定量的な光学顕微鏡：細胞生物物理の測定は、標準的な光学顕微鏡で特徴

この手順の全体的な目標は、標準的な光学顕微鏡と画像処理を使用して、質量や体積など、細胞標本の基本的な物理的特徴を定量化することです。これは、まずガラスカバースリップ上に成長した細胞標本を顕微鏡スライドにマウントすることで達成されます。次に、フォーカス明視野と微分干渉コントラスト画像を通じて取得されます。

次に、イメージの各 Z スタックを個別の MATLAB 画像処理プログラムに入力し、物理データを抽出します。最終的に、細胞標本の基本的な物理的特性は、明視野コントラスト顕微鏡および微分干渉コントラスト顕微鏡下での焦点強度測定を使用して取得されます。蛍光顕微鏡法のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、細胞標本を固定、透過、または染色する必要がないことです。

この方法は、細胞内密度が細胞周期中または異なる細胞集団間でどのように組織化されているかなど、細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます DICと明視野の両方の機能を備えた顕微鏡を使用し、テキストプロトコルに従って追加の仕様 スライドブックソフトウェアを開き、画像収集用の新しいスライドを作成することから始まります。次に、フォーカスウィンドウを開き、フィルターセットセクションでDICCを選択しますコンデンサーセクションの下のスコープタブで、絞りスライドバーを最も右端の位置に調整します。これにより、高い開口数照明が得られ、試料の光学的切片化が向上します。

サンプルのDICスタックをキャプチャした後、フォーカスウィンドウを開き、[開く]を選択します。フィルターセットセクションの下で、絞りスライドバーを完全に閉じた左端の位置に調整して、NA照明を低くします。信号強度を調整したら、画像キャプチャウィンドウを開きます。

DICZスタック取得からの3Dキャプチャ設定は、画像キャプチャウィンドウのフィルターセットセクションに表示されます。開いているボックスにチェックを入れ、露光時間を指定します。画像情報セクションで、画像に名前を付け、[開始] を選択して Zack 画像の取得を開始します。

次に、テキスト プロトコルに従って Z スタックをエクスポートし、H-T-D-I-C MATLAB プログラムで JoVE HT DCO V one M セクション 0 の下の 1 回、hilbert を含むディレクトリをコピーして貼り付けて、依存関係ディレクトリ変数を更新します。DMとソーベルエッジを変換し、エクスプローラーからMファイルを検出します。一重引用符の間には、依存関係ディレクトリが joco HT DCO V one M プログラムのセクション 0 を実行するように等しくなります。

セクション1では、ドットTIF形式のスルーフォーカス画像を含むディレクトリをコピーして貼り付けて、imagesディレクトリを更新します。一重引用符の間には、このセクションを一度だけ実行して、画像を整列および回転します。ヒルベルト変換の場合、コードのセクション 2 [HT DIC パラメーターの定義] というタイトルのダイアログ ボックスが表示されます。

次に、サンプルのDIC画像が焦点を合わせている焦点面番号、横方向の解像度、軸方向の解像度、ヒルベルト変換を実行するために必要なDIC画像の回転角度、最後に関心領域のサイズを入力します。次に、[OK] をクリックします。焦点面番号で指定したDICの焦点面の画像が青いボックスで表示されます。

ボックスをセルなどの対象フィーチャの上に配置します。ボックスを目的の領域に配置したら、B.The画像のコントラストは、暗い特徴が左側に表示され、明るい特徴が右側に表示されるようなものである必要があります。青いボックスを関心領域にドラッグし、必要に応じて形状を変更します。

次に、セクション 3 で長方形のマスクを生成するには、コメント行 1 6 7 とコメント行 1 7 0 の un comment in image をクリックし、マウスをドラッグして長方形マスクの定義を開始することにより、プログラムのセクション 3 を実行します。次に、ボックスをダブルクリックして受け入れます。手描きのマスクを生成するには、セクション3を実行する前に、行1 6 7をコメントし、行1 7 0をコメント解除し、マウスで目的のマスクをクリックして描画することにより、セクション4を実行した後にマスクをダブルクリックして受け入れ、テキストプロトコルに従ってヒルベルト変換された画像スタックを構築するセクション5を実行します。

関心領域の xz 断面画像の画像セグメンテーションを最適化するため。プログラムによって生成された図500が表示され、3つの異なるタイプのコントラストが表示されます。セルの境界を見つけるアルゴリズムの成功は、使用されるマスクと、プログラムの行 2、2、9 のしきい値の値の組み合わせに依存しており、0.5 の値から始まり、しきい値の値を調整し、列の 1 つで適切なアウトラインが達成されるまでプログラムのこのセクションを再実行します。

DIC セグメンテーションの 1 列目でアウトラインが最適だった場合は、セクション 6 を使用してボリュームを決定します。列 2 で最適な結果が得られた場合は、セクション 7 を実行して hilbert からセル体積を決定し、列 3 で最適な結果が得られた場合は DIC 画像を変換し、セクション 8 を実行しながら forer filtered hilbert 変換 DIC 画像を使用して、NIQ PM MATLAB プログラムで質量測定を行うための体積を決定し、セクション 0 の下に JO VCO NI qpm V1 M というタイトルを付けます。3つのディレクトリの依存関係、BRIGHTFIELDとDICディレクトリの場所を更新し、セクション1を実行した後、セクション2を実行し、N-I-Q-P-Mパラメータを定義するというタイトルのダイアログボックスで、サンプルの明視野画像が焦点を合わせている焦点面番号、横方向の解像度、軸方向の解像度、および関心領域のサイズを入力します。

次に、[OK] をクリックします。焦点面番号で指定された明視野の焦点面の画像が青いボックスで表示されます。必要に応じてセクション2を再実行してフォーカスを調整した後、画像の周りのボックスをドラッグし、ボックスのノードを選択してドラッグし、サイズを変更してから、ボックス内をダブルクリックして受け入れます。

セクション3を実行して明視野画像のスタックが構築されたら、セクション4を実行して位相マップを生成し、疑似DIC画像を生成し、疑似DIC画像と真のDIC画像が可能な限り類似している場合の明視野画像と真のDIC画像との比較を行い、ユーザーがセルの輪郭を描き、質量密度マップを生成できるようにするセクション5Aまたは5Bを実行し、 全質量とセル密度のヒストグラムが正しい。スルーフォーカス画像取得中のサンプル照明は、N-I-Q-P-MおよびH-T-D-I-Cアルゴリズムを成功裏に実装するために重要です。この図は、ポリスチレン球とヒト結腸直腸腺癌細胞株SW six 20のDICコントラストと明視野コントラストの両方での低NA照明と高NA照明を示しています。

これらのパネルは、N-I-Q-P-Mの最適なイメージングを示し、HT DICの最適なイメージングを示します。これらの画像は、NIQ PM アルゴリズムのパラメーター依存性を示しており、成功した実装と失敗した実装の両方を強調しています。ここでは、直径4.8マイクロメートルのポリスチレン球の位相プロファイルを探ります。

予想されるプロファイルは理論的にわかっているため、NIQ PM再構成と直接比較できます。これらのパネルは、球の境界と内部の両方で球面の回折効果が得られる最高の再構成を示し、球面上のすべての点での安定した再構成を防ぎます。球体の中央領域は、位相特性が不明なパネルL細胞標本に見られるように、1〜5%のパーセント誤差でN-I-Q-P-Mで捕捉できます。

NIQ PMM を使用して、疑似 DIC イメージを実際の DIC イメージと比較する手順と組み合わせて、先験的に再構築できます。N-I-Q-P-M には 1 つのフリー パラメーターがあります。計算が中央に配置される右側のフィールド イメージ スタック内の平面。

この中心焦点面は、疑似 DIC イメージと真の DIC イメージができるだけ同じように見えるまで調整する必要があります。ここに示されているのは、焦点が合っていない擬似DIC画像、最適な擬似DIC画像、および照明NAが0.9の細胞の対応するDIC画像です。興味深いことに、最適な位相マップと対応する疑似 DIC 画像は、これらのパネルに示されているように、ピントの合った明視野画像と必ずしも一致しません。

最後に、ここに示されているのは、NAが0.9照明に等しい場合のDICからのH-T-D-I-C画像処理アルゴリズムに関連する手順であり、ヒルベルト変換はDIC画像のベースレリーフを削除するために実行されます。これには、光軸に沿ったぼやけが伴いますが、これはハイパスフォアフィルタリングから取り除くことができます。これらの最終画像は、試料の各断面平面の面積を決定するために簡単にセグメント化でき、総細胞体積を推測できます。

この手順を試行する際は、この手順に続く明視野鉱石差動コントラストイメージングの正しい照明を覚えておくことが重要です。蛍光顕微鏡などの他の方法は、床力と試料の密度マップの共局在を使用して追加の質問に答えるために実行できます。