出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析

この手順の全体的な目標は、増殖する単一酵母細胞の蛍光動画を取得し、各細胞のレポーター発現時系列を抽出することです。これは、まずマイクロ流体チャンバー内で細胞の単層を培養することによって達成されます。2番目のステップは、1人以上のレポーターに対してタイムラプス蛍光顕微鏡検査を行うことです。

次に、グラフトソフトウェアパッケージを使用してムービーを処理し、細胞を経時的に追跡および測定します。最後のステップは、細胞の測定値と系統の割り当てを分析し、各細胞全体のレポーター発現時系列をエクスポートすることです。最終的には、発現時系列から推測される瞬間的な転写速度を使用して、細胞周期全体と転写因子レベルの変化に対する転写の変化を示します。

この方法は、活性転写因子の突然の追加または減算に対して、さまざまなプロモーターがどれだけ迅速に反応するかなど、遺伝子制御分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この応答は細胞集団全体でどの程度変動し、形態や細胞周期の段階などのさまざまな細胞特性は応答にどのように影響しますか?さらに、この方法は、遺伝子発現に対する活性転写因子の複数の追加および減算の影響を調べることができます。

テキストプロトコルに記載されているように、マイクロ流体デバイスへのロードに適した密度で、栄養豊富で安定した状態で増殖する酵母細胞を調製します。次に、オニキス灌流システムを使用して出荷溶液を除去した後、ウェルを滅菌水ですすいで、細胞ASICからY zero four Cマイクロ流体培養プレートを準備します。オニキス灌流システムを使用してウェル1から6までの水を6 PSIで5分間流し、チャネルを洗い流し、次にローディングウェル8から6 PSIで10秒間流れます。すべてのウェルから水を取り除き、インレットウェルで250マイクロリットルのSC培地、1〜6マイクロリットル、および50マイクロリットルの調製した細胞培養液と細胞ローディングで交換します。

ウェル8は、オニキスマニホールドをプレートに密封し、インレットウェルズ1から6まで6PSIで2分間流れることにより、チャネルと培養チャンバーのプライミングを開始します。これに続いて、開始メディアを少なくとも5分間保持するインレットウェルのみから流れます。6 PSIの流れで、これは、顕微鏡のステップがプレートをステージマウントにテープで固定して、データ解析中の細胞追跡を改善するために実験全体でシフトを防ぐまで、テキストプロトコルに記載されている顕微鏡の準備後、対物レンズに数滴の浸漬液を置き、マイクロ流体デバイスをしっかりと取り付けます。

倒立顕微鏡の段階で、埋め込まれた位置マーカーの1つを使用して、最初の培養チャンバーの左端の3分の1に焦点を合わせます。メディアインレットウェルからの流れをオフにし、セルローディングウェル8から6PSIで5秒間に流れます。ステージを動かして、培養室内の細胞を探します。

目的の細胞密度が達成されるまで、ローディングフローの時間と圧力を増やしますが、新鮮な培地がチャンバーに入る左端のバリアが過負荷になって詰まることは避けてください。開始メディアが入ったメディアインレットウェルから6PSIで流れ始めます。Metamorphまたはその他の顕微鏡自動化および制御ソフトウェア。

多次元集録を設定して、複数のステージ位置で複数の画像を経時的に撮影します。タイムポイントの数とそれらの間の間隔を設定します。次に、約10個のセルを持つ複数のステージ位置を選択します。各。

各ステージ位置と各時点で、プログラムがmetamorphs組み込みオートフォーカスメソッドを使用して透過光明視野画像に焦点を合わせるようにアクイジションを設定し、各ステージの開始時にカスタムライティングジャーナルとしてオートフォーカスを実装します。位置により、フォーカスの精度をより細かく制御できます。また、焦点面に対してプラス1ミクロンの明視野画像を取得し、焦点面に対してマイナス4ミクロンの明視野焦点外画像を取得するようにプログラムを設定します。

カスタムメイドのジャーナルを使用して、必要に応じて画像間でフォーカスを変更します。最後に、プログラムを設定します。焦点面で蛍光レポーターごとに1つのグレースケール画像を取得します。

写真の漂白を最小限に抑えて迅速に取得するために最適化された設定を使用します。オニキス制御ソフトウェアで実験用のフロープログラムを準備します。次に、MetamorphのアクイジションプログラムとOnyx制御ソフトウェアのフロープログラムを同時に開始します。

MATLAB でフォーマット データ M ファイルを実行して、データ入力、グラフィカル ユーザー インターフェイス、または GUI を開きます。上部で、画像ファイルを含むフォルダーを指定または参照してデータディレクトリを設定し、グーイを使用して実験で記録されたデータタイプと画像ファイルを指定します。テキストプロトコルで説明されているセグメンテーションパラメータの選択に進みます。

明視野画像のセグメンテーションに適切なパラメータを選択することは難しく、結果として得られる時系列データの品質に大きな影響を与えます。私たちは、セグメント化されていない領域よりもセグメント化が優先されるすべての細胞領域を特定することに焦点を当てています。目視データ検査では、セグメント化された領域をマージしてセル全体の領域を形成することができますが、セグメント化された領域を後で分割することはできません。

さまざまなセグメンテーションパラメータを設定し、テスト成功をクリックしてセグメンテーション品質をテストします。セグメント化された領域は緑色で、マゼンタの境界線が表示されます。セグメンテーションが満足のいくものである場合は、スライダーを使用して映画内の複数の時点を確認してください。

「完了」を選択して、セグメンテーション・パラメーターをフォーマット・データ GUI に戻します。テキストに記載されているようにカラーパラメータを選択した後、自動しきい値ボタンを押すと、しきい値が自動的に決定されます。tzuの方法を使用すると、画像はしきい値を超えて保存された領域を強調表示します。

しきい値は、編集ボックスを使用して手動で調整できます。スクロールバーを使用して、しきい値がすべての時点に適していることを確認します。満足したら、プッシュ完了

しきい値をフォーマット・データ GUI に戻すには、add と segment を押します。カラーマスクを作成するには、format dataを押して画像ファイルを読み込み、データを処理して、指定したフォルダにドットマットファイルを作成します。このファイルは、プロセス時系列GUIへの入力として機能します。

MATLAB でプロセス時系列 M ファイルを実行して、トラッキング GUI を開きます。GUIを開いた後、最初にチャンバーの高さを設定します。これは、細胞が閉じ込められているチャンバーの高さを示しています。

これは、細胞領域の長軸と短軸に基づいて細胞体積を3D楕円体として近似する際の制約として使用されます。次に、ピクセルあたりのマイクロメートルを設定します。これは、画像内のピクセルからマイクロメートルまでの距離をキャリブレーションするために使用される変換係数であり、断面積と体積をそれぞれ正方形マイクロメートルと立方マイクロメートルでキャリブレーションできます。

次に、フィルターパネルを使用して、マスク内のジャンク領域を除外するための最小パラメーターと最大パラメーターを設定します。領域は、ピクセル単位の領域領域です。ECCは離心率であり、値がゼロに近づくにつれてより循環的になります。

また、SFは形状係数であり、値がファイルに近づくにつれてより円形になり、ファイル入力出力パネルに画像をロードし、フォーマットデータGUIによって出力される目的のドットマットデータファイルを選択します。領域マスクは各カラーチャネルに適用され、さまざまな測定が行われます。データファイルは、テキストで説明されているようにトラックセルパラメータを選択した後に保存されます。

トラックセルをクリックして、リージョンOIDを使用して1つのフレームから次のフレームにリージョンを追跡し、新しく出現するつぼみの系統を割り当て、データを保存するには、必要に応じてポップアップウィンドウのパラメーターを変更します。系統は、推定される芽と潜在的な母親との間の距離を最小にすることによって自動的に割り当てられます。各フレームで。

選択したセル情報パネルの上にあるボタンをクリックし、セグメンテーションが不十分な領域や、テキストプロトコルで説明されているさまざまなねばねばしたツールやショートカットキーを使用してIDまたは系統の割り当ての間違いをキュレーションし、データを適切にキュレーションします。セグメント化されすぎた領域をマージし、セル全体をキャプチャしていない領域を削除し、母芽の関係が適切に割り当てられていることを確認します。また、領域をマージして緑色の ID を削除します。

ID の固定、リージョンの母親への割り当て、母親の割り当てなし、またはリージョンの削除。芽のデータは、最終的な最終分析中に母親の芽のデータに追加されるためです。芽の領域をその母にマージしないでください。

最後に関心のある時間までの各フレームのデータを視覚的に検査します。時系列全体で必須ではありません。後のフレームを使用しない場合は、すべての蛍光チャネルのインタレストデータの期間にわたってすべての細胞領域を検査し、それらが時間の経過とともにどのように変化するかを出力する準備ができたら、必ず変更を保存してください。

時系列解析をプッシュして、セル全体の時系列を経時的に解析します。細胞周期情報を計算し、導関数を取ります。ウィンドウが開き、関心のある測定値の選択と分析パラメータの入力が可能になります。

デフォルトのスムージングパラメータと細胞周期割り当てパラメータは、5分間隔で画像化されたハプロ株と二倍体株では適切に機能しますが、最良の結果を得るにはこれらを変更する必要がある場合があります。すべてのパラメータが設定されると、テキストプロトコルで説明されているように、単一細胞の時系列データをエクスポートするために分析を選択します、成功裏に実行および分析された実験は、現実的に割り当てられたが、DH1プロモーターの構成によって駆動されるイアン蛍光タンパク質またはCFPの統合コピーを発現するハロー酵母株の出現および分裂時間を持つ単一全細胞のほぼ連続時系列を生成します。時系列解析から、経時的な全細胞測定値が得られました。

明視野画像は、分節化された母細胞を青色で、その芽を緑色で示しています。赤で囲まれた連続した全細胞では、体積と発現の両方について細胞周期への依存性が浮かび上がります。ここで、格子領域は、細胞がSG 2 Mにあり、芽が出芽し、G1からSへの出芽が白から灰色に遷移するときを示しています。

陰影と細胞分裂は、芽形成後の灰色から白色の陰影への1遷移のMからGで発生します。総総量は以前よりも急速に増加しますが、タンパク質濃度または平均強度がわずかに減少する一方で出現します。結合された統合タンパク質の上昇も、母領域のみと比較して出芽後に加速します。

これらの結果は、芽の寄与を細胞全体の測定に適切に組み込むことの重要性を示しており、適切な芽形成と分裂時間の割り当ての必要性を強調しています。微分された時系列は、瞬間的な相対的なmRNAレベルと転写速度を計算するために使用でき、どちらも出芽後に安定した時間を生成する能力が増加する。測定時系列の導関数は、テキストプロトコルに記載されている切り替え可能な発現システムを使用した速度論的研究にも役立ちます。

時系列解析では、転写因子がいつ核に局在するのか、標的遺伝子がいつ開始および停止するのかがわかります。ここに示されている転写は、切り替え可能なYFP融合PHO 4 Tet R trans activatorを持つ細胞の示された4つの取得チャネルからの顕微鏡写真です。トランス活性化因子は、低リン酸に応答してRFPで標識された核に局在し、7つのX Tet OプロモーターCFPレポーターの発現を促進します。

推定される転写速度は、平均してシングルセルレベルで局在化によって変化します。この手順に続いて、シングルセルの多次元時系列データの他の分析を実行して、発現が集団間で経時的にどのように変化するかなど、追加の質問に答えることができますか?外因性変動の影響は、何世代にもわたって受け継がれますか?

遺伝子活性化動態は再活性化時に変化しますか?細胞周期は役割を果たしているのか、および単一細胞の遺伝子発現成長と系統の軌跡を必要とする他の多くの問題