開発神経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング
April 12th, 2012
リアルタイムでイメージング胚組織では、長期間にわたって挑戦されています。ここでは、高い空間分解能と時間分解能で長時間ニワトリ脊髄の細胞とサブ細胞の変化を監視するためのアッセイを示す。この手法は、神経系や胚の他の地域に適応することができます。
この手順の全体的な目標は、胚性神経管内の細胞の挙動を高解像度で長期間にわたって画像化することです。これは、最初に、単一細胞をマークするために選択された蛍光タンパク質の発現を駆動するコンストラクトで初期の神経管を横断することによって達成されます。次のステップは、初期胚のスライスを作成し、それらをガラス底の皿に取り付けることです。
インキュベーターで回収した後、胚スライスを広視野顕微鏡で定期的に画像化します。最終的に、この手法は、発達中の神経上皮内の細胞の挙動を、高い空間的および時間的分解能で長期間にわたって研究するために使用できます。この手法が既存の生体組織イメージング法と比較した場合の主な利点は、個々の細胞の挙動を高い空間分解能と時間分解能で長期間観察できることです。
この方法により、硫酸塩の選択における有糸分裂紡錘体の配向の役割や、プラスミドを神経管にエレクトロポレーションする前にシグナル伝達ダイナミクスが細胞の挙動をどのように制御しているかなど、発生神経生物学の分野における重要な問題に対処できます。ガラス針は、解剖顕微鏡下でマイクロキャピラリープーラーを使用して調製されます。細い鉗子を使用して針の先端を折ってください。
針の端は、DNA溶液の注入を妨げるほど狭くなく、神経管を貫通するほど鋭くなければなりません。この実験用のXは、摂氏37度で約36時間インキュベートされ、ハンバーガーハミルトンにされました。ステージ10。
この手順を開始するには、窓と卵子を窓に置き、胚の両側に5ミリメートル離して電極を配置し、DNAを神経管に注入します。DNAは、視覚化のために少量の速い緑色で着色されています。12 〜 17 ボルトと 50 ミリ秒のパルス長の電流を 3 回印加し、パルス間は 950 ミリ秒です。
低濃度のDNAと低エレクトロポレーション電圧を使用してモザイク発現を実現し、個々の細胞を追跡することができます。最後に、卵殻の窓をセラーテープで覆い、密閉されていることを確認します。胚を摂氏37度で3〜4時間または一晩回復させます。
コラーゲン混合物とスライス培地は、胚をスライスする約1時間前に調製する必要があります。1型コラーゲンとボルテックス300マイクロリットルに対して0.1%酢酸溶液100マイクロリットルでコラーゲン混合物を調製するには、L15、中程度および渦巻きの5倍の100マイクロリットルを十分に加えます。繰り返しますが、ソリューションは黄色に変わります。
次に、15〜20マイクロリットルの7.5%重炭酸ナトリウムを加え、しっかりと渦巻きます。解決策はわずかにピンク色になるはずです。氷の上を保ってください。
このコラーゲンミックスは、毎回新鮮に調製する必要があります。以下の神経基礎培地、B 27サプリメント過剰最大およびゲンタマイシン溶液の10ミリリットルでスライス培養培地を調製するために、5%二酸化炭素で緩衝した37°Cのインキュベーターに培地を置く。容器の上部を緩めたままにして、少なくとも1時間二酸化炭素と平衡化させます。
この手順を開始するには、小さなハサミを使用して胚を切り取ります。ピンセットで卵から胚を取り出し、L 15培地を洗浄します。胚を、底にシルガードの層がある組織培養皿に入れます。
胚を周囲の余分な胚膜を通してピンで留め、膜がぴんと張るようにします。マイクロナイフを使用して、関心領域を通じて胚をできるだけまっすぐにスライスします。脊髄の場合、スライスは1〜2個の体節、つまり胚の外側組織に取り付けられた厚い葉のスライスであるべきであり、他の胚がスライスされている間にそれらが失われないようにします。
脊髄スライスをガラス底皿に移すには、カスタマイズされたマイクロパーペットチップが必要です。これを準備するには、200マイクロリットルの先端をP 2またはP 10パーマンに取り付け、先端の端から約1ミリメートルを切り取ります。先に調製したコラーゲンミックスを1マイクロリットル調製し、先端の内側をコラーゲンでコード化します。
1〜2分間放置してから、L 15メディウムですすいでください。これにより、ティッシュが先端の内側にくっつくのを防ぐことができます。次に、マイクロナイフを使用して胚からスライスを取り外し、200マイクロリットルの先端に取り付けられたP 2またはP 10を使用して皿からスライスを取り出します。
できるだけ媒体を使わないようにしてください。コラーゲン混合物をボルテックスし、カバースリップをベースにしたポリオールリジンコーティングガラス底皿に5〜8マイクロリットルを落とし、すぐに胚スライスをコラーゲンに入れ、細い鉗子で配置します。LICは、画像化する側がカバースリップと同じ高さになるように配置する必要があります。
組織は、カバースリップのポリオールリジンコーティングに接着する必要があります。カバースリップにいくつかのスライスができるまで、これを繰り返します。通常、1つの皿に6〜9枚のスライスが置かれます。
すべてのスライスが所定の位置にあるとき、L 15の2〜3マイクロリットル、最も早い場所のコラーゲンを中程度に追加し、皿を覆います。コラーゲンを20分間硬化させます。コラーゲンをセットしたら、5%二酸化炭素と摂氏37度で少なくとも1時間平衡化した2ミリリットルのスライス培養液を慎重に加えます。
摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターのカバースリップ場所からコラーゲンが剥がれないように注意し、イメージングする前にスライスが少なくとも3時間回復するのを待つ必要があります。組織内の細胞の挙動を高い時間的および空間的分解能で長期間イメージングすることは困難です。最適な培養条件とホワイトフィールド顕微鏡の使用の組み合わせは、良好な結果を得るために不可欠です。
ウェザーステーションの環境チャンバーが取り付けられたデルタビジョンコア広視野顕微鏡を使用して、スライスをイメージングします。チャンバーは常に37°Cに維持され、二酸化炭素灌流装置を使用して顕微鏡ステージを5%の二酸化炭素と95%の空気に維持するために、イメージングは通常、1.30NAの40倍の油浸レンズを使用して行われ、画像はコアスナップHQでキャプチャされます2つのCCDカメラZセクションは、45ミクロンの組織曝露を通じて1.5ミクロンごとにキャプチャされます。時間は、5 ミリ秒から 50 ミリ秒など、できるだけ短くする必要があります。
上記の各セクションについて、画像は7分ごとにキャプチャされます。Delta ビジョンシステムを使用して、最大 9 つのスライスを表示できます。ここに示す精密な点訪問機能は、GFPα Tubulinイメージングを発現するコンストラクトをトランスフェクションした脊髄前駆細胞のタイムラプス配列の例であり、2日齢のHHステージ12胚の脊髄切片で開始した。
この初期段階では、神経前駆細胞は主に前駆細胞前駆細胞モード分裂を起こし、その間に細胞は分裂してさらに2つの循環前駆細胞を生成します。この図は、先ほど示したタイムラプス シーケンスから選択したフレームを示しています。2時間20分後、細胞は頂端面に垂直な切断面で分裂し、2つの娘細胞を生成します。
この2つの細胞は、24時間23分と25時間54分で再び分裂します。この次のタイムラプスシーケンスは、細胞膜に印をつけたG-F-P-G-P-Iをトランスフェクションした細胞のものです。この細胞は分裂を起こし、その間に基底突起が白い矢印で示された2つに分割され、娘細胞に等しく受け継がれます。
このタイムラプスシーケンスから選択されたフレームは、細胞分裂が0時間49分に発生することを示しています。このビデオを見た後、脊髄切片を準備して画像化する方法についてよく理解できるはずです。この手法に不慣れな場合は、これが機能するためには、技術的に困難な手順が多数あり、すべてが一緒になるため、最初は苦労する可能性があることを忘れないでください。
概要
この研究では、高い空間的・時間的解像度で長期間にわたる鶏の脊髄における細胞および細胞内部の変化をイメージングするための新しいアッセイを提示します。この技術は神経系の様々な領域や発達中の胚に適応可能です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- イメージング技術
背景
- 胚組織をリアルタイムでイメージングすることは困難です。
- 既存の方法は詳細な研究に必要な解像度や持続時間に欠けることが多いです。
- 高解像度のイメージングは発生における細胞挙動を理解するために重要です。
- この技術により、時間の経過とともに個々の細胞の挙動を観察することができます。
研究の目的
- 胚の神経管における細胞挙動の長期イメージングの方法を開発すること。
- イメージング技術における空間的・時間的解像度を向上させること。
- 発生神経生物学における重要な疑問に対処すること。
使用された方法
- 蛍光タンパク質構築体を用いた初期神経管の断面。
- 胚スライスの準備とガラス底皿への取り付け。
- 定期的な間隔での広視野顕微鏡を用いたイメージング。
- イメージング中の組織の生存性を維持するための特定の培養条件の使用。
主な結果
- 長期間にわたる個々の細胞挙動のイメージングに成功。
- 開発された技術により高い空間的・時間的解像度を達成。
- 発生中の神経上皮における細胞挙動のダイナミクスに関する洞察。
- 有糸分裂紡錘体の方向性やシグナリングのダイナミクスの研究における潜在的な応用。
結論
- この方法は胚組織のイメージングに大きな進歩をもたらします。
- 発生神経生物学の研究に新たな道を開きます。
- さらなる適応により、神経系の異なる領域での適用可能性を高めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding dynamic cell behavior in developing tissues is critical for de-risking target validation in neurodevelopmental disorders. This imaging approach enables high-resolution, longitudinal observation of progenitor cell dynamics, supporting mechanistic insights into signaling pathways that govern cell fate decisions. Such predictive confidence aids in prioritizing targets with stronger translational potential early in discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing how signaling perturbations affect progenitor cell division and differentiation in real time.
- Operational Value: Provides quantitative, sub-cellular resolution data on mitotic dynamics and process inheritance to clarify pathway-specific effects.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by linking molecular interventions to observable changes in cell behavior over extended periods.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible embryonic tissue preparations suitable for compound or genetic perturbation screening.
- Quantitative Output: Delivers high-spatiotemporal-resolution time-lapse data enabling precise measurement of division orientation, timing, and inheritance patterns.
- Scalability: Supports multi-slice imaging per dish, increasing throughput for comparative condition testing in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Offers a human-relevant embryonic model to study conserved mechanisms of neuroepithelial patterning disrupted in developmental disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery observations with preclinical validation by establishing causal links between target modulation and phenotypic outcomes in tissue context.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct effects on progenitor behavior versus secondary consequences, improving target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, providing mechanistic readouts that inform go/no-go decisions before significant investment.
- Discovery Biology: Enables direct testing of how candidate modulators alter progenitor cell division symmetry, orientation, and inheritance in a developing tissue context.
- Screening: Yields standardized, imaging-ready slices with consistent viability, supporting reproducible compound exposure and phenotype detection.
- Analytics: Generates quantitative metrics on division timing, cleavage plane orientation, and cytoplasmic inheritance for objective condition comparison.
- Translational Research: Connects molecular perturbations to emergent tissue-level behaviors, supporting biomarker-aligned phenotypic anchoring in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across multiple neurodevelopmental targets and signaling pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking target engagement to dynamic cellular phenotypes in a physiologically relevant system.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized slice culture and environmental control, minimizing variability in longitudinal imaging.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early elimination of targets lacking desired effects on progenitor behavior dynamics.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of target modulation on disease-relevant cellular processes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue handling, electroporation, and live imaging to ensure slice viability and data quality.
- Dependent on wide-field fluorescence microscopy with environmental control for long-term, high-resolution time-lapse acquisition.
- Necessitates standardized protocols for collagen-based embedding and medium equilibration to maintain consistent tissue adhesion and physiology.
- Adaptation across model systems may require optimization of slice thickness, culture conditions, and fluorescent reporter expression levels.
- Practical limitations include the technical complexity of embryo preparation and the need for precise environmental control to prevent phototoxicity and drift.
