Name: ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶODELAY法を用いて酵母の増殖表現型を定量化する方法。タイムラプス顕微鏡で個々の細胞からコロニー形成まで観察し、遺伝的撹乱や薬物相互作用の影響を解析できます。

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著者らは、米国国立衛生研究所からのJDAへのU54 RR022220およびP50 GM076547の付与により、この研究の支持を認めている。 FDMは、カナダ研究所の健康研究の博士研究員です。また、ルクセンブルグのシステムバイオメディシンセンターとルクセンブルグ大学のサポートにも感謝します。

<ol><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactose+metabolism+in+yeast-structure+and+regulation+of+the+leloir+pathway+enzymes+and+the+genes+encoding+them%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).</li>
<li>Yoshikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+phenotypic+analysis+for+identification+of+genes+affecting+growth+under+ethanol+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).</li>
<li>Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mass%2C+density%2C+and+volume+during+the+cell+cycle+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).</li>
<li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+fitness+and+genetic+interactions+in+yeast+on+a+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale.</a> Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).</li>
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<li>Zackrisson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scan-o-matic%3A+High-Resolution+Microbial+Phenomics+at+a+Massive+Scale%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale.</a> G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).</li>
<li>Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-high-density+screening+tools+for+microbial+%27omics%27%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'.</a> PloS One. 9 (1), e85177(2014).</li>
<li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous%2C+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10 (5), e1001325(2012).</li>
<li>Herricks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Cell+Doubling+Evaluation+by+Living+Arrays+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22ODELAY%21+G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast.</a> ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).</li>
<li>Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25225336">Systems cell biology.</a> J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).</li>
<li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4297649/">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> J Biol Methods. 1 (2), e10(2014).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

ODELAYアッセイは、再現可能で信頼できる表現型測定を確実にするためにいくつかの重要な点を有する。第1の重要な点は、酵母培養物の一貫した調製である。酵母細胞を対数増殖から収穫するように注意しなければならない。培養物が飽和していると、それらの集団の異種性が増加し、遺伝的または環境的（ 例えば、炭素源）因子11によって引き起こされる異質性を不明瞭にすることがある11 。第2の重要な点は、メディアの一貫した準備です。一般に、多量の10倍ストック培地溶液を生成し、経時的に使用してバッチ効果を最小限に抑える必要があります。可能であれば、培地を重量で処方することは、寒天の密度およびアガロースの全水分含量を注意深く監視することによって、時間の経過とともに培地の一貫性を改善するのに役立つ。第3の重要な点は、アガロースの機械的変形を最小化または排除することである直径培地の機械的変形は、ガラススライドからのアガロースの分離中に最も一般的に起こる。多くの実験技術と同様に、このステップを習得するためには練習が必要です。 図4に示すラグタイムの変動は、アガロース培地の機械的変形、寒天の厚さの変化、または不安定な光源の3つの要因の1つに関連することがよくあります。アガロース媒体がスポットアレイ内でZ高さが変化する場合、高さの変動はオートフォーカスルーチンの範囲を圧倒し、初期画像にわずかに焦点が合わないことがあります。このため、中央の複数のスポットで、フォーカスされたアレイのエッジに沿ってフォーカスの高さを確認し、オートフォーカスルーチンがフォーカスを見つけるのに十分なZ範囲を持つことを確認します。必要に応じて、オートフォーカスパネルを使用してフォーカス範囲を広げ、フォーカスのステップ数を増やします。 3番目に可能な条件イオンは、不安定またはちらつきのある光源であり、特定のZ高さについて計算された焦点スコアを乱す可能性があります。タングステンハロゲン電球は電球が燃える前によくちらつく傾向があります。弱い焦点の効果は、第1および第2の時点（ 図 5A ）の間に成長曲線がディップし、隣接する点が同じディップを有さない（ 図 5B ）一例で観察される。この場合、タングステンハロゲン光源を交換することにより、不十分な焦点条件が緩和された。 実際には、100Wのタングステンハロゲン電球のちらつきを低減するためには、顕微鏡を大量に使用している場合、電球を500時間ごとまたはおよそ2ヶ月に1回交換する必要があることが実証されている。ちらつき球からのフォーカスの問題を避けるため、タングステンハロゲン光源を頻繁に交換するか、ハロゲン球をダイオード光源に交換してください。アン倍加時間のばらつきが小さく、より均一なラグタイムを示すデータセットの例を図6に示します 。このデータセットは、オートフォーカスを実行しながら時間の経過とともにより安定した照明を提供するダイオードイルミネータで撮影されました。 文献では、メディアの準備を最適化するためにここで述べた多くの点が明白であるように見えるかもしれませんが、最も大規模なスクリーンはお互いにうまく複製しません8,11。したがって、より再現性のある表現型のスクリーニングが生成されるように、我々は培養およびアガロース培地の調製を注意深く記述した。 ODELAYアッセイは、現在のところ、合成遺伝子アレイまたはScan-O-Maticアッセイなどのピニングに基づくアッセイと比較した場合、スループットが制限されている。これらの方法は、測定される菌株の数を増加させるが、個々の細胞を分解する能力が欠如しているしたがって、クローン酵母株内で観察される集団の異種性を測定することはできない。この集団の異質性の起源は現在理解されていませんが、ここに示されている技術と計算の融合は、基礎となる細胞メカニズムを客観的に扱う機会を提供します12 。 著者はODELAYは現在特定の顕微鏡ブランドとボディタイプにのみ最適化されていることに注意したい。他の顕微鏡システム用にODELAYを変更することは簡単ですが、オープンソースAPI 13の知識が必要です。しかし、APIおよびODELAYスクリプトの両方は、異なるシステムおよび実験的アッセイに容易に適合するように書かれている。 ODELAYはもともと酵母用に開発されましたが、 Mycobacterium smegmatisの増殖を観察するためにそのまま使用することができました。他のコロニー形成微生物の観察は提供されたソースコードに変更を加えることが可能です。一般に、ODELAYは、異なる環境条件および遺伝的撹乱下で増殖した微生物を比較するための強力かつ柔軟なツールである。

微生物の増殖表現型は、所与の環境条件に対するそれらの根底にある遺伝的適合性の強力な指標である。成長は、古典的に3つの異なる成長レジーム、すなわち、ラグ期、対数期および定常期の成長に分けられる。各成長段階は、様々な環境および遺伝的条件に依存する適応性の異なる側面を明らかにすることができる。例えば、生物が指数関数的増殖の開始前に遅滞期に費やす遅れ時間または時間は、変化した環境条件に応答する生物の能力を示すことができる2 。対数増殖期の2倍の時間、最も一般的な細胞適合度は、複製に環境物質を代謝および利用することによって分裂する生物の全体的な効率を明らかにする。対数期後の成長が急速に減少する定常期は、適格性のもう一つの指標であり、定期的スポットベースの酵母増殖アッセイにおいて成長エンドポイントとして使用される。 現在、いくつかの酵母増殖アッセイが利用可能であり、酵母3,4,5における増殖表現型を評価するための標準的な方法と考えられている。これらのアッセイは、主として固体培地または液体培地のいずれかで酵母を成長させる方法に基づいている。固体培地では、コロニーピニングアッセイは、ピンを用いて固体寒天上に少数の細胞を移動させ、酵母細胞を一定期間増殖させる。次いで、コロニーを画像化し、それらのサイズを終点のエンドポイント6で比較する。これらのコロニーピニングアッセイは、ゲノムワイドスクリーンを生成するために堅牢でスケーラブルであることが証明されている。より最近では、フラットベッドスキャナーおよびSLR（Single Lens Reflex）カメラを用いた周期的な画像化が、これらのアッセイに組み込まれて、時間の経過とともにコロニーの成長が記録される7,8、 9 。しかしながら、これらの装置の分解能は、それらが単一細胞を検出することを妨げ、したがって、これらのコロニー固定アッセイは、ラグタイムを直接観察せず、コロニーに成長する個々の細胞間の変異を観察することができない。 ゲノムワイドスクリーンを行うために、液体ベースの成長アッセイも採用されている3 。液体成長アッセイを経時的顕微鏡と組み合わせることにより、遺伝的に同一の個々の細胞の倍加時間における集団の異質性が明らかとなり、これは遺伝的調節および環境適応を理解するための重要な視点を提供する。しかしながら、このアッセイは、ラグタイムおよびキャリー能力などの成長の他の側面を測定しない。ここでは、ODELAY 11と呼ばれるアッセイを用いて、固体培地上のコロニー形成微生物の3つの成長段階のすべてを特徴付ける方法を提示する。 ODELAYはutiliで構成されていますハイスループットの時間分解顕微鏡を用いて固体培地上のコロニーに成長する単一細胞の画像を記録する。コロニーに成長する個々の細胞のこの集団は、基礎となる集団の異種性を明らかにするが、これは、終点のエンドポイントのスコアリングなどの他の感度の低い測定によっては検出されない。私たちは酵母でこの方法を実証していますが、ODELAYは明視野顕微鏡検査でコントラストを示す生物に適用されるかもしれません。

<table><tbody><tr><td>アガロース ウルトラピュア</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16500500</td><td>ゲル温度 36C、ゲル強度 (1%) 1.2 g/sq cm</td></tr><tr><td>酵母エキス ペプトン (YEP)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>コンプリート サプリメント ミックス (CSM)</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール 3350 (平均分子量 3000-3700)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>酵母株BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>酵母株 BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon チューブ</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 ケース</td></tr><tr><td>15 mL Falcon チューブ</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 インチ 1.0 mm 厚スライド 1/2 グロス</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル プレート 平底</td><td>コーニング</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Hydra液体ハンドリングロボット</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Liquid Handlinging Robot</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydra 100 mL tips Extended Length DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ 10X/0.3NA 対物レンズ</td><td>ライカ</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>浜松 ORCA Flash 4.0 カメラ</td><td>浜松</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 画像処理ツールボックス付き</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://micro-manager.org/ ODELAY 顕微鏡制御 (MATLAB スクリプトと GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY Matlabスクリプトおよびソフトウェア</td></tr><tr><td>用 ODELAY 顕微鏡チャンバー</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY 機械図面用</td></tr><tr><td>ODELAY寒天金型</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY 金型図面用</td></tr></tbody></table>

odelay：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

微生物の増殖表現型は、それらの根底にある遺伝的適応性の強い指標であり、3つの成長レジーム、すなわち、ラグ期、対数期、および定常期に分離することができる。それぞれの成長段階は、様々な環境および遺伝的条件に関連する適応性の異なる側面を明らかにすることができる。 3つの成長段階すべての高分解能および定量的測定は、一般に入手が困難である。ここでは、酵母の生きた配列（ODELAY）の1細胞倍加評価と呼ばれるアッセイを用いて、固体培地上の3つの成長段階のすべてを特徴付ける詳細な方法を提示する。 ODELAYは、時間経過顕微鏡法を用いて固体培地上でコロニーに成長する個々の細胞の増殖表現型を定量化する。この方法は、コロニーに成長する遺伝的に同一の細胞における各成長パラメータでの集団の異質性を直接観察することができる。この集団の異質性は、遺伝的および後成的な調節を理解するためのユニークな視点を提供し、遺伝的および環境的摂動。 ODELAY法は酵母を用いて実証されているが、明視野顕微鏡法で見える任意のコロニー形成微生物に利用することができる。

<html>タイムラプス顕微鏡法で増殖する酵母の例示的な画像を図3Bに示す。時間経過画像を処理した後、酵母株BY4741およびBY4742を比較する代表的なデータセットを図4に示す。この例のデータセットでは、プレート上の異なる位置の間の倍加時間にはほとんど変化がありません。アガロース培地が十分に調製されていない場合、アガロースゲルの変形領域と一致するスポット位置において、倍加時間および遅延時間の両方の明らかな偏差が明らかであろう。倍加時間は比較的均一であるように見えるが、この実施例は遅延時間測定の変化を示す。より一貫性のあるデータセットを図6に示します 。このデータセットでは、ラグタイムとダブリングタイムの両方が均一です。 files / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：寒天モールドアセンブリ。 寒天鋳型の成分を（ A ）に示す。 （ B ）に示すようにベースを組み立て、小さなバインダークリップでベースを固定します。より長い垂直の部分をベースのキャビティ（ C ）に置き、（ D ）に示すようにスライドを金型にキャンプキャンプします。スライドガラス（ E ）からの寒天の一貫した分離に必要な金型の角度および型切れの方向を示す側面図。親指と人​​差し指の位置、および寒天の直線をスライド（ F ）から分離し、水平の矢印に注意してください。分離線は、垂直の矢印の方向に均等に移動する必要があります。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> = &quot;jove_content&quot; fo：keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> 図2：音波処理およびスポッティング法。 プレートを氷水中で超音波処理し、プレート（ A ）を支持するために遠心分離バケットホルダーを使用する。アガロースプレート（ B ）上にスポッティングするために、3.8.1のステップのプレートを置きます。また、チップの最左端にC10の位置にチップが1つ、他の4つの先端が切断されてプレートホルダー（ C ）が破損しないようにヒントを配置します。内側の24の先端位置が占有されるように残りの先端を4つのボックスに配置する（ D ）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; 図3：ODELAYグラフィカルユーザインタフェース。 &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot;（ A ）のグラフィカルユーザーインターフェイスのスクリーンショット。このインターフェースは、カメラの監視を可能にし、落射蛍光及び明視野モードの顕微鏡照明設定を調整する。赤い矢印は、カメラを起動して画像をすばやく取得し、送信された光シャッターを開くための[フォーカス]ボタンと[送信]ボタンを示しています。青い矢印は、原点のステージを移動させ、「原点移動」ボタンと「設定」ボタンを使用して原点を設定するために使用されます。緑色の矢印は「リセット」と「ODELAY !!!」を指します。 ODELAY画像モードを現在の状態にリセットし、ODELAY画像収集を開始するボタン。スポッティング後0,3,6、および9時間で固体培地上で増殖する酵母の経時的画像（ B ）。 &quot;ODELAY_IPT.m&quot;またはthのグラフィカルユーザーインターフェイスのスクリーンショット<html>イメージ処理ツール（ C ）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> 図4：ODELAY出力の例 このデータセットは、YPD培地上のBY4741株およびBY4742株を比較する。この図は、十分に調製されたアガローススライドの例である。しかし、オートフォーカスの設定は最適ではありません。各列には、左から右に提示されるデータは次のとおりです。倍加時間、分で与えられる;遅れ時間は、minで与えられる。この例では、寒天スライド上のすべてのスポットの倍加時間は、カラムに向かう少量の倍加時間を伴って上がります。しかし、このデータセットでは、遅延時間がかなり異なる。_upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <img alt="図5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> 図5：成長曲線の例 この例は、不十分な初期焦点が、どのように隣接する位置がより短い遅延時間（ B ）を示す一方で、推定遅延時間（t lag ）を増加させる（ A ）かを示す。 t dは分単位の倍加時間であり、t lagは分単位の遅延時間である。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> 図6：よく実行されたテスト実験の例 電子タングステンハロゲンバルブをダイオードイルミネータに交換し、オートフォーカスが正しく設定されていることを確認した後に試験されたBY4742株の一例。すべての倍加時間はよく重なるように見え、遅れ時間は一貫しているように見える。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

私たちは、個々の酵母細胞の成長表現型を、酵母（ODELAY）の生存アレイの1細胞倍加評価と称する経時的顕微鏡法を用いて固体培地上でコロニー中に増殖させる際に定量する方法を提示する。コロニーに成長する遺伝的に同一の細胞の集団の異種性を直接観察および定量することができる。

ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

ODELAYの全体的な目的は、コロニーへと増殖する個々の細胞の増殖表現型を高スループットに測定することです。この手法は、遺伝的摂動や薬剤相互作用がコロニー形成微生物の増殖表現型に及ぼす影響など、微生物学、遺伝学、システム生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。ODELAYの主な利点は、研究者が多数の個体間における集団の不均一性を直接観察し、定量化できることです。アガロース成形体を組み立てる前に、アクリル製の型を70% ethanolで洗浄し、送風乾燥させます。底板が3枚と直立板が2枚あります。アガロース成形体の組み立てを開始するには、3枚の底板を取り、2枚の同一の部品で3枚目の部品を挟むように組み立てます。2つの小型バインダークリップを使用して、ベースパーツの両側を固定します。レーザーカーブが正しく配置されていることを確認しながら、直立パーツを型に入れます。洗浄して乾燥させたガラススライドを型の上に置き、その状態で固定しながら、反対側に2枚目のガラススライドを配置します。アセンブリを大きめのバインダークリップで固定します。2枚のスライドの両方を大きめのバインダークリップで固定し、各上のクリップがアクリルと重なるようにガラススライドに接触していることを確認してください。組み立てた型に溶融アガーを注入する前に、型の内側に約70 µLの溶融アガー培地をピペッティングし、端が封止されていることを確認します。溶融したアガロースをモールドの縁に沿ってゆっくりとピペッティングし、内部に気泡が入らないようにモールドを満たします。モールドを満たした後、周囲温度約23 degrees Celsiusで40-60分間冷却させます。次のステップはモールドの分離です。まず、下のバインダークリップを取り外します。次に、3枚のプレートが重ねられた金型の底部分を取り外します。スライドを圧縮して固定したまま、バインダークリップを慎重に取り外します。モールドの青いドットがある面を上にして、ベンチトップの端に置きます。両方の親指をアクリルの下に、人差し指をモールドの内側の縁に近い上部に添えます。そして、モールドスペーサーの下端を支点にして回転させるように、親指でモールドをゆっくりと慎重に押し上げます。一定の圧力をかけながら、徐々に力を強めてください。上部のガラスがモールドスペーサーを覆っているラインに沿って、亀裂と気泡が現れます。最初の亀裂ラインを確認した後、両方の親指で押し上げ続け、一定の圧力をかけます。すると、アガーがガラスから離れ始めます。引き続き、型を上に回転させます。ガラスが完全に離れたら、それを掴んで型から完全に取り出します。次に、同様の動作でもう一方の型の部品を取り外し、アガーを動かさずに作品を上に持ち上げて取り出します。スライドを、底に滅菌済みの高純度水を少量入れた滅菌チップボックスに入れます。ボックスを閉じ、4°Cで一晩保存して翌日に使用します。テキストプロトコルに記載されている通り、96ウェルプレートで菌株を調製して、この手順を開始してください。プレートリーダーを用いて、各培養液の600 nmにおける吸光度を測定します。次に、自動希釈プロトコルを使用して、プレート内の培養液を600 nmでの吸光度が約0.1になるように希釈します。希釈プログラムの設定が完了したら、デッキレイアウトの指示に従って、プレート、チューブ、およびチップを液体ハンドリングロボットのデッキにセットしてください。再生ボタンをクリックして希釈プログラムを実行します。適切な本数の50 µLチップと300 µLチップを選択してください。希釈が完了したら、ロボットから希釈プレートを取り出し、プレートの乾燥を防ぐため湿度を維持しながら、30 °Cで5〜6時間培養します。培養プレートのインキュベーションが完了する約1〜2時間前に、顕微鏡のインキュベーションチャンバーの電源を入れ、30 °Cで平衡状態にします。同じ自動希釈プロトコルを用いて、培養液を再度、600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が0.01〜0.02になるまで希釈します。希釈プレートを金属製フリーザーシールで密閉し、プレートを氷水に浮かべた状態で、氷浴中で30秒間超音波処理します。4枚の96ウェル平底プレートに、1、2、3、4とラベルを貼ります。希釈プレートから各超音波処理済み培養液150 µLを、以下のパターンに従って平底プレートに分注します。プレート1のウェルC4からF9へ、ウェルA1からD6の内容物を移します。ウェルA7からD12をプレート2のウェルC4からF9へ。ウェルE1からH6をプレート3のウェルC4からF9へ。そしてウェルE7からH12をプレート4のウェルC4からF9へ移します。この手順を開始するには、アガローススライドをスライドチャンバーに正しく設置します。次に、96ウェル平底プレートを、クアドラントの順にテーブル上に配置します。左から右へ、プレート1、2、3、4の順に並べてください。4つの空のチップボックスにチップを配置し、各ボックスの内側24ウェルにチップが入った状態にします。5つ目のボックスでは、位置C10にチップを、位置A1、A12、H1、H12に先端を切断したチップを配置します。これら4つの切断済みチップが、チッププレートクランプを安定させる役割を果たします。ロボット制御スポッティングプログラムの開始位置に最初のチップパンチを配置し、後で原点座標を合わせるために使用するアガロースに穴を開けます。液体ハンドリングロボットにプレート1を設置し、第1象限のスポッティングを行います。蓋を取り外し、スポッティングプログラムを続行します。すべてのスポットが存在することを確認します。使用済みのチップをバイオハザード容器に廃棄し、ロボットに新しいチップを装着してください。スポットが直径約1mmまで乾燥するまで約30秒間待ち、その後プログラムを続行します。プレート1をプレート2に交換し、スポッティングプログラムを継続します。4つの象限すべてにスポッティングが完了し、スポットが乾燥したら、スライドチャンバーのカバーを戻して装置を裏返します。スライドチャンバーの上側にガラススライドを配置します。まず、スライドチャンバーを顕微鏡にセットします。タイムラプス顕微鏡観察は、カスタム設計のスクリプトを実行して行います。シャッターをクリックして透過光シャッターを開き、続いてフォーカスボタンを押して高速カメラ撮影を開始します。「Go Origin」をクリックし、ステージを移動してアガロースに打ち込まれたオリジンマークを探します。次に、わずかに右へ移動し、エリアE7にスポットされた細胞にピントを合わせます。再びオリジンのパンチ位置に戻り、視野の中心に合わせます。「Set」ボタンを押して、この値をオリジンに設定します。ポジションH18へ移動し、その位置に最も近い六角ネジを使用してピントを合わせます。次に、ポジションL7へ移動し、その場所に最も近い六角ネジを使用してフォーカスを調整します。最後に、ポジションE7へ移動し、同様に最も近い六角ネジを使用してフォーカスを調整します。中心部および端のスポットE12、H12、L12でフォーカスを確認し、z値で示されるフォーカスのz値がオートフォーカス範囲のプラスマイナスを超えている場合は、オートフォーカス範囲を調整してください。「Reset」ボタンを押し、次に「ODELAY」を押します。データの保存先ディレクトリを選択してください。顕微鏡は、プログラムが終了されるまで、または48時間にわたってデータを収集します。これらの代表的なタイムラプス画像は、スポット後の0時間、3時間、6時間、および9時間における、固形培地上の酵母細胞の増殖を示しています。ここでは、タイムラプス画像の処理後における2つの酵母株を比較した代表的なデータセットを示します。倍加時間が比較的均一であることは、アガローススライドが適切に作成されていたことを反映していますが、一方でラグタイムには大きなばらつきがあり、これはオートフォーカスの設定が最適でなかったことによるものです。ここでは、すべての倍加時間が良好に重複し、ラグタイムが一貫している、より整合性の高いデータセットを示します。習得すれば、適切に実施することでODELAYのセットアップは3〜4時間で完了できます。再現性のあるODELAY測定において最も重要なステップは、培地を一定に調製することと、スライドを分離する際に培地を機械的に変形させないことです。ODELAYは非常に感度の高いアッセイです。例えば、一般的に用いられるスポットアッセイでは増殖不全を確認するために酵母を37°Cで培養する必要がありますが、ODELAYでは温度感受性の酵母株における増殖不全を室温で観察することが可能です。ODELAYは酵母を用いて開発されましたが、この手法は病原体を含むあらゆるコロニー形成生物に適用可能であり、微生物の挙動を理解するために広範な環境的および遺伝的条件を探索することができます。このビデオを視聴することで、固体培地上でコロニーを形成する単細胞微生物の増殖表現型を測定するためのODELAYの実施方法について、十分な理解を得ることができます。微生物を扱う際は危険が伴う場合があるため、研究対象の生物に適した個人用保護具を着用するなど、常に予防措置を講じてください。

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生物学

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ここでは、核分裂細胞および発芽酵母細胞の蛍光顕微鏡画像における脂質液滴の自動検出および定量的記述のMATLAB実装を提示する。...

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

微生物工学の「設計構築テスト」サイクルのボトルネックは、株の機能画面を実行できる速度です。液滴ベースのRNAシーケンシングを利用した実験ごとに数百~数千個の酵母細胞に適用される菌株スクリーニングのハイスループット法について述べています。...

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成長と遺伝子発現の不均一性を測定するマイクロコロニーのハイスループットライブイメージング

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

学ぶODELAY法を用いて酵母の増殖表現型を定量化する方法。タイムラプス顕微鏡で個々の細胞からコロニー形成まで観察し、遺伝的撹乱や薬物相互作用の影響を解析できます。

ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

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