ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

ODELAYの全体的な目的は、コロニーへと増殖する個々の細胞の増殖表現型を高スループットに測定することです。この手法は、遺伝的摂動や薬剤相互作用がコロニー形成微生物の増殖表現型に及ぼす影響など、微生物学、遺伝学、システム生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。ODELAYの主な利点は、研究者が多数の個体間における集団の不均一性を直接観察し、定量化できることです。

アガロース成形体を組み立てる前に、アクリル製の型を70% ethanolで洗浄し、送風乾燥させます。底板が3枚と直立板が2枚あります。アガロース成形体の組み立てを開始するには、3枚の底板を取り、2枚の同一の部品で3枚目の部品を挟むように組み立てます。

2つの小型バインダークリップを使用して、ベースパーツの両側を固定します。レーザーカーブが正しく配置されていることを確認しながら、直立パーツを型に入れます。洗浄して乾燥させたガラススライドを型の上に置き、その状態で固定しながら、反対側に2枚目のガラススライドを配置します。

アセンブリを大きめのバインダークリップで固定します。2枚のスライドの両方を大きめのバインダークリップで固定し、各上のクリップがアクリルと重なるようにガラススライドに接触していることを確認してください。組み立てた型に溶融アガーを注入する前に、型の内側に約70 µLの溶融アガー培地をピペッティングし、端が封止されていることを確認します。

溶融したアガロースをモールドの縁に沿ってゆっくりとピペッティングし、内部に気泡が入らないようにモールドを満たします。モールドを満たした後、周囲温度約23 degrees Celsiusで40-60分間冷却させます。次のステップはモールドの分離です。

まず、下のバインダークリップを取り外します。次に、3枚のプレートが重ねられた金型の底部分を取り外します。スライドを圧縮して固定したまま、バインダークリップを慎重に取り外します。

モールドの青いドットがある面を上にして、ベンチトップの端に置きます。両方の親指をアクリルの下に、人差し指をモールドの内側の縁に近い上部に添えます。そして、モールドスペーサーの下端を支点にして回転させるように、親指でモールドをゆっくりと慎重に押し上げます。一定の圧力をかけながら、徐々に力を強めてください。

上部のガラスがモールドスペーサーを覆っているラインに沿って、亀裂と気泡が現れます。最初の亀裂ラインを確認した後、両方の親指で押し上げ続け、一定の圧力をかけます。すると、アガーがガラスから離れ始めます。

引き続き、型を上に回転させます。ガラスが完全に離れたら、それを掴んで型から完全に取り出します。次に、同様の動作でもう一方の型の部品を取り外し、アガーを動かさずに作品を上に持ち上げて取り出します。

スライドを、底に滅菌済みの高純度水を少量入れた滅菌チップボックスに入れます。ボックスを閉じ、4°Cで一晩保存して翌日に使用します。テキストプロトコルに記載されている通り、96ウェルプレートで菌株を調製して、この手順を開始してください。

プレートリーダーを用いて、各培養液の600 nmにおける吸光度を測定します。次に、自動希釈プロトコルを使用して、プレート内の培養液を600 nmでの吸光度が約0.1になるように希釈します。希釈プログラムの設定が完了したら、デッキレイアウトの指示に従って、プレート、チューブ、およびチップを液体ハンドリングロボットのデッキにセットしてください。

再生ボタンをクリックして希釈プログラムを実行します。適切な本数の50 µLチップと300 µLチップを選択してください。希釈が完了したら、ロボットから希釈プレートを取り出し、プレートの乾燥を防ぐため湿度を維持しながら、30 °Cで5〜6時間培養します。

培養プレートのインキュベーションが完了する約1〜2時間前に、顕微鏡のインキュベーションチャンバーの電源を入れ、30 °Cで平衡状態にします。同じ自動希釈プロトコルを用いて、培養液を再度、600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が0.01〜0.02になるまで希釈します。希釈プレートを金属製フリーザーシールで密閉し、プレートを氷水に浮かべた状態で、氷浴中で30秒間超音波処理します。

4枚の96ウェル平底プレートに、1、2、3、4とラベルを貼ります。希釈プレートから各超音波処理済み培養液150 µLを、以下のパターンに従って平底プレートに分注します。プレート1のウェルC4からF9へ、ウェルA1からD6の内容物を移します。

ウェルA7からD12をプレート2のウェルC4からF9へ。ウェルE1からH6をプレート3のウェルC4からF9へ。そしてウェルE7からH12をプレート4のウェルC4からF9へ移します。

この手順を開始するには、アガローススライドをスライドチャンバーに正しく設置します。次に、96ウェル平底プレートを、クアドラントの順にテーブル上に配置します。左から右へ、プレート1、2、3、4の順に並べてください。

4つの空のチップボックスにチップを配置し、各ボックスの内側24ウェルにチップが入った状態にします。5つ目のボックスでは、位置C10にチップを、位置A1、A12、H1、H12に先端を切断したチップを配置します。これら4つの切断済みチップが、チッププレートクランプを安定させる役割を果たします。

ロボット制御スポッティングプログラムの開始位置に最初のチップパンチを配置し、後で原点座標を合わせるために使用するアガロースに穴を開けます。液体ハンドリングロボットにプレート1を設置し、第1象限のスポッティングを行います。蓋を取り外し、スポッティングプログラムを続行します。

すべてのスポットが存在することを確認します。使用済みのチップをバイオハザード容器に廃棄し、ロボットに新しいチップを装着してください。スポットが直径約1mmまで乾燥するまで約30秒間待ち、その後プログラムを続行します。

プレート1をプレート2に交換し、スポッティングプログラムを継続します。4つの象限すべてにスポッティングが完了し、スポットが乾燥したら、スライドチャンバーのカバーを戻して装置を裏返します。スライドチャンバーの上側にガラススライドを配置します。

まず、スライドチャンバーを顕微鏡にセットします。タイムラプス顕微鏡観察は、カスタム設計のスクリプトを実行して行います。シャッターをクリックして透過光シャッターを開き、続いてフォーカスボタンを押して高速カメラ撮影を開始します。

「Go Origin」をクリックし、ステージを移動してアガロースに打ち込まれたオリジンマークを探します。次に、わずかに右へ移動し、エリアE7にスポットされた細胞にピントを合わせます。再びオリジンのパンチ位置に戻り、視野の中心に合わせます。「Set」ボタンを押して、この値をオリジンに設定します。ポジションH18へ移動し、その位置に最も近い六角ネジを使用してピントを合わせます。

次に、ポジションL7へ移動し、その場所に最も近い六角ネジを使用してフォーカスを調整します。最後に、ポジションE7へ移動し、同様に最も近い六角ネジを使用してフォーカスを調整します。中心部および端のスポットE12、H12、L12でフォーカスを確認し、z値で示されるフォーカスのz値がオートフォーカス範囲のプラスマイナスを超えている場合は、オートフォーカス範囲を調整してください。

「Reset」ボタンを押し、次に「ODELAY」を押します。データの保存先ディレクトリを選択してください。顕微鏡は、プログラムが終了されるまで、または48時間にわたってデータを収集します。

これらの代表的なタイムラプス画像は、スポット後の0時間、3時間、6時間、および9時間における、固形培地上の酵母細胞の増殖を示しています。ここでは、タイムラプス画像の処理後における2つの酵母株を比較した代表的なデータセットを示します。倍加時間が比較的均一であることは、アガローススライドが適切に作成されていたことを反映していますが、一方でラグタイムには大きなばらつきがあり、これはオートフォーカスの設定が最適でなかったことによるものです。

ここでは、すべての倍加時間が良好に重複し、ラグタイムが一貫している、より整合性の高いデータセットを示します。習得すれば、適切に実施することでODELAYのセットアップは3〜4時間で完了できます。再現性のあるODELAY測定において最も重要なステップは、培地を一定に調製することと、スライドを分離する際に培地を機械的に変形させないことです。

ODELAYは非常に感度の高いアッセイです。例えば、一般的に用いられるスポットアッセイでは増殖不全を確認するために酵母を37°Cで培養する必要がありますが、ODELAYでは温度感受性の酵母株における増殖不全を室温で観察することが可能です。ODELAYは酵母を用いて開発されましたが、この手法は病原体を含むあらゆるコロニー形成生物に適用可能であり、微生物の挙動を理解するために広範な環境的および遺伝的条件を探索することができます。

このビデオを視聴することで、固体培地上でコロニーを形成する単細胞微生物の増殖表現型を測定するためのODELAYの実施方法について、十分な理解を得ることができます。微生物を扱う際は危険が伴う場合があるため、研究対象の生物に適した個人用保護具を着用するなど、常に予防措置を講じてください。