密閉システムで脳スライスの長期培養中に正確にローカライズされた、反復的な断続的なイメージングのため変更されたロール チューブ法

この脳スライス培養用の改良ローラーチューブ法の全体的な目標は、スライスを長期間生存させるための密閉培養システムを提供することです。これにより、反復的な高解像度蛍光イメージングが可能になります。この方法は、シナプスの形成や喪失に関与する主要なタンパク質の局在化など、ニューロンの発生や神経変性疾患における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、タンパク質発現のためのウイルスの安全な使用を可能にする完全に密閉された培養システムと、イメージングのために同じ細胞を局在化するためのフォトエッチングカバースリップの使用です。この方法のアイデアを思いついたのは、ローラーチューブ内のカバーガラスでスライスを培養していたときでしたが、生きたスライスの経時的な変化を視覚化するためのより良い方法が必要でした。顕微鏡イメージングのための導入遺伝子や特定の細胞集団を発現させるウイルスベクターが広く使用されたことで、私たちはユーザーを保護し、顕微鏡対物レンズの汚染を排除するための密閉型システムを開発しました。

脳スライス内の同一の細胞集団を経時的に追跡する能力により、ヒト神経疾患のげっ歯類モデルにおける病理学的変化の進行とシナプス変化に関する研究が可能になります。まず、ローラーチューブラックを準備し、付属のテキストプロトコルで説明されているように、ローラーチューブに穴を開けるのを支援する治具を作成します。治具を使用して、平らな面が上を向くように、平らな面、1センチメートルのプラスチック培養チューブを所定の位置に保持します。

次に、中心が底から1センチメートルで、チューブの側面の中央に直径6ミリメートルの穴を開けます。旋回式バリ取りツールで穴の端を滑らかにし、穴の内側の端に4つの溝を作って、回転中の穴の排水を容易にします。次に、チューブを70%エタノールですすぎ、生物学的安全キャビネットで風乾します。

UVランプの下で、約12ミリメートルのパンチ付き接着シリコーンゴムディスクでチューブを40分間滅菌します。20分後、チューブとディスクの位置を変えて、露出した表面がすべて滅菌されるようにします。次に、接着ディスクから白い裏地をはがし、穴を揃えてシリコンゴムをチューブの外側に貼り付けます。

スライスが得られたら、準備したカバースリップのフォトエッチング面の中央に2マイクロリットルのチキンプラズマを置きます。プラズマをわずかに広げて、直径3〜4ミリリットルのスポットを実現します。次に、滅菌された先端の細いヘラを使用して、準備した脳スライスを持ち上げます。

閉じた鉗子を使用して、スライスを持ち上げながらスライスをへらの先端に保ちます。へらをカバーガラスのプラズマスポットに触れ、閉じた鉗子でスライスをカバーガラスに押し込みます。.スライスを配置する前に、カバーガラスにひよこプラズマの薄層を追加し、スライスを覆うために最小限の量のトロンビン処理プラズマを覆います。.

スライスが浮いている場合、雲が取り除かれたときにスライスは付着したままになりません。次に、2.5マイクロリットルの血漿と2.5マイクロリットルのトロンビンを別のチューブに混合します。この混合物の2.5マイクロリットルをスライスの上と周りにすばやく置き、ピペットで上下に穏やかに混ぜます。

ローラーチューブに以前に貼り付けられたシリコーンゴム接着剤の露出面から透明なプラスチックカバーを取り外します。次に、ブレインスライスの入ったカバースリップを接着剤の上に置き、スライスを穴の内側に揃えます。密着性を確保するために、親指でカバーガラスに柔らかく均一な圧力をかけ、カバーガラスを均等に押し下げ、生物学的安全キャビネットに移しながら約1分間保持します。

漏れることなくカバーガラスをチューブに接着するためのカバーガラスの圧力は、突出部の空気チャネルを排除するのに十分な時間、適切で維持する必要があります。圧力がかかりすぎると、カバーガラスにひびが入ります。生物学的安全キャビネットに、0.8ミリリットルの完全神経基礎培養培地を各チューブに加えます。

次に、5%二酸化炭素95%の空気混合物を、クランプでしっかりと保持された滅菌綿のパスツールピペットに流します。これを使用して、ローラーチューブをガス混合物で洗い流し、ピペットの周囲からチューブを引き出すときにチューブを急速にキャップします。次に、チューブにスライス番号とラック番号のラベルを付けます。

チューブをローラーラックに挿入します。それらが幾何学的にバランスしていることを確認します。チューブの数が奇数の場合は、バランスをとるために空白のチューブを追加します。ラックを摂氏35度のローラーインキュベーターに置き、ローラーがローラーラックを毎時10〜13回転で回転させます。

インキュベーターの前面をボードに持ち上げて、インキュベーターを約5度後ろに傾けます。スライス培養したチューブを、ここに示すようなカスタムメイドのチューブホルダーに移します。次に、チューブホルダーをステージアダプターに配置して、イメージング中にカバースリップを対物レンズに対して垂直に保ちます。

次に、ステージアダプターのスライダーをチューブにしっかりと押し付けて、チューブを所定の位置に保持します。明視野透過照明下で4倍の対物レンズを使用して、スライスの下のフォトエッチングされたグリッド周期に焦点を合わせます。最初のイメージングセッションでは、スライスの周囲をすばやくスキャンして、高倍率のイメージングが必要なさまざまな領域の数を見つけて記録します。

関心領域が特定されたら、関心領域を含む最初のグリッド スクエアにステージを移動します。次に、20強度誤差の目的に切り替えて、基準マークを見つけます。次に、より高い電力目標に切り替え、同じ基準マークをローカライズし、ステージのxとyの位置を記録します。

ステージを移動して、近くにある他の対象フィールドを見つけ、基準マークからの x オフセットと y オフセットを記録します。オフセット位置により、スライスの画像化時に同じカバースリップ位置を一貫して特定できますが、チューブまたはステージアダプターを取り外して交換すると、基準マークの元のx、y設定が変更されます。顕微鏡の対物レンズコントロールまたはピエゾステージコントロール(利用可能な場合)を使用して、選択した各フィールド内で画像Zスティックをキャプチャします。

ここに示されている画像の共焦点スタックは、ニューロンバイタル色素を使用して、神経突起と細胞体の両方の3D構造を強調していますが、染色は核から除外されています。長期培養中のスライス内の成長スライスの形態と生存率の時間依存的な変化を調べるために、イメージングの24時間前に、同じスライスを週に1回、蛍光ニューロンバイタル色素で標識しました。同一の細胞を経時的にイメージングする再現性を実証するために、13日目にニューロンバイタル色素で標識したスライスの同じフィールドを、14日目、15日目、16日目、および17日目にイメージングしました。

各日の3つの細胞の位置は、核の上の記号で示されています。ニューロンバイタル色素に加えて、ウイルス媒介性蛍光タンパク質をこのシステムとともに利用して細胞を標識することができます。ここでは、カルシウム感受性レポーターとコフィリン含有ロッドの両方を、感染後10日で明確に識別することができます。

この手順を成功裏に実施するには、すべてのチューブ、カバースリップ、および溶液を事前に準備する必要があります。短い事後分析間隔でスライスを取得できることも成功にとって重要であり、多くの練習が必要です。この技術を習得すると、マウスの子犬から12〜18の海馬スライスを取得するために約90分で完了し、解剖とメッキの時間も含まれます。

この手順に従うと、蛍光タグ付きタンパク質の細胞型特異的発現を達成するために、脳スライスをウイルスにさまざまな時間に感染させたり、遺伝子機能を調べるための小さな干渉RNAまたは短いヘアピンRNAによる遺伝子発現のサイレンスを達成したりできます。組換えウイルスの取り扱いは危険な場合があり、これらの試薬を扱う際には常に目の保護具を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。