2次元培養系を用いた主な大脳皮質細胞のイメージングをライブします。

この実験の全体的な目標は、神経幹細胞からニューロンまたはグリア細胞への系統進行中の細胞の挙動を観察することです。この方法は、対称的および非対称的な細胞分裂の役割、細胞周期の延長、細胞増殖速度など、神経発達分野の質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞系譜を長期間観察できることです。

これにより、単一の系統内でのニューロン新生からグリア発生への切り替えの観察と、サブリニアの神経およびグリア前駆細胞の直接的な組み合わせが可能になります。まず、冷解剖培地を入れたペトリ皿で5〜10個のe14胚から脳を取り出します。鉗子を使用して、皮膚と頭蓋骨を慎重に引き出し、脳を分離します。

実体顕微鏡下で作業しながら、解剖鉗子を使用して髄膜を取り除きます。次に、中央で終脳を分割して半球を分離します。背外側終脳を分離するには、背内側の曲線とパリオとパリウム下の境界に沿って切断します。

背外側終脳を氷上の解剖培地を入れた2mLチューブに移し、すべての脳が解剖されるまで待ちます。背外側終脳を顕微解剖した後、組織を15mLの円錐管に入れます。.次に、採取した組織を入れたチューブを低温解剖培地で摂氏4度、Gの340倍で5分間遠心分離し、組織を沈殿させます。

スピン後、ピペットで上清を取り除き、37°Cの0.05%トリプシン-EDTAを1mL加えて化学消化します。摂氏37度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、2mLの増殖培地を加えてTrypsim活性を阻害します。

次に、ガラス製のパスツールピペットの先端をガスバーナーまたはブンゼンバーナーで数秒間研磨して、開口部を少し狭めます。ピペットの先端をコーティングするアスペレートFCS。次に、気泡が発生しないように注意しながらピペッティングを上下に行うことにより、火で研磨されFCSコーティングされたパスツールピペットと細胞を機械的に解離します。

解離した細胞を摂氏4度で5分間遠心分離し、G.ピペットで上清を除去し、次に1ミリメートルの増殖培地を加え、ピペットを使用して細胞を再懸濁します。前処理したプレートからPBSをPoly-D-Lysineで取り除きます。次に、プレートの底に、ゼロ点を決定するための基準として使用できる記号を描きます。

細胞を増殖培地に2回目に再懸濁した後、0.4%トリパンブルー溶液を使用して細胞懸濁液を1対1希釈で調製します。計数チャンバースライドにロードし、未染色の生細胞の数をカウントします。生存不能な細胞は青色になります。

細胞を増殖培地で希釈して、1ミリメートルあたり10〜6番目の細胞を得ます。24ウェル組織培養プレートの各ウェルに500マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、細胞を摂氏37度および二酸化炭素5%でインキュベートします。レトロウイルス形質導入細胞をイメージングするには、組織培養プレートを温度および二酸化炭素コントローラーに接続されたイメージングチャンバーに配置して、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%の一定の条件に保ちます。

ゼロ点として機能する XY 軸の位置を選択し、ゼロ点をキャリブレーションします。ウェルごとに10〜15の位置を選択して、10倍の倍率でイメージングします。光毒性を減らすために、5分ごとに位相差画像と3時間ごとに蛍光画像を要求するようにソフトウェアを設定します。

実験の最初の3時間は、温度が平衡している間にピントが変化する可能性があるため、ピントを確認して調整します。7日後、取得を中止し、イメージング後の免疫細胞化学に進みます。セルトラッキングソフトウェアを起動し、ユーザー名を選択します。

ユーザー名を選択して続行します。tTt作業フォルダを参照して選択し、系統樹、統計、エクスポートされた画像を保存します。次に、分析して読み込む実験を選択します。

画像が以前にtTtコンバーターによって変換された場合は、ログファイルコンバーターをクリックし、ログファイルコンバーターウィンドウで2つの連続する時点間の秒数を指定します。[Convert log files for whole experiment] をクリックします。目的の画像を手動で選択してロードするか、プログラムに表示されているオプションを使用してロードします。

ファイルを選択し、開き、新しいコロニーを選択します。トラッキングをクリックし、続いてトラッキングを開始をクリックして、選択した位置でトラッキングを開始します。ムービーウィンドウが表示されます。

トラッキングサークルを使用してセルを選択し、ゼロキーを押します。ソフトウェアは次のフレームに進みます。マウスを使用してトラックセルの周囲にトラッキング円を配置し続け、各フレームでゼロをクリックしてセルにトラックマークを追加します。

キー 1 と 3 を使用して、前のフレームまたは次のフレームに移動します。トラックマークを削除するには、マークする正しい位置をクリックしてゼロを押すだけです。セルが分割されている場合は、トラッキング、停止理由、分割を選択し、セルエディタウィンドウでセルの1つを選択して1つの娘セルの追跡を続行し、次にトラッキングを選択して追跡を開始します。

2 番目の子セルを追跡するには、セル エディターで選択し、F2 キーを押します。ビデオ顕微鏡検査中に細胞が死滅した場合は、アポトーシスを選択します。細胞が観察視野を離れた場合、または隣接する細胞と混ざり合って追跡できない場合は、[lost] を選択します。トラッキングを停止して後で続行するには、割り込みをクリックします。

セルエディタウィンドウでは、トラッキング中にツリーが生成されます。系統ツリーを保存するには、セルエディタウィンドウでファイル、保存、現在のツリーを選択します。トラッキングデータを含むムービーをエクスポートするには、トラッキングモードをオフにし、ムービーウィンドウで「ムービーのエクスポート」を選択します。

フレームの形式範囲、1秒あたりのフレーム数、ビットレートを設定します。[エクスポートの開始]をクリックします。以下の顕微鏡写真は、初代大脳皮質細胞培養のGFP蛍光画像における位相差を示しています。

イメージングの最初の数時間ではGFP発現は存在しません。GFP発現細胞の数は時間とともに増加し、GFP蛍光の強度はこれらの画像の黄色の矢印で示されているように増加します。この高倍率の画像は、前の画像の四角で囲まれた領域にあり、GFPを発現する細胞を詳細に示しています。

これらの位相差画像は、細胞分裂の一例を示しています。ここでは、前駆細胞の丸め込みが見られ、続いて細胞膜の狭窄が見られ、最後に有糸分裂の完了が見られます。これは、単一細胞系統樹の例です。

色付きの矢印は細胞分裂のさまざまなモードを示し、対称的な増殖分裂は黄色の矢印で示されています。非対称分割は青い矢印で示されます。対称的な末端分裂は赤い矢印で示され、Xは細胞死を示します。

数字は、前駆細胞の細胞周期の長さを示しています。この手法は、適切に実行すれば1〜2時間で実行できます。このビデオを見れば、幹細胞からニューロンやグリア細胞への細胞系譜の進行中に細胞の挙動を示す方法についてよく理解できるはずです。