高分解能断層顕微鏡（HREM） - 有機材料の処理および可視化のための簡単で堅牢なプロトコル

この手順の全体的な目標は、有機材料のデジタルボリュームデータを生成することです。例としては、生物医学モデル生物の胚や胚組織、成体動物やヒトから採取した組織ブロック(皮膚や筋肉の生検を含む)、コーティングされていない紙や皮膚代替品などの材料などがあります。HREMは、医学および生物医学研究の分野における基本的な質問に答えるのに役立ちます。

これは、例えば、遺伝子組み換えマウス胚や操作されたニワトリ胚の臓器や組織の三次元分析と視覚化を可能にします。また、がんモデルの解析や、ヒトや動物の組織から採取した生検も可能です。HREMの主な利点は、組織学的品質に近い画像のスタックを生成する簡単な方法を提供することです。

この技術の意味するところは、動物モデルを用いた創傷治癒の研究や、ヒトの組織病理の紡糸・修復にまで及んでいます。手順を実演するのは、BMRのMarlene RodlerとJohannes Guntherです。どちらもウィーン医科大学解剖学部門出身です。

5 x 5 x 5 cubic milliliter以下の固定胚または胚組織から始めます。固定剤を取り除きます。そしてPBSを追加します。

摂氏4度で24時間絶えず揺さぶって洗います。組織を含むチューブに70%エタノールを加え、サンプルを摂氏4度の回転子に置きます。2〜3時間後、毎回2〜3時間、濃度を上げるエタノール溶液でサンプルを脱水し続けます。

サンプルを脱水している間に、ビーカー内の溶液Aの25ミリリットルに0.3125グラムの過酸化ベンゾイルと0.1グラムのESNを加えて浸透溶液を準備します。ESNと触媒が完全に溶解するまで、摂氏4度の磁気攪拌プレートで2〜3時間攪拌します。サンプルを浸潤液に入れます。

そして、摂氏4度で12〜24時間サンプルを揺さぶるか回転させます。まず、埋め込み液の準備から始めます。1ミリリットルまたは溶液Bを25ミリリットルの新鮮な浸潤溶液に加えます。

モールディングカップトレイを準備した後、金型の深いキャビティに埋め込み溶液を充填します。スプーンを使用してサンプルを型に移します。サンプルが包埋液で完全に覆われていることを確認して、空気が閉じ込められないようにします。

針または鉗子を使用して、サンプルを金型内に向けます。埋め込み中のサンプルの向きを最適化し、ブロック表面上の正確な位置に印を付けることが重要です。このようにして、関心領域を小さく保つことができ、可能な限り高い倍率の対物レンズを使用することができます。

埋め込みソリューションが粘性になり始めたらすぐに、金型の上にブロックホルダーを置き、埋め込みソリューションがブロックホルダーのベースから1〜2ミリメートル上に上昇するまで、ブロックホルダーの中央の穴から埋め込みソリューションを追加します。モールディングカップトレイを液体パラフィンワックスで覆って密封し、固まるまで待ってから移動します。密封された成形カップトレイを室温で1〜2日間保管することにより、ブロックが重合を完了するのを待ちます。

重合後の処理では、重合ブロックを入れたモールディングカップトレイを標準的な実験室用オーブンに入れ、摂氏70〜80度で最低1〜2日間焼きます。型からブロックを取り外します。次に、白色光をブロック表面に斜めに向けることで視野を特定します。

ブロック表面に黒いマーカーでサンプルの影をトレースします。指定された視野でレジンブロックをミクロトームに取り付け、ブロックホルダーを停止位置に移動します。デジタルカメラとデータ生成ソフトウェアを起動し、ライブ画像を取得します。

関心領域をカバーするために適切な倍率の対物レンズを選択します。光学部品を上下に動かし、ミクロトームを横方向に動かして、関心領域がコンピューター画面に表示される視野と一致するようにします。サンプルの最初の構造が表示されるまでブロックをセクション化します。

ミクロトームを動かして、ブロック表面を光学系の焦点面に配置します。0.5〜5ミクロンのセクションの厚さを選択します。次に、製造元の指示に従ってソフトウェアを設定した後、ソフトウェアを起動してデータキャプチャを開始します。

この高分解能電子顕微鏡切片の画像は、胚9.5日目に採取したマウス胚を通る矢状切片を示しています。このボリュームレンダリングされた3Dモデルは、この胚の表面を示しています。この画像は、胚15.5日目に採取されたマウス胚の首のボリュームレンダリングモデルによる仮想矢状切片を示しています。

表面モデルは、ニワトリ胚、発生中のハンバーガーハミルトンステージ18のすべての組織のボリュームレンダリングで心血管系の発光を強調しています。この画像は、人間の神経を通るHREM切片を示しています。インレイは、この画像のセクションを拡大します。

この画像は、ブタの肝臓を通した高分解能電子顕微鏡切片の画像の一部を示しています。この画像は、人間の親指パッドから採取した生検のボリュームレンダリングされた3Dモデルを示しています。この画像は、HREMデータによる仮想切除の前にある真皮動脈、静脈、神経の表面レンダリングモデルを示しています。

このアニメーションは、人間の親指パッドの厚い皮膚のボリュームレンダリングモデルを示しています。閾値が異なるため、血管、神経線維、汗腺、汗腺の管などの真皮構造も異なります。高分解能電子顕微鏡は、繊維状の材料の構造を迅速に可視化することを可能にします。

この画像は、ネイティブの皮膚代替材料のボリュームレンダリングモデルを示しています。このアニメーションは、真皮代替材料のボリュームレンダリングモデルを示しています。繊維の形状と口径が異なることに注意してください。

サンプルを脱水し、浸透させ、樹脂に埋め込む必要があるため、全体の手順には最大で数日かかりますが、溶液の準備や溶液の変更などの操作作業には2〜3時間しかかかりません。データ生成自体は高分解能電子顕微鏡で完全に自動化されており、2〜3時間で1000枚の画像を生成できます。開発後、HREMは、発生生物学の分野の研究者が変異マウス胚の表現型を正確にスコアリングする道を開きました。

その一例が、発達障害のメカニズムの解明やDMDDプロジェクトで、HREMを用いて胚的に致死的なマウス胚の表現型をまだ知られていない詳細で扱うプロジェクトです。その結果、HREMは、ヒト組織サンプルの血管、神経、または繊維の構造を調べるための位置光学顕微鏡の優れた代替手段であることがわかりました。