ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

ODELAYの全体的な目標は、ハイスループットな方法でコロニーに成長する個々の細胞の成長表現型を測定することです。この方法は、コロニー形成微生物の成長表現型に対する遺伝的摂動や薬物相互作用の影響など、微生物学、遺伝学、およびシステム生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。ODELAYの主な利点は、研究者が多数の個体間の集団の不均一性を直接観察し、定量化できることです。

寒天型を組み立てる前に、アクリル型を70%エタノールで洗浄し、強制空気で乾燥させます。底部が3枚、直立部分が2枚あります。寒天型の組み立てを開始するには、底の3つのピースを取り、2つの同一のピースが3番目のピースを挟むように組み立てます。

2つの小さなバインダークリップを使用してclamp 両側のベースピース。アップライトを金型に配置し、レーザーカーブが正しく配置されていることを確認します。洗浄して乾燥させたスライドガラスを型に置き、反対側に2枚目のスライドガラスを置きながら所定の位置に保持します。

clamp より大きなバインダークリップでアセンブリを固定します。大きなバインダークリップで両方のスライドを固定し、各上部バインダークリップがアクリルに重なるスライドガラスに接触していることを確認します。組み立てた金型に溶融寒天を充填する前に、金型の内側に沿って約70マイクロリットルの溶融寒天培地をピペッティングして、端が密封されていることを確認してください。

内部に気泡を閉じ込めないように、溶融した寒天を金型の端に沿ってゆっくりとピペッティングして、金型を充填します。金型が充填された後、摂氏約23度の周囲温度で40〜60分間冷却します。次のステップは金型の分離です。

下部のバインダークリップを取り外すことから始めます。次に、3つのピースを挟んだモールドの底の部分を取り外します。スライドを圧縮して保持し、バインダークリップを慎重に取り外します。

青い点の付いた金型の側面が上を向くように、金型をベンチトップの端に置きます。両方の親指をアクリルの下に置き、最初の指を上部に置き、型スペーサーを下端を中心に回転させるように、親指を型に対してゆっくりと慎重に押し上げます。一定ですがゆっくりと増加する圧力をかけます。

上部のガラスが金型スペーサーを覆う線に沿って、破損と気泡が発生するはずです。最初のブレークラインを確認した後、両手の親指で押し上げ続け、一定の圧力をかけます。寒天がガラスから離れ始めるはずです。

引き続き金型を上に回転させます。ガラスが完全に自由になったら、それをつかんで型から完全に取り出します。次に、同様の動きを使用して他の金型を取り外し、寒天を動かさずにピースを持ち上げて解放します。

スライドを滅菌チップボックスに入れ、底に滅菌済みの高純度の水を入れます。箱を閉じて、摂氏4度で一晩保管し、翌日使用します。この手順は、テキストプロトコールに記載されているように、96ウェルプレートで菌株を調製することから開始します。

プレートリーダーを使用して、各培養物の600ナノメートルの光学密度を測定します。次に、自動希釈プロトコルを使用して、プレート内の培養物を600ナノメートルの約0.1の光学密度に希釈します。希釈プログラムが設定されると、デッキレイアウトに示されているように、ロードプレート、チューブ、およびチップをリキッドハンドリングロボットのデッキに取り付けます。

再生ボタンをクリックして、希釈プログラムを実行します。正しい数の50マイクロリットルチップと正しい数の300マイクロリットルチップを選択します。希釈が完了したら、希釈プレートをロボットから取り外し、プレートが乾燥しないように湿度を30°Cに保ちながらプレートを培養します。

培養プレートのインキュベーションが完了する約1〜2時間前に、顕微鏡のインキュベーションチャンバーをオンにし、摂氏30度で平衡化させます。同じ自動希釈プロトコルを使用して、培養物を600ナノメートルの0.01〜0.02の光学密度に再度希釈します。希釈プレートを金属製冷凍シールで覆い、プレートを氷水に浮かべた状態で氷浴で30秒間超音波処理します。

4つの96ウェルフラットボトムプレートに1、2、3、4のラベルを付けます。このパターンに従って、各超音波処理された培養物の150マイクロリットルを希釈プレートから平底プレートに移します。ウェル A1 から D6 をプレート 1 のウェル C4 から F9 に取り付けます。

ウェル A7 から D12 からプレート 2 のウェル C4 から F9 へ。ウェルE1からH6をプレート3のウェルC4からF9に。そして、E7 から H12 の井戸をプレート 4 の C4 から F9 に送り込みます。

この手順を開始するには、アガローススライドをスライドチャンバーに正しく配置します。次に、96ウェルフラットボトムプレートを象限の順にテーブルに置きます。プレート1、2、3、4は左から右へ。

4つの空のチップボックスにチップをレイアウトして、各チップボックスの内側の24ウェルがチップで占められるようにします。5 番目のボックスで、チップを C10 の位置に置き、チップの端を切り取ったチップを A1、A12、H1、H12 の位置に置きます。これらの4つのカットオフチップは、チッププレートクランプの安定性を提供します。

最初の先端パンチをロボット制御スポッティングプログラムの開始位置に配置して、後で原点座標を位置合わせするために使用するアガロースに穴を開けます。プレート1をリキッドハンドリングロボットに置き、最初の象限を見つけます。蓋を取り外して、スポッティングプログラムを続行します。

すべてのスポットが存在することを確認します。使用済みのチップをバイオハザードコンテナに空にし、新しいチップをロボットに置きます。スポットが直径約1ミリメートルに乾くまで約30秒待ってから、プログラムを続けます。

プレート1をプレート2に交換し、スポッティングプログラムを続行します。4つの象限すべてが発見され、スポットが乾いたら、スライドチャンバーカバーを交換し、装置を裏返します。スライドチャンバーの上面にスライドガラスを置きます。

まず、スライドチャンバーを顕微鏡にロードします。タイムラプス顕微鏡は、カスタム設計のスクリプトを実行することによって実行されます。シャッターをクリックして透過光シャッターを開き、フォーカスボタンで高いカメラレートを開始します。

「Go Origin」をクリックし、ステージを動かして寒天に打ち抜かれたオリジンマークを見つけ、少し右に移動してエリアE7で発見された細胞に焦点を合わせます。原点パンチに戻り、視野の中央に配置します。「設定」ボタンを押して、原点をこの値に設定します。H18の位置に移動し、その位置に最も近い六角ネジを使用して焦点を合わせます。

次に、L7の位置に移動し、その位置に最も近い六角ネジを使用して焦点を合わせます。最後に、E7の位置に移動し、その位置に最も近い六角ネジを使用して焦点を合わせます。スポットE12、H12、L12の中央と端のフォーカスを確認し、z値で示されるフォーカスz値がオートフォーカス範囲よりも大きい場合は、オートフォーカス範囲を調整します。

「リセット」ボタンを押してから、ODELAYを押します。データを保存するディレクトリを選択します。顕微鏡は、48時間またはプログラムが終了するまでデータを収集します。

これらの代表的なタイムラプス画像は、スポッティング後0時間、3時間後、6時間後、9時間後に固体培地で増殖する酵母細胞を示しています。ここに示されているのは、タイムラプス画像を処理した後の2つの酵母株を比較した代表的なデータセットです。比較的均一な倍増時間は、十分に準備されたアガローススライドを反映していますが、オートフォーカス設定が最適ではないため、遅延時間はかなり異なります。

ここでは、より一貫性のあるデータ セットが示されており、すべての倍増時間がうまく重なり、遅延時間が一貫しているように見えます。一度マスターすれば、ODELAYのセットアップは適切に行えば3〜4時間で完了します。再現性のあるODELAY測定のための最も重要なステップは、メディアを一貫して準備し、スライドを分離する際にメディアが機械的に変形しないようにすることです。

ODELAYは非常に感度の高いアッセイです。例えば、一般的に使用されるスポットベースのアッセイでは、成長欠陥を明らかにするために37°Cで酵母を培養する必要がある室温で、温度感受性酵母株の増殖欠陥を観察することができます。ODELAYは酵母で開発されましたが、この方法は病原体を含むあらゆるコロニー形成生物に適用でき、微生物の振る舞いを理解するために幅広い環境および遺伝的条件を探索します。

このビデオを見れば、固体培地上にコロニーを形成する単細胞微生物の成長表現型を測定するためのODELAYの実行方法について十分に理解できるはずです。微生物を扱うことは危険である可能性があり、研究対象の生物に適した個人用保護具を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。