用された場合単一の方向から印加された電界と比較して、上記の知見に基づいて、患者の皮膚に局在する2セットのトランスデューサアレイを用いて腫瘍床12,13の電場強度を最大にするために、長期間にわたって患者にTTFieldを適用することができる。 インビトロで癌細胞に対するTTFieldの効果を研究することは、現在、特定の腫瘍型に適用する最適な頻度を決定する唯一の方法を提供する。最適な周波数を試験するには、細胞培養物に対して100〜500kHzの範囲および3V / cm 2の最大二乗（RMS）の強度で異なる周波数を印加することを可能にする装置が必要である。 TTFieldsアプリケーションでは熱が発生するため、アプリケーションシステムでは過度の熱を放散し、温度を厳密に制御する必要があります。 いくつかのデバイスEは、細胞培養1、2、5、14、15、16 TTFieldsアプリケーションを可能にするために、長年にわたって開発しました。これらの装置の全てにおいて、使用される電極は、電極表面でのそのような電子交換などの導電性電極の使用及び媒体1に有毒な金属イオンの放出に伴う注意事項を回避するために絶縁されました。試験した様々なTTFieldsアプリケーションシステムとの間の主な違いは、絶縁碍子2の薄膜、14、15、16又は高誘電率材料で絶縁金属ワイヤからなる電極（ 例えば、いずれかで、使用される電極の絶縁体の一種でありますニオブ酸鉛マグネシウム - titanatE（PMN-PT））6。絶縁ワイヤ電極がTTFieldsアプリケーションの比較的簡単でコスト効果の高いソリューションを提供するが、それらはしばしば、1 V / cmの閾値を超えると細胞播種のために利用可能な表面によって効果的な電界強度を達成するのに必要な高電圧によって制限されます電極間の距離が比較的小さいです。高誘電率材料を用いて絶縁電極に基づくシステムは、特別な設計と製造能力を必要とし、まだ彼らは、高電圧を必要とせず、電極間の細胞増殖のための大きな面積を提供することができます。 この研究で使用TTFields インビトロアプリケーションシステムは、コアユニットは、高誘電率セラミック（ すなわち、PMN-PT）からなるペトリ皿（TTFields皿、 図1を参照）であると、システムの後者のクラスに属します。 2つの電極対が外側WALに垂直に印刷されています2方向からの電界の印加を可能にするためのTTFields皿を使用した。電極は正弦波形発生器と増幅器に接続されており、50~500kHzの周波数範囲でTTFieldを印加することができます。過度の熱を消散させるために、TTFieldsディッシュは、ディッシュ温度の絶え間ない監視およびシステムによって印加される電圧の調整を使用して実行される中温制御が行われ、冷蔵インキュベーター内に保持される。実際には、ディッシュ内の目標温度が達成されるまで、システムが電圧を増加させるので、インキュベータをより低い温度に設定すると、より高い電界強度につながる。ディッシュ内の温度とインキュベーターの温度との差は、温度勾配に依存して、いくらかの蒸発を引き起こし得る。したがって、適切な増殖条件を維持するために、培養培地を24時間毎に交換する必要がある。 以下のプロトコル細胞数の最大の減少とコロニーを形成する生存細胞の電位の低下が達成されるように、癌細胞にTTFields周波数のアプリケーションを最適化するための実験手順を説明します。

<table><tbody><tr><td>inovitroシステムおよびソフトウェア</td><td>ノボキュア</td><td>社製 ITG1000およびIBP1000</td><td>各ユニットには、TTフィールド発生器1台、ベースプレート1台、カバー付きTTフィールドディッシュ8台、フラットケーブル1台が含まれています。&nbsp;</td></tr><tr><td>滅菌バッグ</td><td>ウェストフィールドメディカル</td><td>24882</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックカバースライド</td><td>サーモサイエンティフィック(NUNC)</td><td>174977</td><td>前処理・滅菌済み</td></tr><tr><td>ガラスカバースライド</td><td>サーモサイエンティフィック(Menzel-Gl&auml;ser)</td><td>CB00220RA1</td><td>必要に応じて</td></tr><tr><td>ダルベッコを滅菌します修正されたイーグル」s medium</td><td>生物産業 (イスラエル)</td><td>01-055-1A</td><td>37°Cで暖かい;使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td>37°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前の</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>バイオロジカルインダストリーズ(イスラエル)</td><td>04-007-1A37</td><td>°Cで暖かい;使用前の C ウォーターバス</td></tr><tr><td>L-グルタミン 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-029</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10,000 U/mL Penicillin, 10,000 &micro;g/mL ストレプトマイシン)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム溶液 100 mM&nbsp;</td><td>バイオロジカル・インダストリーズ(イスラエル)</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>ヘペス緩衝液 1 M</td><td>バイオロジカル・インダストリーズ(イスラエル)</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来のインスリン溶液</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>10516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン/EDTA</td><td>バイオロジカル・インダストリーズ (イスラエル)</td><td>03-050-1B</td><td>37°Cで温める;Cウォーターバス使用前に</td></tr>メタ<tr><td>ノール</td><td>メルク</td><td>1.06009.2511-20</td><td>degに冷却します。クリスタル</td></tr><tr><td>バイオレット</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>120M1445</td>有害使用前に冷凍庫でC<td>。25%メタノール75%水に0.1%w / vクリスタルバイオレット溶液を調製します。</td></tr><tr><td>軽洗剤</td><td>アルコノンクス</td><td>242985</td><td>水で、または製造業者の指示に従って5%溶液を準備します。</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries(イスラエル)</td><td>02-023-1A</td><td>カルシウムとマグネシウムなし</td></tr><tr><td>A2780</td><td>ECACC</td><td>93112519</td><td>FBS(10%)、ペン/連鎖球菌(100&nbsp;U/mL / 100&nbsp;&マイクロ;g/mL)、ピルビン酸ナトリウム(1&nbsp;mM)およびHepesバッファー(12&nbsp;mM)。</td></tr><tr><td>F98</td><td>ATCC</td><td>CRL-2397</td><td>ダルベッコで成長する修正されたイーグル」FBS(10%)、ペン/連鎖球菌(100&nbsp;U/mL / 100&nbsp;&マイクロ;g/mL)、ピルビン酸ナトリウム(1&nbsp;mM)とグルタミン(2&nbsp;mM)。</td></tr><tr><td>Ovcar-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-161</td><td>RPMI 1640で成長し、FBS(20%)、ペン/連鎖球菌(100&nbsp;U/mL / 100&nbsp;&マイクロ;g/mL)、ピルビン酸ナトリウム(1&nbsp;mM)、Hepesバッファー(12&nbsp;mM) とインスリン (10&nbsp;&マイクロ;g/mL)です。</td></tr><tr><td>U-87 MG</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td>ダルベッコで成長修正されたイーグル」FBS(10%)、ペン/連鎖球菌(100&nbsp;U/mL / 100&nbsp;&マイクロ;g/mL)、ピルビン酸ナトリウム(1 mM)、グルタミン(2&nbsp;mM)。</td></tr><tr><td>冷蔵CO2インキュベーター</td><td>CARON</td><td>7404-10-3</td><td></td></tr><tr><td>層流キャビネット</td><td>ADS Laminair</td><td>Bio12 and VSM12</td><td></td></tr></tbody></table>

腫瘍治療領域（ttfields）を用いた癌細胞の最適阻害頻度の決定

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

フィールド（TTFields）を治療する腫瘍は数百キロヘルツの周波数範囲の電界を交互に、低強度の連続的、非侵襲的なアプリケーション（1-3 V / cm）とを介して送達される有効な治療法です。組織培養におけるTTFieldsの研究は、高誘電率（ここでε&gt; 5,000）を有するセラミックペトリ皿に変化する周波数と強度の電界の印加を可能にするTTFields インビトロのアプリケーションシステムを用いて行われます。セラミックペトリ皿の底部にカバーガラス上に播種癌細胞株は、細胞数およびクローン原性アッセイなどの治療結果試験を容易にするために、様々な周波数で二つの直交方向で送達TTFieldsに供されます。この報告書に示された結果は、細胞数およびクローン原性アッセイの両方に関してTTFieldsの最適な周波数は、両方の卵巣癌および神経膠腫細胞のための200 kHzであることを示しています。

<html> TTFields適用後の結果は、細胞数、比色アッセイ、クローン原性アッセイ、および特別なハイウォールTTFields内に配置されたBoydenチャンバーを用いた侵入細胞の数の変化に関する検査など、異なるアッセイに基づいて定量することができる細胞培養皿。所定の細胞倍加時間に基づく慎重な実験計画は、細胞が治療期間中に有糸分裂事象の最大数に達し、それにより治療結果を最大にすることを可能にする。 図2は、A2780（ すなわち、ヒト卵巣癌細胞; 図2A ）およびF-98（ すなわち、ラット神経膠腫細胞; 図2A ）の平均細胞数（ すなわち、細胞数）およびクローン原性アッセイの典型的な周波数スキャン結果を示す。「&gt;図2B）1は、2つの方向TTFields（周波数範囲で処理：100〜500 kHzの、RMS：1.7 V / cmであり、インキュベータの温度：18°C）の結果は、全てで細胞数の有意な減少は、周波数を適用実証、（複数の比較で一方向ANOVA）試験した全ての細胞株について200 kHzで最大の減少と。クローン原性ポテンシャルの最も高い減少をもたらす最適な周波数は、A2780およびF98細胞（ 図2BおよびC）の両方で同じでした。細胞数および各周波数におけるクローン原性効果の間のピアソン相関係数は、それぞれ、A2780およびF98のために0.967（P = 0.002）および0.755（P = 0.083）でした。 （ すなわち、ヒト卵巣癌細胞; 図3A） 図3は、OVCAR-3の平均細胞数に対する周波数スキャン結果を示し、U-87 M異なる強度（RMS：それぞれ1.7,1.3,1.0V / cm、インキュベーター温度：18℃、24℃および28℃）で2方向のTTFieldで処理したG（ すなわち、ヒト神経膠腫細胞; 図3B ） C）。結果は、1.3-V / cmのTTField（インキュベーター温度：24℃）で処理した後のOVCAR-3細胞数の有意な減少はあるものの、細胞を処理したときに得られた結果1.7V / cm（インキュベーター温度：18℃）である。 1.0V / cmのTTField（インキュベーター温度：28℃）で処理したU-87 MG細胞も、1.7V / cmで処理した場合と同様に細胞数の減少において同様の傾向を示したが、その効果は低強度では有意ではなかった。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig1.jpg" /> Figure 1 。 TTFieldsディッシュをベースプレートユニットに取り付け、フラットTTFieldsコントロールケーブルに接続しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55820/55820fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig2.jpg" /> 図2 （A）A2780および（B）F98細胞についての最適なTTFields阻害頻度の決定のための頻度スキャン。細胞を異なる周波数のTTField（1.7V / cmおよび100-500kHz）で72時間処理した。 TTFields処理の効果は、細胞数およびクローン化アッセイを用いて評価した。矢印は最適な周波数を示します。結果は、試験した各頻度について少なくとも6反復に基づく平均±SDを表す。 （ C ）クローン原性の代表的な画像<html>様々な頻度でのTTField治療後のA2780細胞の寛解<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55820/55820fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig3.jpg" /> 図3 （A）OVCAR-3および（B）U-87MG細胞についての最適なTTFields阻害頻度の決定のための頻度スキャン。異なる周波数（100〜500kHz）および強度（OVCAR-3：1.3および1.7V / cm; U-87MG：1.0および1.7V / cm）のTTFieldで細胞を72時間処理した。細胞数を用いてTTFields処理の効果を推定した。矢印は最適な周波数を示します。結果は、試験した各頻度において少なくとも6反復に基づいて平均±SDを表す。pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> インキュベータ周囲温度 </td><td> 期待されるTTField強度 </td></tr><tr><td> （℃） </td><td> （V / cm RMS） </td></tr><tr><td> 18 </td><td> 1.62 </td></tr><tr><td> 19 </td><td> 1.55 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 1.48 </td></tr><tr><td> 21 </td><td> 1.41 </td></tr><tr><td> 22 </td><td> 1.33 </td></tr><tr><td> 23 </td><td> 1.26 </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 1.19 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 1.12 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 1.04 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 0.97 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 0.83 </td></tr><tr> &lt;td&gt; 30 </td><td> 0.76 </td></tr></tbody></table> 表1.インキュベーターの周囲温度と予想されるTTFields強度（TTFieldsディッシュ内）。

腫瘍治療領域（TTFields）は、低強度、中周波、交番電界の連続非侵襲的適用によってもたらされる効果的な抗腫瘍治療法である。 TTFields in vitroアプリケーションシステムを使用して細胞株にTTFieldsアプリケーションを適用すると、細胞数が最も減少する最適な頻度を決定することができます。

腫瘍治療領域（TTFields）を用いた癌細胞の最適阻害頻度の決定

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

TTFieldsのin vitro応用システムの全体的な目的は、さまざまな腫瘍型のがん細胞に対する影響を調査し、TTFieldsの臨床投与の指針とし、治療成績を最適化することです。この手法により、異なるTTFieldパラメータががん細胞に及ぼす影響を定義することが可能になります。本技術の主な利点は、特定のがん細胞株の増殖を抑制する最も効果的なTTField周波数を前臨床段階で特定でき、最終的にヒトへの適用につなげられる点にあります。この手法をわずかに修正することで、TTFieldと化学療法剤や放射線治療などの他の治療法を併用した治療の有効性を検証することが可能です。以下では、当チームの研究者であるYaara Poratが手順を実演します。まず、カバー付きのTTFieldsディッシュをベースプレートに取り付け、対照細胞の培養に使用する追加のディッシュを8個準備します。各ディッシュの底に、滅菌済みの2 mmのカバーガラスを配置します。次に、5 × 10⁴個のU-87 MG細胞を1 mLのDMEM培地で懸濁します。各ディッシュに播種する適切な細胞数は、使用する細胞株の特性によって異なります。細胞の過剰増殖を避けるため、実験前に校正を行うことが極めて重要です。細胞懸濁液 200 µLを各カバーガラス上に滴下し、表面に液滴が形成されるようにしてから、ディッシュに蓋をします。細胞を接着させるため、すべてのディッシュを37 °C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートしてください。細胞が付着した後、200 µLピペットを使用してカバーガラスから培地を吸引し、各ディッシュに2 mLの完全増殖培地を慎重に分注します。滅菌済みのピペットチップでカバーガラスの端を軽く叩き、スライドの下に閉じ込められた気泡を抜きます。その後、TTFields治療を開始するまで、細胞を37 °C、5% CO2でインキュベートします。TTFields治療を開始するには、37 °Cのインキュベーターからベースプレートを取り出し、冷蔵二酸化炭素インキュベーターに入れます。冷蔵インキュベーターの温度によって電界強度が決定されます。TTFieldsに対する細胞の感受性に応じて、適切な強度を使用することが重要です。次に、フラットケーブルのメスコネクタをベースプレートに接続し、TTFieldsジェネレーターの電源を入れます。TTFieldsのin vitroアプリケーションシステム専用のソフトウェアを起動します。実験名と実験者の名前を入力して新しい研究を定義した後、各ディッシュの周波数と設定温度を調整します。ソフトウェアのスタートボタンをクリックしてTTFields治療を開始し、モニター上のすべてのディッシュが水色に表示されていることを確認して、適切に接続されていることを確かめてください。接続を再確立するには、ディッシュをそっと押し下げ、画面上でディッシュが水色に表示されるまでゆっくりと前後に回転させます。治療から24時間後、ソフトウェアのポーズボタンをクリックして実験を停止してください。ベースプレートからフラットケーブルコネクタを取り外し、ベースプレートを層流キャビネット内に設置します。次に、標準条件下で培養したコントロール細胞とディッシュが載ったベースプレートをインキュベーターから取り出します。すべてのディッシュの培地を新鮮な完全増殖培地に交換し、コントロール細胞を37 °C、5% CO2インキュベーターに入れ、ベースプレートを冷蔵インキュベーターに戻します。ベースプレートをジェネレーターに再接続します。「Continue」ボタンをクリックして処理を継続します。処理が完了したら、ソフトウェアの「End Experiment」ボタンをクリックして実験を終了し、システムからアップロードされたデータを保存します。TTFieldsジェネレーターの電源を切った後、ベースプレートからフラットケーブルを取り外し、システムをインキュベーターから取り出します。セラミック製ディッシュを押し下げながら反時計回りに回し、ベースプレートから取り外します。次に、さらなる評価のため、TTFields処理群および対照群のカバースリップを、新鮮な培地を含む滅菌ペトリ皿に無菌的に移します。TTFields処理の効果を評価するため、各カバースリップが入ったディッシュから培地を除去し、0.25% trypsin/EDTAを0.5 milliliters添加し、細胞がカバースリップ表面から剥離するまで37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。0.5 mLの完全増殖培地でトリプシンを中和し、懸濁液を穏やかにピペッティングして細胞を再懸濁します。最後に、フローサイトメトリーで細胞数をカウントします。ここでは、A2780細胞を用いて実施した周波数スキャンの結果を示しており、検討した細胞の増殖およびコロニー形成能に対するTTFieldsの周波数依存的な影響が明らかになっています。200 kHzの周波数を適用した際に、最も顕著な治療効果が観察されました。2つの異なる強度で実施されたTTFields治療の有効性をOVCAR-3細胞で検討しました。本研究により、適用強度と治療結果との間に明確な相関関係があり、電界強度が高いほど増殖抑制活性が強くなることが示されました。印加された電界強度にかかわらず、TTFields処理の最も強力な効果は200 kilohertzの周波数で観察されました。この手法を習得すれば、1日30分未満で実施可能です。この手順を行う際は、培地の流出を避け、インキュベーターからフードへ、またその逆にディッシュを移動させる際に、ディッシュのバランスを維持することが重要です。TTFieldsの適用後、治療結果および観察された活性の根底にあるメカニズムをさらに調査するために、フローサイトメトリー、アラニンタンパク質分析、または免疫蛍光顕微鏡法などの他の手法を実施することができます。この技術は、さまざまな種類のがんに対して、臨床設定で適用すべき最適なTTFields周波数を決定するために使用されます。このビデオを視聴することで、in vitroでのTTFields実験をどのように計画し、実行するかについて十分に理解できるはずです。ヒト細胞株の取り扱いは危険を伴う可能性があるため、本手順の実施中は、保護手袋や作業着などの予防措置を必ず講じてください。

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