デジタル ホログラフィー顕微鏡 (DHM) を用いた低濃度で微生物の定量化

この実験の全体的な目標は、デジタルホログラフィック顕微鏡を使用して、非常に低いレベルでの微生物の検出を実証することです。この技術は、従来の光学顕微鏡よりも感度が高く、細菌の挙動に関するリアルタイムの情報を提供します。この方法は、水中の病原性生物や氷の衛星上の太陽系内の生命体の探索など、生物学的および宇宙論的な分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、DHMが体積測定技術であるため、物理的に焦点を合わせ直すことなく、サンプルの3次元情報を瞬時に取得できることです。この技術の意味は、低濃度の細菌を検出する能力があるため、血流または脳脊髄液感染症の診断にまで及びます。この手順を開始するには、実験の日に、0.6〜0.7の範囲であると予想される細菌マスター培養物の分光光度法の読み取りを行います。

次に、マスター培養のサンプルを採取し、Petroff-Hausserカウントチャンバーを使用して細胞を直接カウントし、生細胞と死細胞の両方を列挙します。希釈されていない培養物の10マイクロリットルのサンプルをマイクロピペットでチャンバーに移します。位相差を使用して、高乾燥対物レンズ顕微鏡で画像化します。

その後、バクテリアを少なくとも20マスで数え、それらを平均化します。濃度は、平均して 20 平方に希釈係数を掛けた値として計算します。生細胞のみを列挙するには、20マイクロリットルの細菌溶液を別のウェルに移し、180マイクロリットルの生理食塩水で希釈することにより、選択した各細菌サンプルを滅菌0.9%生理食塩水で段階希釈します。

最低濃度がミリリットルあたり約10〜3細胞になるまで手順を繰り返します。次に、少なくとも2つの希釈液から100マイクロリットルのサンプルを取り出し、適切な固体培地プレートにプレートします。滅菌スプレッダーでそれらを広げ、各希釈を少なくとも3回繰り返します。

その後、一晩またはコロニーが成長するまで適切な温度でインキュベートします。次に、コロニーを数えます。コロニー形成単位を計算し、それを反復にわたって平均化します。

この手順では、DHM用のマスター培養物の段階希釈を行い、Lysogenyブロス培地プレート上のCFUのDHM後のカウントを行います。細菌を25ミリリットルの最小限の培地に希釈して、運動性を促進しますが、細胞分裂を阻害して、実験中に細胞の濃度が著しく変化しないようにします。DHMビデオを録画するには、滅菌注射器を使用して、目的の希釈液を約10ミリリットル引き込みます。

次に、滅菌フィッティングとチューブを使用してシリンジをDHMサンプルチャンバーに接続します。シリンジからのサンプルをシリンジポンプを使用してサンプルチャンバーに連続的に流します。サンプルがサンプルチャンバー内を流れるときに、適切なフレームレートで連続してホログラムを取得します。

10ミリリットルのサンプル全体がDHMを流れるのに十分な時間を確保します。実験中に細菌が増殖したり死滅したりしないように、濃縮された培地プレートに、DHM画像キャプチャ後の使用済み培地100マイクロリットルを滅菌スプレッダーで広げて接種します。次に、コロニーを数える前に、適切な温度で24時間インキュベートします。

正確な細胞数を持つことは、検出限界を定量的に決定するために不可欠です。校正済みのマイクロピペットを使用してすべての希釈を細心の注意を払い、光学濃度、メッキ、およびPetroff-Hausserチャンバーでの直接カウントによってすべてのカウントを確認することが重要です。取得したホログラム動画の細菌の存在を解析するには、まず画像を32ビット形式に変換して、Medium減算フィルタリングを行います。

次に、ピクセルの中央値を計算します。最後に、この中央値を各ピクセルから減算して、ホログラム内の静止アーティファクトを排除します。その後、可視領域リングと焦点が合っているセルの数を手動でカウントします。

ホログラムの各シリーズには、タイムスタンプ ファイルが付属しています。タイムスタンプファイルを使用して、画像がキャプチャされた時点でポンピングされたサンプルの合計量を計算します。続いて、検出された細胞の総数を画像化されたサンプルの総体積で割って、細胞密度を計算します。

正確な統計のために平均 5 から 10 フレーム。このプロットは、365 マイクロメートル x 365 マイクロメートル x 1 ミリメートルのサンプル体積に基づいて、視野ごとに予測された細胞を示しています。視野あたりの細胞数が1つを下回る濃度の場合、検出を達成するためには複数の画像が必要です。

これは、プレート数で測定されたミリリットルあたり2, 100細胞でのSerratia marcescens培養のDHMホログラムシーケンスです。このシーケンスは、約1〜2秒ごとに1つのセルを示しており、予測に非常に適合しています。そして、これは、プレート数で測定されたミリリットルあたり620細胞でのSerratia marcescens培養の別のDHMホログラムシーケンスです。

このシーケンスは、約 6 秒から 7 秒ごとに 1 つのセルを示しています。デジタルホログラフィック顕微鏡を使用して細胞を画像化する場合は、すべての溶液の調製にフィルター滅菌技術を使用することを忘れないでください。これにより、機器に粒子状物質が混入するのを防ぐことができます。

この手順を試みる際には、健康な細胞培養物を準備し、追加の増殖培地、プレート、および運動培地を手元に用意することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、蛍光染色などの他の方法を実行して、生きている細胞と死んでいる細胞の割合などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、微生物学の分野の研究者が培養細胞や環境サンプルの三次元運動性を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、ホログラフィック顕微鏡を使用して細菌を列挙する方法と、他の計数技術を使用して結果を検証する方法について十分に理解できるはずです。細菌培養物を扱う作業は非常に危険であることを忘れないでください。生きた生物を育てて取り扱うときは、常に適切なバイオセーフティ対策を講じる必要があります。