Name: 出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 1 s
Description: 学ぶ 出芽酵母の蛍光タイムラプス顕微鏡法によるシングルセルダイナミクス解析。マイクロ流体チャンバーを用いた培養と自動追跡ソフトウェアで、細胞周期と転写レート変化を詳細に評価できます。

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我々は、ソフトウェア上のコメントにエミリージャクソン、ジョシュアZeidman、そしてニコラスレンに感謝します。この作品はGM95733（NM）に、BBBE 103316とMITスタートアップ資金（NMへ）によって賄われていた。

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

上記のプロトコルでは、マイクロ流体、またはソフトウェア開発の限られた経験を有する蛍光時系列データを取得して分析するための簡単​​な方法が記載されている。バーテン追跡および系統の割り当て;、関連するセルサイズおよび発現測定値を抽出し、それは1つは、単一の酵母細胞の経時蛍光ムービーを取得することができ、市販のマイクロ流体培養装置を用いて、時間と汎用性の高いグラフィカルユーザ上で細胞全体の挙動を解析するインタフェース（GUI）。実験、セグメンテーション、およびトラッキングのステップは様々な方法以前に11,13,14でアプローチしてきたが、上記の手順は、生物学コミュニティの広いサブセットにこれらの技術をよりアクセシブルにするために設計されています。上記の手順は、特定のマイクロ流体培養装置用に最適化されている間、全体的な分析がより安価でカスタマイズ可能になる既製のマイクロ流体培養技術など同様のデバイスに適合させることができる。 Fundamentally、我々は採用セグメンテーションと地域の測定アルゴリズムは、既存の方法13,14に似ていますが、移植片ソフトウェアは視覚的に地域の追跡および系統の割り当て...

遺伝子発現の単一細胞解析は遺伝子調節の多くの側面の我々の理解を進めたた。フローサイトメトリーまたは顕微鏡を用いて蛍光レポーター発現の静的なスナップショットは、単一セルの発現の分布に有用な情報を提供するが、直接遺伝子発現動態を通知するために必要な時系列データの履歴と進化を欠いている。蛍光タイムラプス顕微鏡は、単一セルの測定とその歴史の両方を取得する手段を提供します。種々の実験および解析技術は、このような遺伝子調節機能洞察を付与する、蛍光レポーター発現の映画を取得し、定量化するために開発されている（概説1を参照）は、セル間のばらつき2,3、細菌persister形成4、転写として開始と伸長5、6,7を破裂転写、細胞周期依存性8,9、および遺伝10。しかし、OBTaining品質単一細胞蛍光時系列は、培養の重要な技術的課題に制御環境で、取得した蛍光映画のハイスループット定量化における細胞の単層を伴う。ここでは、Sの蛍光ムービーを取得し、分析するための手順を説明細胞培養装置の製造における、またはソフトウェア開発の経験のない必須（ 図1） セレビシエ 。 まず、我々は詳細例プロトコルを一つ以上の蛍光レポーターを表現する出芽酵母用蛍光時系列ムービーを生成する。カスタマイズされたマイクロ流体文化室が建設され、成功した以前に11-13採用されてきたけれども、我々はCellAsic（ヘイワード、カリフォルニア州）から市販のマイクロ流体デバイスを使用しています。システム閉じ込める単分子層の成長への細胞とは、灌流環境の継続的な制御が可能になります。我々は提示顕微鏡プロトコルはfluorescを取得するための簡単​​な手段です。単一の酵母細胞の蛍光類似動画データを得レンス出芽酵母の映画が、任意の修飾実験プロトコルは、（カスタマイズ培養装置、代替メディア条件等 ）置換されていてもよい。 次に、時系列データを抽出するためにグラフィカルユーザーインターフェース（GUI）系蛍光時系列の迅速分析（移植片）のためのGUIと呼ばれるMATLABのソフトウェアパッケージ（Mathworks社、ナティック、MA）を使用して、映画の分析を概説単一細胞のために。移植片は、細胞をセグメント化し、追跡すると蛍光強度と幾何学的な情報を抽出することで汎用性の高い、オープンソースのソフトウェアパッケージセルID 14と同様の機能を備えています。しかし、移植片は重要な追加機能を提供します。まず、セ​​グメンテーションとデータの正確性ではなく、分析後の外れ値の領域のトレースだけ統計ゲーを確認するために追跡の結果を簡単にインタラクティブな編集を提供しています。また、分析にautomaticallに延びyは出芽酵母の関心系統および細胞周期の点を指定する。母と娘は、2つの独立したセル領域を形成するために分割したときに決定することは、セル全体（任意の接続つぼみ含む母）細胞周期8全体の測定値を決定する非常に重要です。スイートは、これらのタスクを達成するために3つのモジュールから構成されています。最初のセグメントはセル領域に焦点を当てたとやり場の明視野像との対比に基づいており、ユーザが定義し、視覚的にセグメントパラメータをテストすることができます。第二トラック（クロッカーら IDLルーチンのブレアとデュフレーヌのMATLAB実装を使用して、で入手可能：。 <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> ）および時間を介して細胞領域を測定し、自動的に系統を割り当て、および目視検査を可能にする誤り訂正。シンプルなプロットのGUIは、クエリの単一セルのプロパティに含まれています。第三のモジュールは、つぼみ出現と分裂T​​Iを帰しMES、および全細胞時系列データならびにそれら第一及び第二の時間導関数を（9などを参照）を出力する。解析モジュールは、選択した統計ソフトウェアでその後の研究のためのスペース区切りのテキストフ​​ァイルとしてデータを出力します。したがって、パッケージは、ユーザがグラフィカル·インターフェースを介して高品質の時系列データを抽出することができます。我々は、細胞周期9の関数として単一出芽酵母細胞内でリアルタイムの転写率を推定するためにこの方法を使用している。モジュールは出芽酵母のために最適化されているが、パラメータや、必要に応じて、自由に利用可能なコードは、他の生物やイメージタイプに適合させることができる。セグメンテーション、トラッキング、系統割り当てアルゴリズムは、割り当てられたイメージングおよび問題の生物の種類に特異的であり得る。既存のアルゴリズムが置き換えられますが、それでもユーザーフレンドリーな目視検査とセグメンテーションの補正と常にoccuトラッキングエラーを可能にするGUIインタフェースを保持することができます任意のアルゴリズムでR。

<table><tbody><tr><td>Y04C 酵母灌流プレート</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX マイクロ流体灌流プラットフォーム</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プランアポクロマート 63x/1.40 オイル DIC 対物レンズ</td><td>ツァイス</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>カスケード II EMCCD カメラ</td><td>フォトメトリクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumen 200メタルハライドアークランプ</td><td>PRIOR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリプルバンドパスダイクロイックフィルターキューブと励起および発光フィルターセット</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>set #89006</td><td>YFP (Venus/Citrine)、CFP (Cerulean)、RFP (mCherry/tdTomato)</td></tr><tr><td>MAC 5000 コントローラーおよびフィルターホイール</td>に使用 <td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>64ビット版は32ビット版よりも大容量データファイルに対応</td></tr></tbody></table>

出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

蛍光タイムラプス顕微鏡は、単一細胞レベルでの多くの生物学的過程の研究の強力なツールとなっています。具体的には、遺伝子発現の時間依存性を示すムービーは、その規制のダイナミクスへの洞察を提供するが、単一細胞の蛍光ムービーを取得し、分析する多くの技術的課題がある。ここでは、そのようなデータを生成するために市販のマイクロ流体培養装置を用いた単純なプロトコル、およびMATLABベースのグラフィカル·ユーザー·インターフェース（GUI）系蛍光画像を定量化するためのソフトウェアパッケージを説明する。ソフトウェアセグメントとトラックセル、ユー​​ザが視覚的にデータのエラーをキュレーションすることができますし、自動的に系統と分裂時間を割り当てます。 GUIはさらに、全細胞トレースならびにそれら第一及び第二の時間導関数を生成するために時系列を解析する。ソフトウェアはS.のために設計されましたが出芽酵母は、そのモジュール性と多様性は、それトン許可する必要がありますいくつかの変更を他の細胞型を研究するためのプラットフォームとしての役割を果たす、Ø。

正常に実行され、分析実験は、現実的に割り当てられた芽の出現と分割時間を持つ単一の細胞全体のために主に連続的な時系列が得られます。例として、我々は表4、Y47の成長とグローバルな表現は、単一の細胞で、経時的に変化するかを観察するために構成的ADH1プロモーターによって駆動セルリアン蛍光タンパク質（CFP）（の統合されたコピーを表現ハプロイド酵母株と上記のプロトコルを実行）。我々は、時間をかけて全細胞（ 図7A）測定値を得るために時系列解析を実行し、および9に見られるように、細胞周期に依存して、ボリュームおよび発現の両方に現れる。芽の形成後、総合計体積（母+芽）タンパク質濃度、または平均強度ながら、（8,16と整合）芽の出現以前よりもより迅速に増加し、（ 図7Bおよび7C）わずかに減少。組み合わせた統合の上昇テッドタンパク質（この場合はボリュームをx濃度）また、出芽（ 図7D）の後に加速します。単独母領域（ 図7...

我々は、単一セルの時系列データを抽出するために蛍光成長酵母細胞の顕微鏡ムービー、GUIベースのソフトウェアパッケージを取得する単純なプロトコルを提示する。分析では、目視検査と追跡対象データの手動キュレーションと統合され自動化された系統と分裂時間の割り当てが含まれています。

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

この手順の全体的な目的は、成長する単一の酵母細胞の蛍光動画を取得し、各細胞のリポーター発現時系列データを抽出することです。これは、まずマイクロ流体チャンバー内で細胞を単層培養することで達成されます。次のステップとして、1つまたは複数のリポーターに対してタイムラプス蛍光顕微鏡観察を行います。次に、graftソフトウェアパッケージを用いて動画を処理し、細胞の経時的な追跡および測定を行います。最終ステップでは、細胞の測定値とリネージ割り当てを解析し、各細胞全体のレポーター発現時系列データをエクスポートします。最終的に、発現時系列から推測される瞬時転写速度を用いて、細胞周期における転写の変化および転写因子のレベル変化に応じた転写の変化を示します。この手法は、活性化転写因子の急激な添加または除去に対して、さまざまなプロモーターがどの程度の速さで反応するかなど、遺伝子調節分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この反応は細胞集団内でどの程度変動するのか、また、形態や細胞周期の段階を含むさまざまな細胞特性が反応にどのような影響を与えるのでしょうか。さらに、この手法を用いることで、活性化転写因子の複数回の添加および除去が遺伝子発現に及ぼす影響を調べることも可能です。テキストプロトコルに記載されている通り、マイクロ流体デバイスへのロードに適した密度で、栄養豊富な定常状態で増殖している酵母細胞を調製します。次に、Cell ASIC社のY04Cマイクロ流体培養プレートを準備します。輸送溶液を除去した後、ウェルを滅菌水で洗浄し、Onyx灌流システムを用いてウェル1から6に6 PSIで5分間水を流してチャネルをフラッシュし、その後、ロードウェル8から6 PSIで10秒間水を流します。すべてのウェルから水を取り除き、入口ウェル1から6に250 µLのSC培地を、細胞ロードウェルに調製した細胞培養液50 µLを注入します。次に、オニキス製マニホールドをプレートに密封し、インレットウェル1から6までを6 PSIで2分間流して、チャネルと培養チャンバーのプライミングを開始します。続いて、開始用培地が入ったインレットウェルのみから、少なくとも5分間流します。顕微鏡による観察ステップまで、これを6 PSIで継続的に流してください。データ解析時のセルトラッキング精度を向上させるため、実験中のずれを防ぐ目的で、プレートをステージマウントにテープで固定します。テキストプロトコルに従って顕微鏡の準備を行い、対物レンズに浸液を数滴滴下し、マイクロ流体デバイスをしっかりと固定してください。倒立顕微鏡のステージにおいて、組み込まれたポジションマーカーのいずれかを使用して、最初の培養チャンバーの左側3分の1に焦点を合わせます。培地入口ウェルからのフローを停止させ、細胞ロードウェル8からのフローを6 PSIで5秒間断続的に流します。ステージを移動させ、培養チャンバー内を確認して細胞を探します。目的の細胞密度に達するまで、ロード時の流量時間と圧力を上げますが、新鮮な培地がチャンバーに流入する最左端のバリアで過負荷や詰まりが生じないように注意してください。まず、開始培地を含む培地インレットウェルから6 PSIでフローを開始します。Metamorphまたはその他の顕微鏡自動化・制御ソフトウェアを使用してください。時間経過に伴い、複数のステージ位置で複数の画像を撮影するための多次元撮影を設定します。タイムポイントの数と、その間隔を設定してください。次に、それぞれに約10個の細胞が含まれるステージ位置をいくつか選択します。各ステージ位置および各タイムポイントにおいて、Metamorphsの内蔵オートフォーカス法を用いて透過光明視野像にフォーカスするように、取得設定を行います。オートフォーカスは、各ステージの開始時にカスタム記述されたジャーナルとして実装します。ポジション指定を行うことで、フォーカス精度をより高度に制御できます。また、焦点面から+1 µmで明視野像を取得し、焦点面から-4 µmでアウトオブフォーカスの明視野像を取得するようにプログラムを設定してください。必要に応じて画像間のフォーカスを切り替えるため、カスタム作成したジャーナルを使用します。最後に、プログラムを設定してください。焦点面において、各蛍光レポーターにつき1枚のグレースケール画像を取得します。光退色を最小限に抑え、迅速なデータ収集に最適化した設定を使用します。Onyxコントロールソフトウェアで、実験用のフロープログラムを準備します。その後、Metamorphでの収集プログラムとOnyxコントロールソフトウェアでのフロープログラムを同時に開始します。MATLABでformat data Mファイルを実行し、データ入力用のグラフィカルユーザーインターフェース（GUI）を開きます。上部で、画像ファイルが含まれているフォルダを指定または参照してデータディレクトリを設定し、次にGUIを使用して、実験で記録されたデータタイプと画像ファイルを指定します。その後、テキストプロトコルに記載されている通りにセグメンテーションパラメータを選択してください。明視野画像のセグメンテーションにおいて適切なパラメータを選択することは困難であり、得られるタイムシリーズデータの品質に大きな影響を与えます。ここでは、領域を過小セグメントするよりも過剰セグメントすることを優先し、すべての細胞領域を特定することに重点を置きます。視覚的なデータ確認において、過剰にセグメントされた領域は統合して1つの細胞領域にすることができますが、過小にセグメントされた領域を後から分割することはできません。さまざまなセグメンテーションパラメータを設定し、[test Successfully] をクリックしてセグメンテーションの品質をテストします。セグメント化された領域は、マゼンタの境界線を持つ緑色で表示されます。セグメンテーションに満足した後は、必ずスライダーを使用して、動画内の複数のタイムポイントを確認してください。doneを選択して、セグメンテーションパラメータをフォーマットデータGUIに戻します。本文の説明に従ってカラーパラメータを選択した後、auto thresholdボタンを押してしきい値を自動的に決定します。Tzu法を用いることで、しきい値以上の領域が画像上でハイライトされます。編集ボックスを使用して、しきい値を手動で調整できます。スクロールバーを使用して、すべてのタイムポイントに対してしきい値が適切であることを確認してください。問題がなければ、「done」を押してください。閾値をフォーマットデータGUIに戻すには、[add]と[segment]を押します。カラーマスクを作成するには、[format data]を押して画像ファイルを読み込み、データを処理して、指定したフォルダにdot matファイルを作成します。このファイルは、プロセスタイムシリーズGUIへの入力として使用されます。MATLABでprocess time series Mファイルを実行し、トラッキングGUIを開きます。GUIを開いた後、まずチャンバーの高さを設定してください。これは、細胞が捕捉されているチャンバーの高さを指定するものです。これは、細胞領域の長軸と短軸に基づき、細胞体積を3D楕円体として近似する際の制約として使用されます。次に、1ピクセルあたりのマイクロメートル数を設定します。これは、画像内のピクセル距離をマイクロメートルに校正するための変換係数であり、これにより断面積を平方マイクロメートルで、体積を立方マイクロメートルでそれぞれ校正することが可能になります。次に、フィルターパネルを使用して最小および最大パラメータを設定し、マスク内の不要な領域を除去します。「Area」はピクセル単位の領域面積です。「ECC」は離心率（eccentricity factor）であり、値が0に近づくほど円形になります。SFは形状係数であり、値が1に近づくほど円形に近いことを示します。ファイル入出力パネルで画像を読み込み、Format Data GUIによって出力された目的のdot matデータファイルを選択してください。各カラーチャンネルに領域マスクが適用され、さまざまな測定が行われます。その後、本文に記載されている通り「track cells」パラメータを選択して、データファイルを保存します。トラックセルをクリックして、領域OIDを用いてフレーム間の領域を追跡し、新しく出現した芽に系統を割り当てます。データを保存し、必要に応じてポップアップウィンドウ内のパラメータを変更してください。系統は、推定される芽と潜在的な親細胞との間の距離を最小化することで、各フレーム内で自動的に割り当てられます。選択された細胞情報パネルの上にあるボタンをクリックし、テキストプロトコルに記載されているさまざまなgooeyツールまたはショートカットキーを使用して、セグメンテーションが不適切な領域や、IDおよびリネージ割り当ての誤りを修正し、データを適切にキュレーションします。過剰にセグメント化された領域は統合し、細胞全体を捉えていない領域は削除し、母細胞と芽細胞の関係が正しく割り当てられているかを確認してください。また、領域を統合することで、緑色のIDをすべて排除してください。IDの修正、領域の母個体への割り当て、母個体の未割り当て、または領域の削除を行います。最終的な解析において、芽のデータは母個体のデータに統合されるため、芽の領域をその母個体にマージしないでください。関心のある最後の時間点まで、各フレームのデータを視覚的に確認してください。時系列全体を確認する必要はありません。後半のフレームを使用しない場合は、すべての蛍光チャネルにおいて、関心のある期間内のすべての細胞領域の確認が完了し、それらが時間経過とともにどのように変化するかを出力する準備が整った時点で、必ず変更内容を保存してください。「時系列解析（time series analysis）」を実行し、全細胞の経時的な時系列データを解析します。細胞周期に関する情報を算出し、微分を行います。ウィンドウが開くので、解析対象の測定項目を選択し、解析パラメータを入力してください。GUIでキュレーションした最後のタイムポイントを入力します。デフォルトのスムージングおよび細胞周期割り当てパラメータは、5分間隔でイメージングされた半倍体および二倍体株に対して有効に機能しますが、最良の結果を得るためにはこれらの値を調整する必要がある場合があります。すべてのパラメータを設定した後、「analyze」を選択して、テキストプロトコルに記載されている通りに単一細胞のタイムシリーズデータをエクスポートします。実験の実施と解析が正常に完了すると、構成的なDH1プロモーターによって駆動される統合コピーのIan蛍光タンパク質またはCFPを発現するハロー酵母株について、現実的な出現時間および分裂時間が割り当てられた、大部分が連続的な単一全細胞のタイムシリーズが得られます。経時的な全細胞測定値は、タイムシリーズ解析から得られました。明視野画像では、セグメンテーションされた母細胞が青色で、出芽した細胞が緑色で示されています。連続した全細胞が赤色で囲まれていることから、体積と発現の両方に細胞周期への依存性が認められます。ここでは、ハッチングされた領域は細胞がG2/M期にあることを示し、白色から灰色への変化はG1期からS期への移行時に出芽が開始されることを示しています。出芽形成後、グレーから白へのシェーディングの変化を伴うM期からG1期への移行時に、シェーディングと細胞分裂が起こります。合計体積は以前よりも急速に増加しますが、タンパク質濃度または平均強度はわずかに低下しながら出現します。また、母細胞領域のみの場合と比較して、出芽後の統合タンパク質量の増加も加速します。これらの結果は、全細胞測定において出芽による寄与を適切に組み込むことの重要性を示しており、また、出芽形成および分裂時間の適切な割り当てが必要であることを強調しています。分化させたタイムシリーズを用いることで、瞬時の相対的なmRNAレベルおよび転写速度を算出することができ、これらはいずれも出芽後に上昇します。測定タイムシリーズの微分値は、本文のプロトコルで説明した切替可能な発現システムを用いた速度論的研究にも有用です。時系列解析により、転写因子が核に局在するタイミングと、標的遺伝子の転写が開始および停止するタイミングが示されます。ここに示す転写の様子は、スイッチ可能なYFPを融合させたPHO4 TetRトランスアクチベーターを持つ細胞において、指定された4つの取得チャンネルで撮影された顕微鏡写真です。このトランスアクチベーターは、低リン酸状態に反応してRFPで標識された核に局在し、7x TetOプロモーターCFPレポーターの発現を誘導します。推論された転写速度は、平均的および単一細胞レベルで局在化に伴い変化します。この手順に従い、単一細胞の多次元時系列データに対して他の解析を行うことで、「集団全体で発現は時間とともにどのように変動するか」、「外因性ゆらぎの影響は複数世代にわたって継承されるか」といった追加の疑問に答えることができます。遺伝子活性化のキネティクスは再活性化に伴って変化するのか。細胞周期はどのような役割を果たしているのか。その他、単一細胞の遺伝子発現の増殖およびリネージ軌跡の解析を必要とする多くの問いが存在します。

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