視床皮質軸索分岐とシナプスの可視化脊髄共培養系における形成

この方法の全体的な目標は、視床皮質投影における軸索分岐とシナプス形成の動的な形態学的変化を研究することです。この方法は、新しい神経回路形成など、神経生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、個々の生細胞における軸索の成長とシナプス形成の同時観察です。

この方法は、視床皮質突起における軸索分岐とシナプス形成との関係についての洞察を提供することができます。また、大脳皮質の内因性接続など、他の神経回路にも適用できます。この手順を開始するには、すべての手術器具を70%エタノールで10分以上滅菌します。

次に、氷冷麻酔下で出生後2日目のラットから脳全体をすばやく解剖します。次に、40ミリリットルの冷たいハンクのバランスの取れた塩溶液が入った100ミリメートルのシャーレに脳を入れます。双眼顕微鏡下で、細い鉗子で軟膜物質を慎重に取り除き、一次視覚皮質と体性感覚皮質を顕微手術用ハサミで300〜400ミクロンの厚さに切開します。

その後、皮質スライスを使い捨てのプラスチックピペットを使用して培養インサートのメンブレンフィルターに移します。使い捨てのプラスチックピペットで培養インサートの中央付近のスライスの位置を調整し、インサートから余分な培地を取り除きます。血清含有培地でスライスを摂氏37度に維持し、1日単独で培養してから、E15胚の視床ブロックを隣に置きます。

スライスがガスと媒体の両方を十分に供給できるように、スライスの表面の少し下にある媒体のレベルを調整します。これは、スライスの実行可能性にとって重要です。このステップでは、電極プーラーでガラスキャピラリーを作ります。

次に、プラスミド注入のためにガラスキャピラリーの先端を壊します。電極ピペットは、ガラスキャピラリーの先端をサンドペーパーで研磨し、研磨します。そして、それらをファイヤーポリッシュして、内径50〜200ミクロンを達成します。

次に、電極ピペットと排出ピペットをマニピュレーターに取り付けます。5マイクロリットルのプラスミド溶液をペトリ皿に移します。次に、毛細管現象で溶液を電極ピペットに引き込みます。

直径0.2mmの電極を電極ピペットに挿入します。プラスチックチューブで1ミリリットルのシリンジに排出ピペットを接続した後、5マイクロリットルのプラスミド溶液を再度ペトリ皿に移します。次に、シリンジを使用して溶液をゆっくりと排出ピペットに引き込みます。

その後、エレクトロポレーションステージで共培養を移し、直径1mmの電極を培地に挿入します。続いて、イジェクションピペットを培養視床ブロックに置きます。先端が視床ブロックの表面に触れた後、シリンジを手動で押します。

イジェクトピペットを引っ込めた直後に、電極ピペットを視床ブロックに置きます。次に、電気パルスを配信します。オシロスコープの振幅と列車の数を監視します。

その後、電極ピペットを引っ込めて、皿をインキュベーターに戻します。サンプルを観察するには、EGFPとDsRedの2つのフィルターセットを備えた直立共焦点顕微鏡のステージに培養皿を置きます。次に、20倍の長作動距離対物レンズを使用して、10〜25の光学セクションを1〜7ミクロン刻みのサイズで撮影します。

DsRedとSyp-EGFPの両方を発現する、個々に識別可能な標識軸索を選択します。ここに示されているのは、12 DIV後の視床スライスと皮質スライスの器官型共培養です。これは、ボックス化された領域の拡大イメージです。

そして、これはDsRedで標識された視床細胞で、軸索を皮質スライスに伸ばし、上層に枝を形成しています。これらの画像は、DsRedで標識された視床皮質軸索とSyp-EGFP涙点を示しています。Syp-EGFPの離散的な蓄積が単一の視床皮質軸索に沿って観察されました。

DsRedとSyp-EGFPプラスミドを、エレクトロポレーションを使用して1つのDIVで培養視床細胞に導入しました。この軸索は、4日間にわたって毎日画像化されました。軸索の分岐とシナプスの形成は動的であり、追加と消失を伴いました。

これらの手順に続いて、Syp-EGFPおよびDsRedとともに興味深い遺伝子を用いたエレクトロポレーションを行い、軸索の分岐およびシナプス形成における遺伝子の役割を調べることができます。この技術は、神経生物学の分野の研究者が神経回路の動的変化のメカニズムを探求するための道を開きます。