微分動的顕微鏡を用いた細胞骨格ダイナミクスの定量化
June 15th, 2022
差動動的顕微鏡(DDM)は、動的光散乱と顕微鏡の機能を兼ね備えています。ここでは、DDMを使用して、ビメンチンネットワーク内の粒子の亜拡散およびケージドダイナミクスおよび活性ミオシン駆動アクチン - 微小管複合体の弾道運動を定量化することによって、再構成された細胞骨格ネットワークを特徴付けるプロセスを提示する。
当社のプロトコルは、さまざまな光学顕微鏡技術を使用して、多くのシステムのダイナミクスを定量化できます。我々は、この方法が、特に、再構成された細胞骨格ネットワークのダイナミクスを特徴付けるのにどのように役立つかを強調する。当社の差動顕微鏡ソフトウェアパッケージを使用する主な利点は、それが十分に文書化されており、複数のサンプル分析ファイルを持ち、異なるタイプのダイナミクスを研究するために容易に適応させることができるということです。
当社のソフトウェアパッケージは、再構成された細胞骨格ネットワークだけでなく、他の柔らかく生物学的に関連する材料のダイナミクスを定量化するためにも使用できます。プローブする時間と長さスケールに基づいて、Micro-Managerなどの顕微鏡制御ソフトウェアを使用して、1,000フレームを超える画像シーケンスを取得します。PyDDM コードリポジトリにある examples フォルダで、example_parameter_file.yml という名前のパラメータファイルのコピーを作成します。
このEMLファイルをメモ帳+のようなテキストエディタまたはJupyterLabのテキストエディタで開きます。コピーしたEMLファイルで、解析する画像シーケンスに対応するデータディレクトリとファイル名を指定します。メタデータ セクションで、ピクセル サイズとフレーム レートを指定します。
「分析パラメーター」セクションで、DDM マトリックスの計算に使用するパラメーター (異なるラグ・タイムの数や最長のラグ・タイムなど) を選択します。DDM 行列のフィッティングまたは中間散乱関数の詳細を、モデルとモデル・パラメーターの名前、初期推定値、下限、上限など、フィッティング・パラメーター・セクションに入力します。EML ファイルのファイル名を DDM 分析へのフル・ファイル・パスとともに渡すことによって、分析パラメーターにメタデータを指定して、DDM 分析クラスのインスタンスを初期化します。
または、メタデータとパラメーターを Python ディクショナリ データ構造として渡します。この関数を実行して、DDM マトリックスを計算します。返されたデータを、Xarray パッケージにデータセットとして格納されている関連する変数とメタデータと共に検査します。
次に、PDFファイルとデータディレクトリとして保存されているプロットと図を調べます。これらのプロットの1つは、背景の推定方法のデフォルトの方法を示しています。必要に応じて、EML ファイル内のパラメーターバックグラウンドメソッドを使用するか、またはオプションのキーワード引数として DDM 行列を計算する関数に対して、バックグラウンドを推定する方法を変更します。
イメージメタデータとフィッティングパラメータを含むEMLファイルのファイル名を渡すことによって、DDM 適合クラスのインスタンスを初期化します。機能印刷継ぎ手モデルを実行して、使用可能なモデルを一覧表示します。EML パラメーター・ファイルで使用するモデルを指定するか、関数「再ロード適合モデル」を名前で使用して指定します。
選択したモデル内の各パラメーターについて、関数セット・パラメーターの初期推測および設定パラメーター境界を使用して、EML ファイルで指定された値と異なる場合は、初期推測および境界を設定します。関数 fit で fit を実行します。関数適合レポートを使用して、適合パラメータのq依存性の適合度を検査するためのプロットを生成します。
適合値とともに4つのq値でDDM行列またはISFを示す2×2のサブプロットを含む出力を確認してください。Jupyter ノートブック環境でクラス参照 DDM 適合を使用して、DDM 行列または ISF を、対話的な方法で最適なものと共にプロットします。減衰時間対波数プロットの点をクリックすると、データと適合度が表示されます。
Xarrayデータセットに保存されたフィットの結果を確認し、関数2つのnetCDFまたはPythonの組み込みのpickleモジュールを使用して、このデータ構造をディスクに保存します。DDM分析は、ビメンチンネットワーク内の0.6ミクロンビーズの明視野画像シリーズおよびスペクトル的に異なる蛍光標識を有する活性アクチン-微小管複合ネットワークからの共焦点顕微鏡画像に対して実施した。中間散乱関数は、異なる波数でのラグタイムの関数としてプロットし、ビメンチン濃度が19マイクロモルおよび34マイクロモルのネットワークを有する。
ゼロをはるかに上回る値での関数の長いラグタイムプラトーは、非人間性を示します。ビメンチン濃度の異なる2つのネットワークについてqの関数としてプロットされた崩壊時間タウは、亜拡散性または閉じ込められた運動を示す。34および49マイクロモルのビメンチンを有するネットワークについてqの二乗の関数としてプロットされた非人間性パラメータcは、cの対数が閉じ込められた運動について期待されるようにqの二乗に比例することを示した。
平均二乗変位対ラグタイムプロットは、DDMから決定された値が単一粒子追跡によって見出された値とよく一致することを示した。より集中したネットワークの場合、値はより長いラグタイムで頭打ちになります。活性アクチン-微小管複合ネットワークのDDMマトリックス対ラグタイムは、特定のq値に対するDDMマトリックスが低ラグタイムでプラトーを有し、その後、大きなラグタイムでさらにプラトー化して増加したことを示した。
DDM行列への適合からタウへの特徴的な減衰時間は、タウとqの関係が弾道運動を示していることを示しています。このPyDDMソフトウェアパッケージを開発した後、我々はそれを使用して、活性細胞骨格ネットワークおよび他のシステムの異方性および時間変化ダイナミクスを調査した。
概要
この記事では、再構成された細胞骨格ネットワークのダイナミクスを分析するために差分ダイナミック顕微鏡法（DDM）を利用するプロトコルを提示します。この方法は、ビメンチンネットワークにおける部分拡散とケージ化ダイナミクスを定量化し、アクティブなミオシン駆動アクト-マイクロチューブール複合体の弾道運動を調査します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物物理学
- 細胞生物学
背景
- 差分ダイナミック顕微鏡法は動的光散乱と顕微鏡技術を組み合わせたものです。
- 軟質で生物学的に関連する材料のダイナミクスを特徴づけるのに効果的です。
- ソフトウェアパッケージは十分に文書化されており、様々な動的研究に適応可能です。
- 1,000フレーム以上の画像シーケンスを顕微鏡制御ソフトウェアを使用して分析できます。
研究目的
- 再構成された細胞骨格ネットワークのダイナミクスを定量化する。
- 様々なシステムでDDMを使用するための詳細な方法論を提供する。
- アクティブな細胞骨格ネットワークの異方性と時間依存するダイナミクスを調査する。
使用された方法
- DDM分析にPyDDMソフトウェアパッケージを利用する。
- 画像メタデータとフィッティングパラメータはEMLファイルで指定されます。
- 分析にはDDMマトリックスの計算と中間散乱関数のフィッティングが含まれます。
- 結果はグラフや図として可視化され、PDFファイルとして保存されます。
主な結果
- DDM分析により、異なる濃度のビメンチンネットワークにおける非エルゴジック性が明らかになりました。
- 減衰時間プロットは、異なるビメンチン濃度のネットワークにおける部分拡散運動を示しました。
- アクティブなアクト-マイクロチューブール複合体に弾道運動が観察されました。
- DDMの結果は単粒子トラッキングデータとよく一致しました。
結論
- DDMは細胞骨格のダイナミクスを分析するための強力なツールです。
- この方法は複雑な生物学的材料の挙動への洞察を提供します。
- PyDDMソフトウェアは動的プロセスの包括的な分析と可視化を促進します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of cytoskeleton dynamics is critical for de-risking early-stage discovery and engineering of biomaterials with tunable mechanical properties. Differential Dynamic Microscopy (DDM) enables robust, reproducible measurement of network dynamics across diverse cytoskeletal systems, supporting predictive confidence in target validation and material design. This capability strengthens portfolio decisions by providing standardized, scalable dynamic readouts for both fundamental research and translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cytoskeletal network dynamics for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of biopolymer targets by measuring dynamic responses to composition changes.
- Facilitates predictive confidence in material behavior for downstream engineering or therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated dynamic readouts for high-content screening of cytoskeletal modulators.
- Standardizes assay outputs through reproducible, quantitative DDM analysis across imaging modalities.
- Enables scalable evaluation of compound effects on network mechanics and dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns dynamic measurements with disease-relevant cytoskeletal phenotypes when modeling pathophysiology.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling direct comparison of network dynamics across systems.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying dynamic biomarkers in engineered or native networks.
Pipeline & Workflow Integration
DDM-based quantification integrates from early discovery through assay development and preclinical research, providing a reusable analytical capability for cytoskeletal and soft material systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying dynamic responses to perturbations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic screening campaigns targeting cytoskeletal function.
- Analytics: Provides robust statistical measurements such as decay times, nonergodicity parameters, and mean squared displacement for comparative analysis.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro dynamic phenotypes with disease models when supported by system relevance.
- Enterprise Reuse: Offers a documented, open-source software package adaptable across diverse imaging platforms and biological systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cytoskeletal target validation.
- Operational Value: Standardizes dynamic measurements and enhances reproducibility across teams and platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing quantitative, scalable dynamic readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of biomaterial and cytoskeletal modulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy and basic familiarity with Python-based analysis workflows.
- Needs access to imaging infrastructure capable of acquiring high-frame-count time series.
- Demands cross-team standardization of metadata and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to a range of cytoskeletal and soft material systems with appropriate labeling or tracer strategies.
- Dependent on image quality and acquisition parameters for optimal dynamic resolution.
