開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

本手順の目的は、胚の神経管内における細胞の挙動を、高解像度で長期間にわたってイメージングすることです。まず、単一細胞を標識するために、任意の蛍光タンパク質の発現を誘導する構築物を用いて初期神経管を切断し、次いで初期胚のスライスを作成してガラス底ディッシュにマウントすることでこれを達成します。

インキュベーター内で回復させた後、胚スライスを広視野顕微鏡で一定の間隔で撮像します。最終的に、この手法を用いることで、発達中の神経上皮内における細胞の挙動を、高い空間・時間分解能で長期間にわたって研究することが可能になります。生体組織の撮像における既存の手法と比較した本手法の主な利点は、個々の細胞の挙動を高い空間・時間分解能で長期間観察できる点にあります。

この手法により、有糸分裂紡錘体の向きが細胞運命の選択に果たす役割や、電極法によるプラスミドの神経管への導入前にシグナル伝達ダイナミクスがどのように細胞挙動を制御しているかなど、発生神経生物学分野における重要な疑問に取り組むことが可能になります。解剖顕微鏡下でマイクロキャピラリープラーを用いてガラス針を作製します。精密ピンセットを使用して、針の先端を切り落としてください。

針の先端は、神経管を貫通させるのに十分な鋭さでありつつ、DNA溶液の注入を妨げるほど細すぎないものである必要があります。本実験に使用するXは、ハミルトン段階（Hamilton Stage）10に達するまで、37 °Cで約36時間インキュベートしました。

この手順を開始するには、卵のウィンドウを作成し、胚の両側に5 mmの間隔で電極を配置して、神経管にDNAを注入します。視覚化のために、DNAには少量のファストグリーンで色を付けています。12～17 Vの電流を、パルス幅50 msで3回、パルス間に950 msの間隔をあけて印加します。

個々の細胞を追跡できるように、低濃度のDNAと低電圧のエレクトロポレーションを用いてモザイク発現を実現させます。最後に、卵殻の窓をセロハンテープで覆い、完全に密封されていることを確認します。その後、胚を37 °Cで3〜4時間、または一晩静置して回復させます。

コラーゲン混合液とスライス培養培地は、胚をスライスする約1時間前に準備してください。コラーゲン混合液を調製するには、0.1% 酢酸溶液 100 µL に type one collagen 300 µL を加え、十分にボルテックスします。次に、5倍濃縮 L 15 培地 100 µL を加え、再度十分にボルテックスしてください。溶液が黄色になれば完了です。

次に、7.5%炭酸水素ナトリウムを15〜20 µL加え、十分にボルテックスします。溶液はわずかにピンク色になります。氷上で保持してください。

このコラーゲンミックスは、毎回調製して新鮮な状態で使用してください。スライス培養培地を調製するには、10 mLのNeurobasal培地、B27サプリメント、GlutaMax、およびゲンタマイシン溶液を合わせ、5% CO₂でバッファーされた37 °Cのインキュベーター内に置きます。容器の蓋を緩く閉め、少なくとも1時間、CO₂と平衡状態になるまで放置してください。

この手順を開始するには、小さなはさみを使用して胚を切り出します。ピンセットを用いて、L 15 mediumで洗浄しながら胚を卵から取り出します。底面にSylgardの層がある組織培養皿に胚を配置します。

胚を周囲の胚外膜ごとピンで固定し、膜がピンと張った状態にします。マイクロナイフを用いて、目的の領域をできるだけ直線的に切断します。脊髄切片の場合、厚さは1〜2ソマイト分とする必要があります。切片は胚の側面組織に付着させておき、他の胚の切断作業中に紛失しないようにしてください。

脊髄スライスをガラス底皿に転移させるために、カスタマイズしたマイクロピペットチップが必要です。これを用意するには、200 µLチップをP2またはP10ピペットに取り付け、チップの先端から約1 mmを切り落とします。あらかじめ調製しておいたコラーゲンミックスを1 µL用意し、チップの内側をコラーゲンでコーティングします。

1〜2分間放置した後、L 15培地で洗浄します。これにより、組織がチップの内側に付着するのを防ぐことができます。次に、マイクロナイフを用いて胚からスライスを切り出し、200 µLチップを装着したP 2またはP 10を用いて、ディッシュからそのスライスを取り出します。

培地をできるだけ少量だけ採取するようにしてください。コラーゲン混合液をボルテックスし、ポリリジンコートされたカバーガラス底ディッシュに5〜8 µLを滴下します。直ちに胚スライスをコラーゲン内に投入し、精密ピンセットで位置を調整します。LICsは、イメージングを行う面がカバーガラスに密着するように配置してください。

組織はカバースリップ上のポリリシンコーティングに付着するはずです。カバースリップ上に数枚のスライスが配置されるまで、この操作を繰り返します。通常、1枚のディッシュに6〜9枚のスライスを配置します。

すべてのスライスを配置した後、最初の方に配置したコラーゲンにL 15培地を2～3 µL加え、ディッシュに蓋をします。コラーゲンを20分間静置して固めます。コラーゲンが固まったら、5% CO2および37 °Cで少なくとも1時間平衡化したスライス培養液2 mLを慎重に加えます。

コラーゲンをカバーガラスから剥がさないように注意し、37 °C、5% carbon dioxide インキュベーター内に配置して、イメージング前に少なくとも3時間スライスを回復させます。組織内の細胞挙動を、高い時間的および空間的分解能で長期間イメージングすることは困難です。良好な結果を得るには、最適な培養条件と明視野顕微鏡の使用を組み合わせることが不可欠です。

ウェザーステーション環境チャンバーを備えたdelta vision core広視野顕微鏡を用いて、切片のイメージングを行います。チャンバー内は二酸化炭素灌流装置により常に37 °Cに維持され、顕微鏡ステージ上の環境は5% carbon dioxideおよび95% Airに保たれます。イメージングは通常、40倍 1.30 NA油浸レンズを用いて行い、画像はcore snap HQ two冷却CCDカメラでキャプチャします。組織の露出範囲45 µmにわたって、1.5 µmごとにZスタック画像を撮影します。露光時間は、例えば5～50 msなど、可能な限り短く設定してください。

各切片について、7分ごとに画像をキャプチャします。Deltaビジョンシステムを用いて、最大9つのスライスを訪問することが可能です。ここに示されている精密なポイント訪問機能は、GFP alpha Tubulinを発現する構築物を導入した脊髄前駆細胞のタイムラプスシーケンスの一例です。イメージングは、HHステージ12の孵化後2日の胚から作製した脊髄切片で開始されました。

この初期段階において、神経前駆細胞は主に前駆細胞・前駆細胞モードの分裂を行い、細胞分裂によってさらに2つのサイクル中の前駆細胞を生成します。この図は、先ほど示したタイムラプスシーケンスから選択したフレームを示しています。2時間20分後、細胞は頂端表面に垂直な分裂面を持って分裂し、2つの娘細胞を生成します。

これら2つの細胞は、24時間23分と25時間54分に再び分裂します。次のタイムラプスシーケンスは、細胞膜を標識するG-F-P-G-P-Iをトランスフェクトした細胞のものです。この細胞は分裂し、その過程で白矢印で示されるように基底突起が2つに分かれ、娘細胞に均等に受け継がれます。

このタイムラプスシーケンスから抽出したフレームは、0時間49分に細胞分裂が起こることを示しています。このビデオを視聴することで、脊髄スライスの調製およびイメージングの方法を十分に理解できたはずです。この手法に不慣れな場合は、成功させるために統合的に行うべき技術的に困難なステップが数多くあるため、最初は苦労する可能性があることを覚えておいてください。