腫瘍治療領域（TTFields）を用いた癌細胞の最適阻害頻度の決定

腫瘍治療領域（TTFields）は、低強度、中周波、交番電界の連続非侵襲的適用によってもたらされる効果的な抗腫瘍治療法である。 TTFields in vitroアプリケーションシステムを使用して細胞株にTTFieldsアプリケーションを適用すると、細胞数が最も減少する最適な頻度を決定することができます。

TTフィールドin vitroアプリケーションシステムの全体的な目標は、TTフィールドの臨床投与を導き、治療結果を最適化するために、さまざまな腫瘍タイプのがん細胞に対するその影響を調査することです。この方法は、がん細胞に対するさまざまなTTFieldパラメータの影響を定義するのに役立ちます。この技術の主な利点は、特定のがん細胞株の増殖を阻害する最も効果的なTTField周波数を前臨床で特定できることであり、これは最終的にヒトに適用できる可能性があります。

この技術を少し変更することで、TTフィールドと化学療法剤や放射線療法などの他の治療法との併用療法の有効性を検証することができます。手順をデモンストレーションするのは、私たちのチームの研究者であるYaara Poratです。まず、TTフィールドのカバー付きディッシュをベースプレートに取り付け、コントロールセルの増殖に使用するディッシュを8枚追加で用意します。

各皿の底に滅菌済みの2mmカバースリップを置きます。次に、1ミリリットルのDMEM培地に10〜4番目のU-87 MG細胞を5回懸濁します。各ディッシュに播種する細胞の適切な数は、使用する細胞株の特性によって異なります。

細胞の過成長を避けるために、実験前にそれを較正することが重要です。200マイクロリットルの細胞懸濁液を各カバースリップにピペットで移し、表面に液滴が形成されるようにし、皿を蓋で覆います。すべての皿を摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートし、細胞が付着するのを待ちます。

細胞が付着したら、200マイクロリットルのピペットを使用してカバーガラスから培地を吸引し、次に2ミリリットルの完全増殖培地を各皿に慎重にピペットで移します。滅菌ピペットチップでカバースリップの端を軽くたたいて、スライドの下に引っかかった気泡を放出します。その後、TTフィールド処理が始まるまで、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベー

TTフィールド処理を開始するには、37°Cのインキュベーターからベースプレートを取り外し、冷蔵炭酸ガスインキュベーターに入れます。冷蔵インキュベーターの温度によって電界強度が決まります。TTフィールドに対する細胞の感度に依存する適切な強度を使用することが重要です。

次に、フラットケーブルメスコネクタをベースプレートに差し込み、TTFieldsジェネレーターの電源を入れます。TTFields in vitroアプリケーションシステム専用のソフトウェアを開きます。実験と実験者の名前を入力して新しいスタディを定義した後、各皿の周波数と目標温度を調整します。

スタートボタンをクリックしてソフトウェアでTTFields処理を開始し、モニターにすべての皿が水色で表示され、適切な接続を確認します。接続を再確立するには、ディッシュをそっと押し下げ、ディッシュが画面に水色になるまでゆっくりと前後に回転させます。治療の24時間後、一時停止をクリックしてソフトウェアで実験を停止します。

フラットケーブルコネクタをベースプレートから外し、ベースプレートを層流キャビネットに配置し、標準条件で成長したディッシュと制御細胞が入ったベースプレートをインキュベーターから取り外します。すべての皿の培地を新鮮な完全増殖培地と交換し、コントロール細胞を摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーターに入れ、ベースプレートを冷蔵インキュベーターに戻します。ベースプレートを発電機に再接続します。

続行ボタンをクリックして治療を続行します。治療が完了したら、ソフトウェアの実験終了ボタンをクリックして実験を終了し、システムからアップロードしたデータを保存します。TTフィールドジェネレーターの電源を切った後、フラットケーブルをベースプレートから外し、システムをインキュベーターから取り外します。

セラミック皿を押し下げて反時計回りに回し、ベースプレートから取り外します。次に、処理されたTTフィールドとコントロールカバースリップを、新鮮な培地が入った滅菌シャーレに無菌的に移し、さらなる評価を行います。TTフィールド処理の効果を評価するには、カバースリップを含む各ディッシュから培地を取り出し、0.5ミリリットルの0.25%トリプシン/EDTAを加え、細胞がカバースリップ表面から剥離するまで、ディッシュを摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベー

0.5ミリリットルの完全増殖培地でトリプシンを中和し、懸濁液を静かにピペッティングして細胞を再懸濁します。最後に、フローサイトメトリーで細胞をカウントします。ここでは、A2780細胞で実施した周波数スキャンの結果を示し、TTフィールドが研究対象細胞の増殖とクローン形成能力に及ぼす周波数依存性の影響を明らかにしています。

最も顕著な治療効果は、200キロヘルツの周波数を適用したときに観察されました。OVCAR-3細胞において、2つの異なる強度で実施したTTフィールド処理の有効性を調査しました。この研究は、適用強度と治療結果との間に明確な関係があり、より高い電界強度のより大きな成長阻害活性を示しています。

印加された電界強度に関係なく、TTフィールド処理の最も強い効果は200キロヘルツの周波数で観察されました。一度習得すれば、このテクニックは1日30分未満で行うことができます。この手順を試みるときは、メディアのこぼれを防ぎ、インキュベーターからフードに皿を移すとき、およびフードに戻すときに皿のバランスを保つことを覚えておくことが重要です。

TTFieldの適用後、フローサイトメトリー、アラニンタンパク質解析、免疫蛍光顕微鏡などの他の方法を実施して、治療結果と観察された活性の根底にあるメカニズムをさらに調査することができます。この手法は、さまざまな種類のがんの臨床現場で適用される最適なTTフィールド周波数を決定するために使用されます。このビデオを見れば、TTフィールドin vitro実験の計画と実施方法について十分に理解できるはずです。

ヒト細胞株の取り扱いは危険な場合があり、この手順を実行する際には常に保護手袋や衣服などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。