フライの日周期活動を定量化する手法

ほとんどの動物では、概日時計が行動過程と分子過程を調節し、それらを日々の明暗サイクルに同期させます。ショウジョウバエでは、通常、時計は自発運動記録を使用して研究されます。これは、12時間の明るいサイクル、12時間の暗いサイクルで測定された平均的な野生型の移動の例であり、上部に黄黒のバーで示されている明るい-暗いサイクルです。

典型的なハエの記録は、夜明け頃に起こる朝のピークと夕暮れ頃に起こる夕方のピークという2つの活動ピークを持つ、複雑でバイオモーダルなパターンを示しています。この2つのピークは、時計遺伝子で観察される正弦波振動とは大きく異なる波形を形成しており、時計に加えて、観察された行動パターンの生成に深い影響を与えているメカニズムがあることが示唆されています。ここでは、ハエの活動における時間的パターンを数学的に記述する最初の方法を紹介します。

活動データを、ハエの移動を模倣したモデル波形に当てはめます。このモデルは、朝のピークから 2 つの項と夕方のピークから 2 つの項の 4 つの指数項で構成されています。概日周期と合わせて、私たちのモデルは9つの独立したパラメータを持っています。

B パラメータは、朝の上昇、朝の減衰、夕方の上昇、および夕方の減衰の速度を定義します。TMとTEは朝と夕方のピークの幅を定義し、HMとHEはピークの高さを定義します。これらのパラメータを合わせると、アクティビティパターンの朝と夕方のピークのサイズと形状が完全に記述されます。

本手法は、ハエの自発運動測定値で一般的に観察される二峰性の活動パターンの根底にあるメカニズムと基質を解明するために応用することができます。移動実験では、一方の端に食べ物、もう一方の端に綿を入れた個々のチューブを準備します。そのためには、まず、50ミリリットルのビーカーに5〜6グラムのフライフードを入れます。

食品を細かく切ると、電子レンジで溶かしやすくなります。1つのアクティビティモニターで32本のチューブを装着できます。したがって、32本のチューブを取り、輪ゴムを使用してそれらを接続します。

ビーカーの中の食品を電子レンジで溶かします。食品を約10〜15秒間加熱します。電子レンジを5秒ごとに停止し、ビーカーを食べ物と少し振って、食品が均等に溶けるようにします。

すべての食品が溶けていて、ビーカーに固形の食品が残っていないことを確認してください。食べ物がまだ液体である間に、ビーカーにチューブを食べ物と一緒に挿入します。チューブを少し上下に動かして、チューブが均等に満たされるようにします。

食べ物を冷まし、約1時間固めます。食品が固まったら、ビーカーの底に食べ物がくっつかないように、回転運動を使用してビーカーからチューブを取り外します。次に、輪ゴムを取り外します。

ワックスを使用して食品で端を密封します。そのためには、まずペーパータオルでチューブを丁寧に拭きます。次に、チューブをワックスに押し付けます。

シールの品質を目視で確認し、必要に応じて再度シールを繰り返します。この手法を使用して、実験用のすべてのチューブを密封します。チューブのもう一方の端は綿で閉じます。

綿は、ハエをチューブ内に閉じ込めたまま、空気を通過させます。また、取り外しや入れも簡単なので、実験用のハエをチューブにセットするときに便利です。さて、チューブの準備ができたら、実験のためにハエをセットします。

そのためには、CO2でパッド上のハエをアンロードします。次に、ブラシを使用して、個々のチューブに1つのフライを慎重に入れます。フライ付きのチューブをモニターに入れます。

モニターと同じ順序で、フライロコモーションはモニターシステムによって出力ファイルに記録されます。モニターをコンピューターに接続し、一定の温度と湿度を維持するインキュベーターに入れます。実験に基づいて、適切な明暗条件を設定します。

明暗実験では、実験全体を通してハエを明暗サイクルに保ちます。分析では、測定の初日を使用しないでください。恒常的な暗さの実験では、まずハエを明暗の条件で2日間飼育し、時計の同調と同期させ、その後、一定の暗さに切り替えます。

分析では、常に暗い初日の測定値を使用しないでください。次のセクションに進む前に、プロトコルを読むことをお勧めします。モニターシステムは、モニター内のすべてのハエのアクティビティを含む単一のファイルを出力します。

出力ファイルの最後の32列には、個々のハエの活動が含まれています。私たちのプログラムはシングルフライアクティビティで動作します。したがって、出力ファイルを複数の 1 つのフライ アクティビティ ファイルに分割します。

各ファイルは 1 列の TXT ファイルである必要があります。これで、アクティビティファイルを準備した後、分析を実行できます。MATLAB コマンド ウィンドウで、次の入力パラメーターを使用して ModelFitPS3 関数を実行します。

サンプリングレート、データサンプル時間間隔を秒単位で入力します。たとえば、データは 20 秒のサンプリング レートで取得されました。したがって、ここに20を入れます。

ビン間隔として、視覚化を改善するためにデータをビン化する時間間隔を分単位で入力します。ビニングは20分または30分にすることをお勧めしますが、ここでは、後で簡単に変更する方法を示すために、ここに10を配置します。トレンドについては、データがベースライントレンドを示している場合は1を、それ以外の場合はゼロを入力します。

データにはベースラインの傾向がありません。したがって、ここにゼロを入れます。Enter キーを押して、関数を実行します。

ポップアップウィンドウで、シングルフライアクティビティファイルを選択し、開くを押します。プログラムは、データのパワースペクトルを計算してプロットします。このウィンドウで、データ内のプライマリ期間を決定します。

そのためには、概日周期のピークをマウスの左ボタンでクリックするか、概日周期を2で割った値で複製された第2高調波のピークをマウスの右ボタンでクリックします。私たちの場合、第2高調波のピークは概日周期のピークよりもはるかに大きく、シャープです。したがって、2番目のオプションを使用します。

次に、プログラムは選択したビン間隔にビン化されたデータをプロットします。ご覧のとおり、ビン間隔が 10 分間隔では、朝と夕方のピークがあまりよく視覚化されていません。したがって、この値を変更します。

これを行うには、グラフ上の任意の場所を右クリックするだけです。新しいダイアログボックスで、ビン間隔の新しい値を入力します。20 分間隔にビニングすることをお勧めします。

したがって、ここに20を入れます。OKを押します。プログラムは、ビン間隔の新しい値でデータを即時に再描画します。この値を受け入れるには、グラフ上の任意の場所を左クリックします。

プログラムはデータを再描画し、5日間の測定のみを表示します。このウィンドウでは、分析で使用される最初の朝のピークを選択します。時には、最初の1日か2日を飛ばす必要があることもありますが、これはフライが明暗サイクルに適応するのに時間がかかります。

朝のピークを選択するには、好みのピークをクリックするだけです。プログラムはデータを再描画し、選択した朝のピークから始まる3日間の測定値のみを表示します。青と赤の縦線は、最初のウィンドウで選択した期間に基づく最初の夕方のピークと 2 番目の朝のピークを示しています。

このウィンドウでは、モデル関数でデータの予備フィットにチューブが使用した点を選択します。そのためには、この特定の順序で次のポイントをクリックしてください。まず、最初の朝のピークの頂上をクリックします。

クリックは、クリックの位置を示す赤い星で下部に示されます。次に、朝のピークの終わりをクリックし、次に夕方のピークの開始をクリックし、次に夕方のピークの上部をクリックし、次に夕方のピークの終わりをクリックし、最後に翌日の朝のピークの上部をクリックします。最終的なパラメーターはスペクトル フィットから取得されるため、プログラムはパワー スペクトルを再度プロットします。

スペクトルはx軸上の周波数としてプロットされ、概日ピークはプロットの左側にあります。最初のステップで決定された期間は、赤い縦線で示されています。フィットポイントを選択するには、まず、プライマリー周期を大まかに決定します。

そのためには、概日周期のピークを左クリックするか、第2高調波のピークを右クリックします。再び2番目のオプションを使用します。その後、スペクトルフィットのポイントを選択するためのスライダーが下部に表示されます。

ポイントは赤い丸で表示され、スライダーを動かすと表示されます。スライダーを左右に動かし、スペクトルピークの上部にできるだけ近づけてポイントを配置します。最適な画像が得られたら、[同意する]ボタンを押すと、選択したポイントがモデルのパワースペクトルの解析式にフィットします。

フィッティング後、プログラムはさらに2つのグラフを出力します。1 つ目は、抽出されたパラメーターで構築されたモデルのパワー スペクトルです。2つ目は、モデルに適合されたデータです。

データは黒線で示され、モデルは赤線で示されています。関数は、特に過去3日間のアクティビティのデータによく似ていることがわかります。抽出されたパラメータは、モデルフィットパラメータTXTファイルに保存されます。

ファイル名の後、パラメータは次の順序で保存されます、最初にbは朝の崩壊、次にbは朝の昇、bは夕方の昇、bは夕方の崩壊、概日周期、次に朝のピークの幅を概日周期で割ったもの、夕方のピークの幅を概日周期で割ったもの、朝のピークの高さ、 夕方のピークの高さ、およびスペクトル フィットのフィッティング誤差。モデルフィットパラメータファイルに加えて、プログラムはさらに2つのファイルも出力します。1つ目はモデル関数によるデータの適合、2つ目はスペクトルの適合です。

この分析は、他のアクティビティファイルで実行します。抽出されたすべてのパラメータは、モデルフィットパラメータTXTファイルに保存され、さらに、モデルアクティビティパターンによって制御されるフライの日常的な行動を調節する基本的なメカニズムに行動出力を関連付けるために使用できます。