定量的な光学顕微鏡：細胞生物物理の測定は、標準的な光学顕微鏡で特徴

この手順の全体的な目的は、標準的な光学顕微鏡と画像処理を用いて、質量や体積を含む細胞試料の基本的な物理的特性を定量化することです。まず、ガラスカバーガラス上で培養した細胞試料を顕微鏡スライドにマウントします。次に、フォーカススライス（through focus）による明視野像および微分干渉コントラスト像を取得します。

その後、各Zスタック画像は、物理データを抽出するための個別のMATLAB画像処理プログラムに入力されます。最終的に、明視野コントラストおよび微分干渉コントラスト顕微鏡下でのスループフォーカス強度測定を用いて、細胞標本の基本的な物理的特性が得られます。蛍光顕微鏡などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、細胞標本を固定、透過処理、または染色する必要がないことです。

本手法は、細胞周期中や疾患状態に寄与する異なる細胞集団間において、細胞内密度がどのように構成されているかなど、細胞生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。DICおよび明視野の両方の機能を備え、テキストプロトコルに従った追加仕様を持つ顕微鏡を使用し、まずスライドブックソフトウェアを開き、画像収集用の新しいスライドを作成します。次に、フォーカスウィンドウを開き、「フィルターセット」セクションでDICを選択します。スコープタブの「コンデンサー」セクションで、開口絞りのスライドバーを一番右まで調整します。これにより、高い開口数（NA）での照明が可能となり、試料の光学切片化能が向上します。

サンプルのDICスタックを撮影した後、フォーカスウィンドウを開き、[Open]を選択します。フィルターセットセクションで、アパーチャのスライドバーを一番左の完全に閉じた位置まで調整し、低NA照明にします。信号強度を調整した後、画像キャプチャウィンドウを開きます。

DICZスタック取得による3Dキャプチャ設定が、画像キャプチャウィンドウのフィルターセットセクションに表示されます。チェックボックスをオンにし、露光時間を指定します。画像情報セクションで画像に名前を付け、「start」を選択してZスタック画像の取得を開始します。

次に、H-T-D-I-C MATLABプログラム（JoVE HT DCO V one M）で体積測定を行うために、テキストプロトコルに従ってZスタックをエクスポートします。セクション0において、エクスプローラーからhilbert. Transform DMおよびsobel edge Detect Mファイルが含まれているディレクトリをコピーし、dependencies directory = の後のシングルクォーテーションの間に貼り付けて、依存関係ディレクトリ変数を更新します。joco HT DCO V one Mプログラムのセクション0を実行してください。

セクション1では、.TIF形式のスルーフォーカス画像が含まれているディレクトリをコピー＆ペーストして、画像ディレクトリを更新してください。シングルクォーテーションで囲まれた部分を編集し、画像の整列と回転を行うために、このセクションを一度だけ実行してください。ヒルベルト変換を行うには、コードのセクション2を実行します。「Define HT DIC parameters」というタイトルのダイアログボックスが表示されます。

次に、サンプルのDIC画像が合焦している焦点面の番号、水平方向の解像度、軸方向の解像度、ヒルベルト変換の実行に必要なDIC画像の回転角、そして最後に、関心領域（ROI）のサイズを入力します。その後、「Okay」をクリックします。指定した焦点面番号のDIC画像が、青いボックスと共に表示されます。

細胞などの関心領域の上にボックスを配置します。ボックスを目的の領域に配置した後、Bの内部をダブルクリックします。画像のコントラストは、暗い特徴が左側に、明るい特徴が右側に表示されるように調整してください。青いボックスを関心領域までドラッグし、必要に応じて形状を調整します。

次に、セクション3において長方形のマスクを生成するには、167行目のコメントを解除し、170行目をコメントアウトします。画像内をクリックしてマウスをドラッグし、長方形マスクの定義を開始することで、プログラムのセクション3を実行します。その後、ボックスをダブルクリックして確定させます。手書きのマスクを生成するには、セクション3を実行する前に167行目をコメントアウトし、170行目のコメントを解除します。マウスでクリックして希望のマスクを描き、マスクをダブルクリックして確定させます。セクション4を実行して、テキストプロトコルに従ってヒルベルト変換画像スタックを構築した後、セクション5を実行してください。

関心領域のxz断面画像のセグメンテーションを最適化します。プログラムによって作成された図500では、3種類の異なるコントラストが表示されます。細胞の境界を検出するアルゴリズムの成否は、使用するマスクと、プログラムの2行目、2列目、9行目にあるしきい値の設定の組み合わせに依存します。まず0.5という値から開始し、いずれかの列で適切な輪郭が描画されるまで、しきい値を調整してプログラムのこのセクションを再実行してください。

アウトライン抽出の結果が第1列で最適であった場合は、DICセグメンテーションにおいてセクション6を用いて体積を決定します。第2列で最適な結果が得られた場合は、セクション7を実行してヒルベルト変換DIC画像から細胞体積を決定します。第3列で最適な結果が得られた場合は、フォーラーフィルタ処理済みのヒルベルト変換DIC画像を用いてセクション8を実行し、NIQ PM MATLABプログラム（セクション0の「JO VCO NI qpm V1 M」というタイトルの下にある）で質量測定を行うための体積を決定します。3つのディレクトリ依存関係、およびBRIGHTFIELDとDICディレクトリの場所を更新してください。セクション1を実行した後、セクション2を実行します。「define N-I-Q-P-M parameters」というタイトルのダイアログボックスに、サンプルの明視野画像に焦点が合っている焦点面番号、横方向分解能、軸方向分解能、および関心領域（ROI）のサイズを入力してください。

次に [Okay] をクリックします。指定した焦点面番号の明視野焦点面の画像が、青いボックスとともに表示されます。必要に応じてセクション2を再実行して焦点を調整した後、ボックスを画像内でドラッグして移動させ、ボックスのノードを選択してドラッグしてサイズを調整し、ボックス内をダブルクリックして確定させます。

セクション3を実行して明視野画像のスタックが構築されたら、次にセクション4を実行して、位相マップ、擬似DIC画像、および明視野画像との比較を作成します。擬似DIC画像と実際のDIC画像が可能な限り類似している状態で、セクション5Aまたは5Bを実行し、ユーザーが細胞の外形を囲むことで、質量密度マップ、全質量、および細胞密度のヒストグラムを正しく生成させます。フォーカススキャン中の画像取得における試料照明は、N-I-Q-P-MおよびH-T-D-I-Cアルゴリズムを正常に実装するために極めて重要です。この図は、ポリスチレン球およびヒト大腸腺癌細胞株SW six 20における、DICおよび明視野コントラストの両方での低NAおよび高NA照明を示しています。

これらのパネルはN-I-Q-P-Mの最適なイメージングを示しており、こちらはHT DICの最適なイメージングを示しています。これらの画像はNIQ PMアルゴリズムのパラメータ依存性を示しており、実装に成功した例と失敗した例の両方を強調しています。ここでは、直径4.8 µmのポリスチレン球の位相プロファイルを検討します。

期待されるプロファイルは理論的に判明しているため、NIQ PM再構成と直接比較することが可能です。これらのパネルは、球体の境界および内部における球体回折効果によって、球体上の全点での安定した再構成が妨げられる中で、得られる最善の再構成結果を示しています。球体の中央領域は、パネルLに見られるように、1%から5%のパーセント誤差でN-I-Q-P-Mによりキャプチャでき、位相特性が未知である細胞試料にも適用可能です。

事前情報は、擬似DIC画像と実際のDIC画像を比較する手順を併用したNIQ PMMを用いて再構成できます。N-I-Q-P-Mには、計算の中心となる右視野画像スタック内の平面という、1つの自由パラメータが存在します。

この中心焦点面は、擬似DIC像と真のDIC像ができるだけ似た外見になるまで調整する必要があります。ここでは、照明NA 0.9で撮影した細胞の、焦点が外れた擬似DIC像、最適な擬似DIC像、および対応するDIC像を示します。興味深いことに、これらのパネルに示されているように、最良の位相マップおよび対応する擬似DIC像は、必ずしも明視野像の焦点が合っている状態と一致するとは限りません。

最後に、NA=0.9の照明条件下でのDICフォーカス画像からH-T-D-I-C画像処理アルゴリズムに至る手順を示します。まず、ヒルベルト変換を行い、DIC画像のベースレリーフを除去します。これにより光軸方向にわずかなぼけが生じますが、これはハイパスフィルタリングによって除去可能です。最終的に得られた画像は容易にセグメンテーションでき、検体の各断面における面積を決定して、総細胞体積を推定することができます。

この手順を実施する際は、本手順後の明視野または微分干渉像における適切な照明条件を記憶しておくことが重要です。また、検体の密度マップとフロアフォースの共局在を利用して追加の疑問を解決するために、蛍光顕微鏡法などの他の手法を併用することも可能です。