Name: 開発神経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぶ 発生中の神経上皮における細胞挙動の高解像度ライブイメージング法。鶏胚の神経管を用いて、長時間にわたる個々の細胞動態を観察し、発生神経生物学の重要な課題解明に貢献します。

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1。料理の準備<ol><li>スライス培養に使用される料理は（WillCo料理）（ベースとしてカバースリップ付き）ガラス底です。これらはガラスの底をきれいに保つために6 cmの組織培養皿にレンズの組織に配置されています。 </li><li>実験前日に、ポリ-L-リジンコートのガラス底をに可能にするために室温で5分間ガラスボトムディッシュとインキュベートし、2 mlの0.1％のポリ-L-リジン溶液を追加します。 </li><li>ポリ-L-リジン溶液を除去し、脱イオン水で、その後一度70％エタノールで3回すすいでください。 </li><li>一晩乾燥させたままにします。料理も穏やかに30〜45秒のために低消費電力で電子レンジで加熱することによって乾燥させることができる。 </li></ol> 2。胚のエレクトロポレーション<ol><li> °Cハンバーガー·ハミルトン（HH）ステージ10（〜36時間）（または他の所望の段階）に37℃で卵をインキュベートします。 </li><li>ガラス針を（我々は燃える/ブラウンモデルP87マイクロキャピラリープラーを使用します）準備しneedlの先端を切り離し始める前に解剖顕微鏡下で微細な鉗子を使用して電子。それはDNA溶液の注入を妨げるように狭くされていないが針の終わりには胚を貫くのに十分なシャープでなければなりません。 </li><li>胚のいずれかの側の窓の卵と場所電極（5mm離れ） </li><li>神経管に - DNA（ファストグリーンの少量で着色された脱イオン水で0.5μg/μLの〜0.025）を注入します。 </li><li>現在適用されます - パルス間の950ミリ秒と12月17日V三回、50msのパルスの長さ。 </li><li>我々は個々のセルに従うことができるようにモザイクの発現を達成するためにDNAの低濃度、低エレクトロポレーション電圧を使用しています。 </li><li>セロテープで卵殻の窓をカバーし、それが密閉されていることを確認します。 </li><li>胚は37℃で3-4時間または一晩で回復することができ℃の</li></ol> 3。コラーゲンとスライス培養培地の調製<ol><li>スライスする前に、時間に関するコラーゲンミックスとスライス培養培地を準備します。 </li><li> 300μlのtにYPE 1コラーゲンは、100μlの0.1％酢酸溶液と100μlの5×L15培地を追加します。徹底的に各添加後ボルテックス。溶液は黄色に変わります。 </li><li>今15から20μlの7.5％炭酸水素ナトリウムと徹底的に渦を追加します。解決策は、少しピンクになるべきであり、このために必要な重炭酸ナトリウムの量が異なる場合があります。氷上に置き、毎回新鮮な構成しています。 </li><li> 10ミリリットルneurobasal培地に1×の最終濃度と10μlのゲンタマイシン液にB-27サプリメントとグルタミンを追加します。 </li><li> 37℃インキュベーター内で場所媒体は、5％CO 2で緩衝。それはCO 2と平衡できるようにするためにコンテナの上部が緩いままにしておきます。 </li></ol> 4。スライス培養<ol><li>卵から胚を取り出して、L15培地で洗ってください。 </li><li>下部にsylgardの層での組織培養皿で行われ、それらがピンと張ったストレッチされるように、周囲の余分な胚膜を介してそれらをピン。 </li><li>マイクを使用して、roknife、関心領域を介して、できるだけまっすぐにスライス胚。脊髄では、スライスの厚さは1から2体節の間でなければなりません。あなたがそれらを失うことはありませんので、他の胚をスライスしながら胚に接続されているスライスのままにしておきます。 </li><li> 〜先端の1ミリメートルを切断し、P2またはP10にこれを取り付けることにより、200μlのマイクロピペットチップを準備します。このチップは、ガラスボトムディッシュに脊髄スライスを転送するために使用されます。 10μlの先端は、スライスをピックアップするのに十分広いではありません。 </li><li>コー​​ト前に準備1μlのコラーゲンミックスをピペッティングによるコラーゲンの先端の内側。 L15培地でリンスし、1から2分放置します。これは、先端の内側に付着したから組織を防ぐことができます。 </li><li> microknifeを使用して、胚からスライスをデタッチし、200μlの先端を装備し、1μlにセットP2またはP10を使用して、皿から削除します。できるだけ媒体として取るようにしてください。 </li><li>渦コラーゲンミックスとポリ-L-リジンコートしたディッシュにこのの5-8μlをドロップします。 </li><li> Immediately細かい鉗子のペアを使用して所定の位置にコラーゲンや位置に胚のスライスを入れた。スライスが撮像される側はカバースリップの端が揃うように配置する必要があります。組織は、カバースリップ上にポリ-L-リジンコーティングに付着する必要があります。 </li><li>あなたがカバースリップ上で複数のスライスを持ってまで、この手順を繰り返します。我々は、通常1皿に6から9のスライスを配置することができます。 </li><li>すべてのスライスを配置したら、皿をカバーし、コラーゲンが20分に設定することができます。最古の置かれたコラーゲンのいくつかはすでに乾き始めている場合があります。防ぐために、これがカバーする前に、これらにL15の少量を追加します。 </li><li>一度、設定を慎重に少なくとも1時間は37℃、5％CO 2で平衡化された2ミリリットルスライス培養培地を追加します。注意はカバースリップからコラーゲンを取り除くないように注意する必要があります。 </li><li> 37℃/ 5％CO 2インキュベーター内での場所とスライスがイメージを作成する前に少なくとも3時間で回復することができます。パースペックスボックスのウィットには湿度がない場合は、場所の皿1コーナーで湿らせたティッシュペーパーのHAビット。 </li></ol> 5。イメージング胚スライス<ol><li>我々は、画像スライスにWeatherStationの環境室を装備しDeltaVisionコア広視野顕微鏡を使用しています。室は常に5％CO 2/95％空気で顕微鏡ステージを維持するためにCO 2灌流装置を用いて37℃に維持されています。 </li><li>イメージングは​​、通常、40×/ 1.30 NA油浸レンズと画像を用いて行われるCCDカメラを冷却CoolSnap HQ2で撮影されています。 </li><li> Z-セクションは、45μmの組織を介して、1.5μmのキャプチャされます。露光時間は可能な限り低く抑える必要があります。我々は通常、各Z-セクションの5から50ミリ秒間公開しています。画像は7分間隔で取得され、最大9つのスライスは、関数を訪れDeltaVisionシステムの正確なポイントを使用して訪問することができます。 </li></ol> 6。代表的な結果脊髄前駆細胞の例は時間経過のシーケンスは、図に示す。 2aと対応するムービー1。イメージングは​​2日齢（HHステージ12）胚から脊髄スライスに開始されました。このセルは、GFP-αTubulinを表現する構築物でトランスフェクトした。この初期の段階では、神経前駆細胞は主として細胞が2さらに循環前駆細胞を生成するために分割し、その間前駆-前駆モードの部門を受けています。 図。 2bと対応するムービー2は、細胞膜をマーク、GFP-GPI（GPIは、GFPを固定）でトランスフェクトした細胞を示しています。この細胞は、基底のプロセスが二つに分割し、均等に娘細胞に継承されている間分裂を受ける。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> 図1。タイムラプスイメージングのためのスライス培養プロトコル。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> 図2。セルB正常な脊髄の開発中にehavior。 ムービー1から（1）選択したフレーム。 GFP-チューブリンを発現する細胞は、再び（24時間23分と25時間54分）に分割二つの娘細胞を生成し、先端面（2時間20分）に垂直な切断面で分割されます。 （b）の動画2から選択したフレーム。 GFP-GPIをトランスフェクト細胞は、基底のプロセスを分割し（白矢印）と同様に娘細胞に継承され、その間に細胞分裂を受ける。 映画は1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">ムービーを表示するには、ここをクリック</a> 。 ムービー2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">ムービーを表示するには、ここをクリック</a> 。

<ol><li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li>
<li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning%2C+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li>
<li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37(2011).</li>
<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
<li>Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+reporter+of+notch+signalling+indicates+regulated+and+random+notch+activation+during+Vertebrate+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis.</a> BMC Biology. 9, 58(2011).</li>
<li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bios+Scientific+Publishers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li>
<li>Conchello, J. -A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Fundamental+Limits+in+Confocal+Microscopy+Handbook+Of+Biological+Confocal%22">Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal</a>. Pawley, J. B. , Springer US. (2006).</li>
<li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii%3A+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li>
<li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).</li>
<li>Biggs, D. S. C. 3D Deconvolution Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiggs%2C+DSC+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22">Current Protocols in Cytometry</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging%3A+Opportunities%2C+limitations%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここではニワトリ胚スライス培養における細胞の挙動を監視するための新たなタイムラプスイメージングアッセイを提示します。 24-48時間の間の時間フレームをキャプチャすることが容易であるが、このアッセイでは、最大70時間の生体組織の高分解能イメージングを可能にします。高NA油浸対物と時間点の間の比較的短い間隔での使用は同様に私たちはしばしば急速に発生する細胞の挙動を監視することができますように、高解像度での画像取得を可能にし、容易に焦点を用いた従来のタイムラプスイメージング中に見逃されることができ顕微鏡。 このアッセイの主な利点は、長期間にわたって画像セルの能力である。 7顕微鏡を共焦点レーザーの代わりにワイドフィールド6の使用はこのために重要です。共焦点顕微鏡は、従来の光学切片をとり、直接フォーカス情報のうち、排除する能力を含む、広い視野顕微鏡に比べていくつかの利点を提供してきました<sup&gt; 7しかし、ピンホールの使用は、大量の情報を除いて、長い露光時間を必要と、検出器8への光の損失につながる。広視野顕微鏡は、他の一方で、完全な視野照明を使用して、目的を介してすべての通過する光は、検出器に送られます。高い量子効率を持つこの結合は、結合素子（CCD）カメラ、非常に高速な露光時間と共焦点顕微鏡9に比べて対ノイズ比の高い信号を画像処理を確実に冷却した。このアプリケーションでは、我々は長い期間、記録の3Dスタック、最終的に小型に近い回折制限された構造を解決するためのイメージする必要があります。共焦点顕微鏡は、これまでに検出器に到達するからアウトフォーカスの光を防ぎ、大幅に厚い、高密度で標識した試料7、8のバックグラウンドを減少させるが、それだけでよりもはるかに大きな光入力で使用可能な信号対雑音比を実現ワイドフィールド顕微鏡10。非常に光に敏感なsparselのために私たちのエレクトロ脊髄のスライスのようにy軸ラベルのサンプルは、したがって、広い視野顕微鏡は、共焦点顕微鏡よりもパフォーマンスが向上します。フォーカス情報と向上し、コントラストの外に除去しデコンボリューションによって、イメージの復元と組み合わせると、広いフィールドが、小さな、薄暗いオブジェクト11の検出に特に適しています。あらゆる組織のイメージング実験には適していませんが、このアプローチは、私たちの生細胞イメージングアプリケーションのための非常に有効であった。 蛍光タンパク質の選択は、細胞の生存に影響を与えることができる重要な要因である。我々は最良の結果がマーカーとして緑色蛍光タンパク質（GFP）12を使用して構造体から得られることがわかります。我々は現在、事実上のデュアルチャネルの時間経過のためにGFPと組み合わせて使用​​することができる赤色蛍光タンパク質の範囲を評価しています。 13利用できるようなタンパク質の様々なものがあります。多くのタンパク質は、蛍光タンパク質との融合体として安定しているが、、いくつかのタンパク質が減少し、細胞生存率の結果、融合によって不安定にレンダリングすることができます。このような場合には、内部リボソーム侵入部位（IRES）を含む構造体の使用は、蛍光タンパク質から目的のタンパク質を分離するのに便利です。 イメージング脊髄スライスする場合は、注意が蛍光灯への暴露を最小限に抑えるように注意する必要があります。顕微鏡の接眼レンズは、スライスを見つけて位置する透過光（明視野）でのみ使用する必要があります。蛍光画像は、常に最小の露光時間を使って顕微鏡ソフトウェアを使用して取得する必要があります。これらは5から50 msの範囲に保たれるべきであり、中立的な密度のフィルタの使用で実験する必要があります。長い露光時間が最初にクリアな画像を生成するかもしれませんが、蛍光灯暴露の光毒性効果は、細胞死につながる可能性があります。この地域は中に損傷されている可能性があり、組織が含まれているカバースリップに最も近い組織の最初の5〜10μmの撮像すべきではありませんスライス。 ここで示す例は、HHステージ10以降撮像された6-7時間でエレクトロ胚のですが、このメソッドは、ステージ18をHHに胚用に使用することができます。後の段階で、脊髄組織がはるかに大きいので、手でスライスすることは困難である。これらのケースでは、低融点アガロースで胚を埋め込み、ビブラトームで切片と良い結果をもたらす可能性があります。我々が開発して脊髄のイメージング細胞の方法として、このアッセイを提示するにもかかわらず、このアプローチはまた、感覚placodes 3を含むイメージを他の胚組織に変更されています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> WillCoディッシュ</td><td> WillCoウェルズ</td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td>ポリエルリジン</td><td>シグマ</td><td> P8970 </td><td>トリスの0.1％ </td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細管</td><td>ハーバード·インスツルメンツ</td><td> GC100-10 </td><td> 1.0ミリメートル、外径、 0.58ミリメートル、内径</td></tr><tr><td>電極（Genetrodes、OVOで、L字型</td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td>メッキ5ミリメートル金</td></tr><tr><td> ECM 830平方パルスジェネレータ</td><td> BTX </td><td> 45から0002 </td><td> OVO electroopration のための</td></tr><tr><td>速いグリーン</td><td>シグマ</td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td>私はラットのコラーゲン</td><td>シグマ</td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15培地（粉末） </td><td>シグマ</td><td></td><td>蒸留水に2.76グラム/ L 5X溶液の</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S8761 </td><td> 7.5％のソリューション</td></tr><tr><td> Neurobasal培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 12348-017 </td><td>フェノールレッドなし</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> A1286001 </td><td> 100xのソリューション</td></tr><tr><td> B-27サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / mlの</td></tr><tr><td> L15培地（液体1X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </tD&gt; <td> 15度傾斜</td></tr><tr><td>ステンレススチールヘッドピン</td><td>ワトキンスとドンカスター</td><td> E6871 </td><td> A1サイズ</td></tr><tr><td> Sylgard 184エラストマー</td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVisionコア顕微鏡システム</td><td>アプライドプレシジョン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 CCDカメラ</td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

胚の脊髄は中枢神経系（CNS）のニューロンとグリア細胞の大部分を生じさせる神経前駆細胞をサイクリングで構成されています。ずっとそのパターン脊髄を分子メカニズムについて知られ、ニューロンの分化1、2を引き出すされていますが、我々は、細胞の挙動のレベルでこれらの初期のイベントの深い理解を欠いている。彼らは神経を受けると、それはリアルタイムで神経前駆細胞の挙動を研究するため、非常に重要です。 過去には、初期胚組織のリアルタイムイメージングは​​、細胞/組織培養中の生存率と同様に蛍光イメージングの光毒性影響によって制限されていました。ここでは、新規のex vivoでのスライス培養プロトコルと広視野蛍光顕微鏡（ 図1）を利用し 、長時間のイメージングなどの組織のための新規アッセイ法を提示します。このアプローチでは、ニワトリ胚の長期的な時間経過のモニタリングを実現高い空間分解能と時間分解能を持つピナル脊髄前駆細胞。 このアッセイは、画像に携帯電話とサブセルラー行動の観察に加えて、胚組織3、4の範囲を変更することができ、遺伝子活性のための新規の開発と高感度レポーター（例えば、Notchシグナル伝達5）は 、このアッセイを行うシグナル伝達を理解するための強力なツールでは、胚発生過程における細胞挙動を制御します。

リアルタイムでイメージング胚組織では、長期間にわたって挑戦されています。ここでは、高い空間分解能と時間分解能で長時間ニワトリ脊髄の細胞とサブ細胞の変化を監視するためのアッセイを示す。この手法は、神経系や胚の他の地域に適応することができます。

胚性脊髄は、中枢神経系の神経細胞およびグリア細胞の大部分を分化させるサイクル中の神経前駆細胞で構成されています。

本手順の目的は、胚の神経管内における細胞の挙動を、高解像度で長期間にわたってイメージングすることです。まず、単一細胞を標識するために、任意の蛍光タンパク質の発現を誘導する構築物を用いて初期神経管を切断し、次いで初期胚のスライスを作成してガラス底ディッシュにマウントすることでこれを達成します。インキュベーター内で回復させた後、胚スライスを広視野顕微鏡で一定の間隔で撮像します。最終的に、この手法を用いることで、発達中の神経上皮内における細胞の挙動を、高い空間・時間分解能で長期間にわたって研究することが可能になります。生体組織の撮像における既存の手法と比較した本手法の主な利点は、個々の細胞の挙動を高い空間・時間分解能で長期間観察できる点にあります。この手法により、有糸分裂紡錘体の向きが細胞運命の選択に果たす役割や、電極法によるプラスミドの神経管への導入前にシグナル伝達ダイナミクスがどのように細胞挙動を制御しているかなど、発生神経生物学分野における重要な疑問に取り組むことが可能になります。解剖顕微鏡下でマイクロキャピラリープラーを用いてガラス針を作製します。精密ピンセットを使用して、針の先端を切り落としてください。針の先端は、神経管を貫通させるのに十分な鋭さでありつつ、DNA溶液の注入を妨げるほど細すぎないものである必要があります。本実験に使用するXは、ハミルトン段階（Hamilton Stage）10に達するまで、37 °Cで約36時間インキュベートしました。この手順を開始するには、卵のウィンドウを作成し、胚の両側に5 mmの間隔で電極を配置して、神経管にDNAを注入します。視覚化のために、DNAには少量のファストグリーンで色を付けています。12～17 Vの電流を、パルス幅50 msで3回、パルス間に950 msの間隔をあけて印加します。個々の細胞を追跡できるように、低濃度のDNAと低電圧のエレクトロポレーションを用いてモザイク発現を実現させます。最後に、卵殻の窓をセロハンテープで覆い、完全に密封されていることを確認します。その後、胚を37 °Cで3〜4時間、または一晩静置して回復させます。コラーゲン混合液とスライス培養培地は、胚をスライスする約1時間前に準備してください。コラーゲン混合液を調製するには、0.1% 酢酸溶液 100 µL に type one collagen 300 µL を加え、十分にボルテックスします。次に、5倍濃縮 L 15 培地 100 µL を加え、再度十分にボルテックスしてください。溶液が黄色になれば完了です。次に、7.5%炭酸水素ナトリウムを15〜20 µL加え、十分にボルテックスします。溶液はわずかにピンク色になります。氷上で保持してください。このコラーゲンミックスは、毎回調製して新鮮な状態で使用してください。スライス培養培地を調製するには、10 mLのNeurobasal培地、B27サプリメント、GlutaMax、およびゲンタマイシン溶液を合わせ、5% CO₂でバッファーされた37 °Cのインキュベーター内に置きます。容器の蓋を緩く閉め、少なくとも1時間、CO₂と平衡状態になるまで放置してください。この手順を開始するには、小さなはさみを使用して胚を切り出します。ピンセットを用いて、L 15 mediumで洗浄しながら胚を卵から取り出します。底面にSylgardの層がある組織培養皿に胚を配置します。胚を周囲の胚外膜ごとピンで固定し、膜がピンと張った状態にします。マイクロナイフを用いて、目的の領域をできるだけ直線的に切断します。脊髄切片の場合、厚さは1〜2ソマイト分とする必要があります。切片は胚の側面組織に付着させておき、他の胚の切断作業中に紛失しないようにしてください。脊髄スライスをガラス底皿に転移させるために、カスタマイズしたマイクロピペットチップが必要です。これを用意するには、200 µLチップをP2またはP10ピペットに取り付け、チップの先端から約1 mmを切り落とします。あらかじめ調製しておいたコラーゲンミックスを1 µL用意し、チップの内側をコラーゲンでコーティングします。1〜2分間放置した後、L 15培地で洗浄します。これにより、組織がチップの内側に付着するのを防ぐことができます。次に、マイクロナイフを用いて胚からスライスを切り出し、200 µLチップを装着したP 2またはP 10を用いて、ディッシュからそのスライスを取り出します。培地をできるだけ少量だけ採取するようにしてください。コラーゲン混合液をボルテックスし、ポリリジンコートされたカバーガラス底ディッシュに5〜8 µLを滴下します。直ちに胚スライスをコラーゲン内に投入し、精密ピンセットで位置を調整します。LICsは、イメージングを行う面がカバーガラスに密着するように配置してください。組織はカバースリップ上のポリリシンコーティングに付着するはずです。カバースリップ上に数枚のスライスが配置されるまで、この操作を繰り返します。通常、1枚のディッシュに6〜9枚のスライスを配置します。すべてのスライスを配置した後、最初の方に配置したコラーゲンにL 15培地を2～3 µL加え、ディッシュに蓋をします。コラーゲンを20分間静置して固めます。コラーゲンが固まったら、5% CO2および37 °Cで少なくとも1時間平衡化したスライス培養液2 mLを慎重に加えます。コラーゲンをカバーガラスから剥がさないように注意し、37 °C、5% carbon dioxide インキュベーター内に配置して、イメージング前に少なくとも3時間スライスを回復させます。組織内の細胞挙動を、高い時間的および空間的分解能で長期間イメージングすることは困難です。良好な結果を得るには、最適な培養条件と明視野顕微鏡の使用を組み合わせることが不可欠です。ウェザーステーション環境チャンバーを備えたdelta vision core広視野顕微鏡を用いて、切片のイメージングを行います。チャンバー内は二酸化炭素灌流装置により常に37 °Cに維持され、顕微鏡ステージ上の環境は5% carbon dioxideおよび95% Airに保たれます。イメージングは通常、40倍 1.30 NA油浸レンズを用いて行い、画像はcore snap HQ two冷却CCDカメラでキャプチャします。組織の露出範囲45 µmにわたって、1.5 µmごとにZスタック画像を撮影します。露光時間は、例えば5～50 msなど、可能な限り短く設定してください。各切片について、7分ごとに画像をキャプチャします。Deltaビジョンシステムを用いて、最大9つのスライスを訪問することが可能です。ここに示されている精密なポイント訪問機能は、GFP alpha Tubulinを発現する構築物を導入した脊髄前駆細胞のタイムラプスシーケンスの一例です。イメージングは、HHステージ12の孵化後2日の胚から作製した脊髄切片で開始されました。この初期段階において、神経前駆細胞は主に前駆細胞・前駆細胞モードの分裂を行い、細胞分裂によってさらに2つのサイクル中の前駆細胞を生成します。この図は、先ほど示したタイムラプスシーケンスから選択したフレームを示しています。2時間20分後、細胞は頂端表面に垂直な分裂面を持って分裂し、2つの娘細胞を生成します。これら2つの細胞は、24時間23分と25時間54分に再び分裂します。次のタイムラプスシーケンスは、細胞膜を標識するG-F-P-G-P-Iをトランスフェクトした細胞のものです。この細胞は分裂し、その過程で白矢印で示されるように基底突起が2つに分かれ、娘細胞に均等に受け継がれます。このタイムラプスシーケンスから抽出したフレームは、0時間49分に細胞分裂が起こることを示しています。このビデオを視聴することで、脊髄スライスの調製およびイメージングの方法を十分に理解できたはずです。この手法に不慣れな場合は、成功させるために統合的に行うべき技術的に困難なステップが数多くあるため、最初は苦労する可能性があることを覚えておいてください。

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