Name: 密閉システムで脳スライスの長期培養中に正確にローカライズされた、反復的な断続的なイメージングのため変更されたロール チューブ法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学ぶ ローラーチューブ法を用いた脳スライスの長期培養と反復イメージング。密閉システムで神経細胞の生存性を維持し、シナプス形成に関わるタンパク質の局在化を追跡できます。神経変性疾患の研究に有用です。

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<ol><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li>
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<li>Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+synaptic+inputs+drive+dendritic+calcium+amplification+and+cooperative+plasticity+during+clustered+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development.</a> Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).</li>
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<li>Clark, R. E., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+in+form+and+function+of+the+hippocampus+in+rodents%2C+monkeys%2C+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
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<li>He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+use+of+replication-deficient+adenovirus+for+transgene+expression+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons.</a> Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).</li>
<li>Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+synapsin+1+gene+promoter+confers+highly+neuron-specific+long-term+transgene+expression+from+an+adenoviral+vector+in+the+adult+rat+brain+depending+on+the+transduced+area%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area.</a> Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).</li>
<li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+reporter+for+real-time+imaging+of+cofilin-actin+rods+in+living+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons.</a> PLOS ONE. 8 (12), 83609(2013).</li>
<li>Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and purification of recombinant adeno-associated vectors.</a> Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).</li>
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<li>Davis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+dimers%2Ftrimers+potently+induce+cofilin-actin+rods+that+are+inhibited+by+maintaining+cofilin+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation.</a> Mol Neurodegener. 6, 10(2011).</li>
<li>Walsh, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+and+proinflammatory+cytokines+utilize+a+prion+protein-dependent+pathway+to+activate+NADPH+oxidase+and+induce+cofilin-actin+rods+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons.</a> PLOS ONE. 9 (4), 95995(2014).</li>
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<li>Shaw, A. E., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+regulation+of+cofilin+activity+in+the+CNS%3A+a+novel+therapeutic+approach+for+treatment+of+multiple+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders.</a> Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).</li>
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ここで説明したロール チューブ法は、長期培養とスライスした脳組織の高解像度のライブ イメージングします。ここで適用されるのスライス技術で一つの大きな問題は、取り付けとスライスのメンテナンスです。スライス接着をサポート Coverslip コーティング促進神経突起の伸長と細胞のスライスからの移動を高めることによってスライスが薄くなります。したがって、我々 はこれらの基板の使用を避けた。3-アミノプロピルトリエトキシシラン処理によるガラス上にアミノ基の挿入改善、スライスの付着が少なすぎる、またはあまりにも多く、coverslip 鶏プラズマもスライスの損失につながる遵守問題が発生します。適切な接着に必要な血漿量培養脳スライスのサイズに依存して、したがって、マウス脳切片よりも周辺地域で約 4 倍、ラット海馬スライス用大きく。あまりにも多くのプラズマは、スライスの下凝固、細胞接着、coverslip が障害、プラスミン治療は位置を変更または完全にデタッチするのでスライスを緩め。ただし、血栓のあまりにも小さなプラズマは、インキュベーターの回転の最初の数日中にスライス損失につながる可能性があります。39 スライスを含む最近の実験、3 つは失われたが...

齧歯動物の頭脳の地域から解離細胞の初代培養はレスポンスを病理組織学的に観察する研究者によって使用される重要なツールに刺激が関与しています。ただし、このような研究は、ニューロンだけ 2 D で、グリア サポート システムを見ての欠点を持っています。さらに、それの非常に高密度化 (640 ニューロン/mm2または表面積の約 16%) の条件下で栽培しない限りなります短い距離以上の海馬はその細胞体から樹状突起や軸索のランダムな副産物を従うことができません。神経細胞生存率 4 週間以上1、加齢に伴う病態の拡張研究解離文化の使用を制限する著しく低下しました。齧歯動物の脳から調製したスライスの養殖は、数週間または数か月の組織細胞と生存率を維持することでこれらの制限を克服する魅力的なオプションです。スライス培養における齧歯動物の脳の多くの異なる領域を維持するための条件は、説明2をされています。
2 つの主要な方法は広く使用される長期培養脳スライス:3の気液界面膜を培養または密封された管内 coverslips に培養通気4を提供するためにローラーのインキュベーターで回転できます。膜上で培養したスライスの正立顕微鏡と水浸漬目標5を使用して高解像度蛍光顕微鏡による直接イメージを作成できます。また、膜上で培養したスライスは、倒立顕微鏡6を使用して樹状突起スパインの良好な分解能を達成するためにガラス底培養皿に転送されています。ただし、膜上に成長したスライスを画像の両方の方法は媒体の変更を必要とし、多くの場合抗真菌剤や抗生物質を使用して回避または低減汚染5,6オープン ・ システムです。優れた形態や生存率、空気中の界面膜上のスライスを維持が高倍率で反復的なイメージ投射の間の正確な位置に戻るは非常に難しい実験は細胞の唯一の小さなグループに続く蛍光マーカーを表現します。膜上に成長したスライスは、ウイルスによる発現遺伝子5,6で使用されている、バイオ セーフティ プロトコル必要がありますに使用される特定のウイルスのベクトルに囲まれた文化システムが採用されます。蛍光を表現するタグ付きのタンパク質や細胞生理学記者。さらに、浸漬の目的は文化5に続いて、サンプル間の除染を必要とします。膜インターフェイス文化の 1 つの主要なアプリケーションは、単一の時間ポイント7で電気生理学と高分解能イメージングを組み合わせることです。
プラスチック製のチューブ内 coverslips にロール チューブ法、coverslip を削除せず電気生理学または高分解能イメージングを許可しません。したがって、このメソッドは、最も頻繁に8のポスト固定観測が実施された長期的な研究に適用されています。ここで説明した、ローラー チューブ培養技術を利用して、文化として長い間繰り返しイメージを作成することができます coverslips にスライスと掘削を管に維持される方法です。囲まれたシステムは、イメージングの中型の変更を必要としないと、フォトエッチング coverslips イメージング高倍率、数日または数週間後で以前のイメージを作成する正確なフィールド許可基準マークを提供するために利用します。
齧歯動物の海馬は、記憶と学習に関与する主要な脳の領域に変更を検討する本手法に適用します。齧歯動物の海馬は、認知障害9広告で発生したなどの開発中に病理組織学的、または加齢に伴う変化のためのモデルとしてよく勉強しました。本手法は特に広告8の特徴である a β ペプチドの増加などの環境の変化に対応で時間をかけて 1 つのスライス内で開発の病理学的変化の研究に適しています.コフィリン アクチン凝集体の存在である人間と齧歯動物の AD 脳に関連付けられている 1 つの病理学、ロッド、コフィリンとアクチン フィラメントの後者含まれているバンドルは、1:1 モル比10、11,12. ロッド固定スライス a β 投与ラット海馬だけでなく、コフィリン gfp 低酸素8を受けるライブ齧歯動物脳スライス内で観察されているし、広告に見られるシナプスの機能不全に貢献するかもしれないストローク。ここで我々 は時間コースと別のウイルスによって導入された表現された外因性キメラ蛍光蛋白質のスライス内の分布を観察するのにこの新しい培養方法を使用します。コフィリン ロッドと海馬スライスにおける可溶性 a β オリゴマー (a βo) による治療への応答の集計の病理学の発展に従ってくださいコフィリン記者構造、神経特異的発現し利用します。

<table><tbody><tr><td>15 cmの培養皿VWR</td><td>サイエンティフィック</td><td>25384-326</td><td></td></tr><tr><td>フィリップスヘッド小ネジ(#10-32)</td><td>ACEハードウェア</td><td></td><td>長さ2.5インチ、直径3/16インチ</td></tr><tr><td>フラットワッシャー#10</td><td>ACEハードウェア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小ネジナット(#10-32)</td><td>ACEハードウェア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゴムグロメット&nbsp;</td><td>ACEハードウェア</td><td></td>5<td>/16インチ、厚さ5/8インチ、穴径1.125インチ、OD</td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ(5/16インチ;外径、3/16インチ;ID)</td><td>ACEハードウェア</td><td></td><td>1.8インチの長さにカット</td></tr>ロック<tr><td>ワッシャー#10</td><td>ACEハードウェア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドリルプレス、5速&nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>ProTech Model 1201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta フラットサイド チューブ</td><td>VWR</td><td>62407-076</td><td></td></tr><tr><td>ドリル ビット、3 mm、6 mm、15 mm&nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>Diablo freudブランドの</td><td>プラスチックを切断するためのドリルビット。</td></tr><tr><td>木材用ドリルビット、1.5 cmおよび1 mm</td>エー<td>スハードウェア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウッドファイル、1/4 "ラウンド</td><td>エースハーウェア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スプリングクリップ、16 mmスナップホルダー</td>エー<td>スハードウェア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スイベルヘッドバリ取りツール、5 "</td><td>エースハードウェア</td><td>26307</td><td></td></tr><tr><td>接着シリコーンシート(セキュアシール)</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>666581</td><td>0.5 mm厚</td></tr><tr><td>6 mm穴パンチ</td><td>オフィス最大</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm穴パンチ</td><td>thepunchbunch.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フォトテックカバースリップ、直径12 mm</td>ベル<td>コガラス株式会社</td><td>1916-91012</td><td></td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナノ純水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-アミノプロピルトリエトキシラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>#5 デュモン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>マキルウェインティッシュチョッパー</td><td>テッドペラ株式会社</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>両刃カミソリの刃テッド</td><td>ペラ株式会社</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filter Paper</td><td>VWR</td><td>28450-182</td><td>直径 5.8 cm の円にカット</td></tr><tr><td>ポリ - クロロ - トリフルオロ - エチレン (Aclar)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10501-10</td>直径<td>5.8cmの円にカット</td></tr><tr><td>#21外科用ブレード</td><td>VWRサイエンティフィック</td><td>25860-144</td><td></td></tr><tr><td>#5デュモン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>スパチュラ、テーパーエンド付きステンレス</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td></td></tr>ゲイ<tr><td>のバランスの取れた塩溶液</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>G9779&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;グルコース</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15023-021</td><td>25%(w / v)溶液、0.2 mmフィルター滅菌チキン</td></tr><tr><td>プラズマ</td><td>Cocalico Biologicals</td><td>30-0300-5L</td><td>滅菌水で再水和し、2500 x g 30分で4°Cで遠心分離します。C、液体窒素でアリコートを急速冷凍し、&nbsp;-80°C。</td></tr><tr><td>トロンビン、局所(ウシ)</td><td>ファイザー</td><td>トロンビン-JMI</td><td>液体窒素中の急速凍結アリコートは、希釈剤で 1,000 国際単位/mL で提供され、-80°C で保存されます。 250ユニット/mLでご使用ください。</td></tr><tr><td>セルローラーシステム</td><td>Bellco Biotech</td><td>SciERA</td><td></td></tr><tr><td>ローラーインキュベーター</td><td>Forma</td><td>Model 3956</td><td></td></tr><tr><td>N21-MAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AR008</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>200 mM Glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15023-021</td><td>25% (w/v) 溶液、0.2 mm フィルター滅菌</td></tr><tr><td>ニューロベースル A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10888-022&nbsp;</td><td>完全培地:48 mL Neurobasal A、1 mL N21-MAX、0.625 mL 200 mM グルタミン、0.180 mL 25% グルコース、0.250 mL 100x ペン/連鎖球菌</td></tr>。<tr><td>第3世代レンチウイルス包装</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>159 K カットオフ遠心フィルター (Centricon)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルス クローニング システム (InFusion)</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスミド 30323, 50856, 51279</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuronal cell viability dye (NeuO)</td><td>Stemcell technologies</td><td>1801</td><td>一度解凍し、4&microで急速冷凍します。Lアリコート。-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>エア:4倍、20倍、オイル:40倍、60倍、</td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスク 共焦点システム</td><td>横川</td><td>CSU22</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡 EMCCDカメラ</td><td>フォトメトリクス</td><td>カスケードII</td><td></td></tr><tr><td>リニアエンコード(x,y)、ピエゾz フラットトップステージ</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡レーザーと統合</td><td>インテリジェントイメージングイノベーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T細胞</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>ヒトプラスミン</td><td>シグマ Aldrich</td><td>P1867</td><td>0.002 U/mL 0.1% ウシ血清アルブミン (0.2 mm フィルター滅菌済み)、液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存します。</td></tr></tbody></table>

密閉システムで脳スライスの長期培養中に正確にローカライズされた、反復的な断続的なイメージングのため変更されたロール チューブ法

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

培養齧歯類脳スライスは、ニューロンとグリア通常体内の相互作用の多くを保持する環境での細胞および分子の挙動を調べる場合に役立ちます。蛍光顕微鏡による高分解能イメージングのためさまざまなトランスジェニック マウス線または蛍光付けられた蛋白質または野生型脳スライスのレポーターの発現ウイルスベクターの使用から得られたスライスを許可します。イメージング脳スライス、スライス培養を組み合わせて実行する機能のいくつかの方法が開発されているが、長時間にわたりライブ スライスの特定のセルの繰り返しの高分解能イメージングは、問題を提起しています。最高ユーザーを保護し、交差汚染を防ぐためにクローズド システムで行われるため外因性タンパク質の発現ウイルスベクターを使用、これは特に当てはまります。密閉システムで何週間もかけてスライスの繰り返しの高分解能イメージングを可能にするローラー管脳スライス培養法は、単純な変更が報告されます。フォトエッチング coverslips にスライスを養殖を迅速かつ正確には、さまざまな治療法の前後に時間をかけて同じフィールドをイメージするステージを再配置する基準マークの使用できます。特定の神経細胞の染色し海馬スライスのアーキテクチャの変化を観察するための式、蛍光蛋白質のウイルスによる神経発現とコフィリン病理学の発展と組み合わせてこのメソッドの使用方法の例が表示されます。アルツハイマー病 (AD) の海馬におけるアミロイド β (a β) ペプチドのオリゴマーをスライス処理に応答, 以前。

フィディシャル マークを正確にどのように判断に活用できる時間をかけて同じフィールド内で同じセルを減らせる、フォトエッチング coverslips (図 6A) 上に成長したスライスを調べた。ニューロンは重要な染料との汚損によって視覚化された (100 nM の 2 h のため非神経細胞に染色されません)、25の細胞を傷つけることがなく時間をかけてニューロンから消えます。我々 識別する基準ラベル付け後に重要な色素標識細胞 24 h の領域を見つけた 1 つのグリッドの正方形 (図 6A, B) でマーク記録 x と y オフセット基準マーク (図 6B) からの位置および収集60 × 対物 4 日間連続でイメージングを繰り返し、この地域の共焦点画像の...

提示し、培養するため変更されたロール チューブ法をここでは、フォトエッチング coverslips に再配置する正確に何週間もかけてスライスの齧歯動物の脳の断続的な高分解能イメージング。神経細胞の生存とスライス形態も維持されます。細胞型特異的発現ウイルスを用いたこの完全に囲まれたシステムのアプリケーションを提供しています。

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

この脳スライス培養用の改良ローラーチューブ法の全体的な目標は、スライスを長期間生存させるための密閉培養システムを提供することです。これにより、反復的な高解像度蛍光イメージングが可能になります。この方法は、シナプスの形成や喪失に関与する主要なタンパク質の局在化など、ニューロンの発生や神経変性疾患における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質発現のためのウイルスの安全な使用を可能にする完全に密閉された培養システムと、イメージングのために同じ細胞を局在化するためのフォトエッチングカバースリップの使用です。この方法のアイデアを思いついたのは、ローラーチューブ内のカバーガラスでスライスを培養していたときでしたが、生きたスライスの経時的な変化を視覚化するためのより良い方法が必要でした。顕微鏡イメージングのための導入遺伝子や特定の細胞集団を発現させるウイルスベクターが広く使用されたことで、私たちはユーザーを保護し、顕微鏡対物レンズの汚染を排除するための密閉型システムを開発しました。脳スライス内の同一の細胞集団を経時的に追跡する能力により、ヒト神経疾患のげっ歯類モデルにおける病理学的変化の進行とシナプス変化に関する研究が可能になります。まず、ローラーチューブラックを準備し、付属のテキストプロトコルで説明されているように、ローラーチューブに穴を開けるのを支援する治具を作成します。治具を使用して、平らな面が上を向くように、平らな面、1センチメートルのプラスチック培養チューブを所定の位置に保持します。次に、中心が底から1センチメートルで、チューブの側面の中央に直径6ミリメートルの穴を開けます。旋回式バリ取りツールで穴の端を滑らかにし、穴の内側の端に4つの溝を作って、回転中の穴の排水を容易にします。次に、チューブを70%エタノールですすぎ、生物学的安全キャビネットで風乾します。UVランプの下で、約12ミリメートルのパンチ付き接着シリコーンゴムディスクでチューブを40分間滅菌します。20分後、チューブとディスクの位置を変えて、露出した表面がすべて滅菌されるようにします。次に、接着ディスクから白い裏地をはがし、穴を揃えてシリコンゴムをチューブの外側に貼り付けます。スライスが得られたら、準備したカバースリップのフォトエッチング面の中央に2マイクロリットルのチキンプラズマを置きます。プラズマをわずかに広げて、直径3〜4ミリリットルのスポットを実現します。次に、滅菌された先端の細いヘラを使用して、準備した脳スライスを持ち上げます。閉じた鉗子を使用して、スライスを持ち上げながらスライスをへらの先端に保ちます。へらをカバーガラスのプラズマスポットに触れ、閉じた鉗子でスライスをカバーガラスに押し込みます。.スライスを配置する前に、カバーガラスにひよこプラズマの薄層を追加し、スライスを覆うために最小限の量のトロンビン処理プラズマを覆います。.スライスが浮いている場合、雲が取り除かれたときにスライスは付着したままになりません。次に、2.5マイクロリットルの血漿と2.5マイクロリットルのトロンビンを別のチューブに混合します。この混合物の2.5マイクロリットルをスライスの上と周りにすばやく置き、ピペットで上下に穏やかに混ぜます。ローラーチューブに以前に貼り付けられたシリコーンゴム接着剤の露出面から透明なプラスチックカバーを取り外します。次に、ブレインスライスの入ったカバースリップを接着剤の上に置き、スライスを穴の内側に揃えます。密着性を確保するために、親指でカバーガラスに柔らかく均一な圧力をかけ、カバーガラスを均等に押し下げ、生物学的安全キャビネットに移しながら約1分間保持します。漏れることなくカバーガラスをチューブに接着するためのカバーガラスの圧力は、突出部の空気チャネルを排除するのに十分な時間、適切で維持する必要があります。圧力がかかりすぎると、カバーガラスにひびが入ります。生物学的安全キャビネットに、0.8ミリリットルの完全神経基礎培養培地を各チューブに加えます。次に、5%二酸化炭素95%の空気混合物を、クランプでしっかりと保持された滅菌綿のパスツールピペットに流します。これを使用して、ローラーチューブをガス混合物で洗い流し、ピペットの周囲からチューブを引き出すときにチューブを急速にキャップします。次に、チューブにスライス番号とラック番号のラベルを付けます。チューブをローラーラックに挿入します。それらが幾何学的にバランスしていることを確認します。チューブの数が奇数の場合は、バランスをとるために空白のチューブを追加します。ラックを摂氏35度のローラーインキュベーターに置き、ローラーがローラーラックを毎時10〜13回転で回転させます。インキュベーターの前面をボードに持ち上げて、インキュベーターを約5度後ろに傾けます。スライス培養したチューブを、ここに示すようなカスタムメイドのチューブホルダーに移します。次に、チューブホルダーをステージアダプターに配置して、イメージング中にカバースリップを対物レンズに対して垂直に保ちます。次に、ステージアダプターのスライダーをチューブにしっかりと押し付けて、チューブを所定の位置に保持します。明視野透過照明下で4倍の対物レンズを使用して、スライスの下のフォトエッチングされたグリッド周期に焦点を合わせます。最初のイメージングセッションでは、スライスの周囲をすばやくスキャンして、高倍率のイメージングが必要なさまざまな領域の数を見つけて記録します。関心領域が特定されたら、関心領域を含む最初のグリッド スクエアにステージを移動します。次に、20強度誤差の目的に切り替えて、基準マークを見つけます。次に、より高い電力目標に切り替え、同じ基準マークをローカライズし、ステージのxとyの位置を記録します。ステージを移動して、近くにある他の対象フィールドを見つけ、基準マークからの x オフセットと y オフセットを記録します。オフセット位置により、スライスの画像化時に同じカバースリップ位置を一貫して特定できますが、チューブまたはステージアダプターを取り外して交換すると、基準マークの元のx、y設定が変更されます。顕微鏡の対物レンズコントロールまたはピエゾステージコントロール(利用可能な場合)を使用して、選択した各フィールド内で画像Zスティックをキャプチャします。ここに示されている画像の共焦点スタックは、ニューロンバイタル色素を使用して、神経突起と細胞体の両方の3D構造を強調していますが、染色は核から除外されています。長期培養中のスライス内の成長スライスの形態と生存率の時間依存的な変化を調べるために、イメージングの24時間前に、同じスライスを週に1回、蛍光ニューロンバイタル色素で標識しました。同一の細胞を経時的にイメージングする再現性を実証するために、13日目にニューロンバイタル色素で標識したスライスの同じフィールドを、14日目、15日目、16日目、および17日目にイメージングしました。各日の3つの細胞の位置は、核の上の記号で示されています。ニューロンバイタル色素に加えて、ウイルス媒介性蛍光タンパク質をこのシステムとともに利用して細胞を標識することができます。ここでは、カルシウム感受性レポーターとコフィリン含有ロッドの両方を、感染後10日で明確に識別することができます。この手順を成功裏に実施するには、すべてのチューブ、カバースリップ、および溶液を事前に準備する必要があります。短い事後分析間隔でスライスを取得できることも成功にとって重要であり、多くの練習が必要です。この技術を習得すると、マウスの子犬から12〜18の海馬スライスを取得するために約90分で完了し、解剖とメッキの時間も含まれます。この手順に従うと、蛍光タグ付きタンパク質の細胞型特異的発現を達成するために、脳スライスをウイルスにさまざまな時間に感染させたり、遺伝子機能を調べるための小さな干渉RNAまたは短いヘアピンRNAによる遺伝子発現のサイレンスを達成したりできます。組換えウイルスの取り扱いは危険な場合があり、これらの試薬を扱う際には常に目の保護具を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

modified-roller-tube-method-for-precisely-localized-repetitive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。...

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

ここでは、半厚い脳スライスの画像蛍光標識細胞に迅速かつ簡単な方法を説明します。...

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視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

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げっ歯類の脳スライスの長期培養のための改質ローラーチューブ法

出典: Wiegreffe, C., et. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain using In Utero エレクトロポレーション. J. Vis. Exp. (2017)...

形質導入マウス胚脳切片における皮質ニューロン放射状移動のタイムラプスイメージング

前脳と小脳のスライス培養システムを使用してNG2細胞とオリゴデンドロサイトを研究する技術が説明されています。...

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

マウスの仔の脳をカットするために、複数の角度を使用して、我々は主要な聴覚中脳と前脳構造のほとんどの間の接続をキャプチャ前述の急性脳スライスを改善。...

商工会議所のコンポーネントとマルチスケール光イメージングの3次元印刷を組み込むColliculo、視床皮質マウス脳スライスの変更、

このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。...

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

住民の免疫細胞、脳の小膠細胞, は、形態学的変化と彼らの環境の変更に迅速に対応します。このプロトコルでは、2 光子励起顕微鏡を使用して、マウスの急性脳スライスにおけるセロトニンや ATP に向かってミクログリア...

ATP または急性脳スライスにおけるセロトニンに対するミクログリアのプロセスの魅力の二光子励起イメージング

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FRETベースのセンサATeam1.03YEMKを用いたマウス脳の組織組織スライスにおける細胞内ATPのイメージング

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶ ローラーチューブ法を用いた脳スライスの長期培養と反復イメージング。密閉システムで神経細胞の生存性を維持し、シナプス形成に関わるタンパク質の局在化を追跡できます。神経変性疾患の研究に有用です。

密閉システムで脳スライスの長期培養中に正確にローカライズされた、反復的な断続的なイメージングのため変更されたロールチューブ法

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