Name: 微分動的顕微鏡を用いた細胞骨格ダイナミクスの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学ぶ微分動的顕微鏡（DDM）を用いた細胞骨格ネットワークのダイナミクス定量化法。PyDDMソフトウェアでビメンチン網の非エルゴード性やアクチン・微小管複合体の弾道運動を解析し、細胞生物学研究に応用できます。

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この研究の一部は、国立衛生研究所R15賞(国立一般医科学研究所賞No.R15GM123420、R.M.R.-A.に授与R.J.M.)、科学振興研究公社からのコットレル奨学生賞(賞番号27459、R.J.M.に授与)、ウィリアムM.ケック財団研究助成金(R.M.R-A.に授与)。GHKは、オランダ研究評議会(NWO、NWOタレントプログラムのプロジェクト番号VI.C.182.004)からの財政的支援に感謝の意を表します。

<ol>
	<li>Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).</li>
	<li>Amblard, F., Maggs, A. C., Yurke, B., Pargellis, A. N., Leibler, S. Subdiffusion and anomalous local viscoelasticity in actin networks. Physical Review Letters. 77 (21), 4470-4473 (1996).</li>
	<li>Mizuno, D., Tardin, C., Schmidt, C. F., MacKintosh, F. C. Nonequilibrium mechanics of active cytoskeletal networks. Science. 315 (5810), 370-373 (2007).</li>
	<li>Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li>
	<li>Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Physical Review Letters. 102 (18), 188303 (2009).</li>
	<li>Stuhrmann, B., Soares e Silva, M., Depken, M., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Nonequilibrium fluctuations of a remodeling in vitro cytoskeleton. Physical Review E. 86 (2), 020901 (2012).</li>
	<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
	<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li>
	<li>Anderson, S. J. et al. Filament rigidity vies with mesh size in determining anomalous diffusion in cytoskeleton. Biomacromolecules. 20 (12),4380-4388 (2019).</li>
	<li>Anderson, S. J., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).</li>
	<li>Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).</li>
	<li>Wong, I. Y. et al. Anomalous diffusion probes microstructure dynamics of entangled F-actin networks. Physical Review Letters. 92 (17), 178101 (2004).</li>
	<li>K&#246;ster, S., Lin, Y.-C., Herrmann, H., Weitz, D. A. Nanomechanics of vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 6 (9), 1910-1914 (2010).</li>
	<li>Chandrakar, P. et al. Engineering stability, longevity, and miscibility of microtubule-based active fluids. Soft Matter. 18 (9), 1852-1835 (2022).</li>
	<li>Alvarado, J., Cipelletti, L., H. Koenderink, G. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).</li>
	<li>Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li>
	<li>Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).</li>
	<li>Malik-Garbi, M. et al. Scaling behaviour in steady-state contracting actomyosin networks. Nature Physics. 15 (5), 509-516 (2019).</li>
	<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (5), e2115895119 (2022).</li>
	<li>Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., N&#233;d&#233;lec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e714 (2018).</li>
	<li>Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).</li>
	<li>Giavazzi, F., Brogioli, D., Trappe, V., Bellini, T., Cerbino, R. Scattering information obtained by optical microscopy: differential dynamic microscopy and beyond. Physical Review E. 80 (3), 031403 (2009).</li>
	<li>Giavazzi, F., Cerbino, R. Digital Fourier microscopy for soft matter dynamics. Journal of Optics. 16 (8), 083001 (2014).</li>
	<li>He, K., Spannuth, M., Conrad, J. C., Krishnamoorti, R. Diffusive dynamics of nanoparticles in aqueous dispersions. Soft Matter. 8 (47), 11933-11938 (2012).</li>
	<li>Lu, P. J. et al. Characterizing concentrated, multiply scattering, and actively driven fluorescent systems with confocal differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 108 (21), 218103 (2012).</li>
	<li>Giavazzi, F. et al. Viscoelasticity of nematic liquid crystals at a glance. Soft Matter. 10 (22), 3938-3949 (2014).</li>
	<li>Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Dark-field differential dynamic microscopy. Soft Matter. 12 (8), 2440-2452 (2016).</li>
	<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. Light-sheet microscopy with digital Fourier analysis measures transport properties over large field-of-view. Optics Express. 24 (18), 20881-20894 (2016).</li>
	<li>Richards, J. A., Martinez, V. A., Arlt, J. Particle sizing for flowing colloidal suspensions using flow-differential dynamic microscopy. Soft Matter. 17 (14), 3945-3953 (2021).</li>
	<li>Ferri, F. et al. Kinetics of colloidal fractal aggregation by differential dynamic microscopy. The European Physical Journal Special Topics. 199 (1), 139-148 (2011).</li>
	<li>Lanfranco, R. et al. Adaptable DNA interactions regulate surface triggered self assembly. Nanoscale. 12 (36), 18616-18620 (2020).</li>
	<li>Cho, J. H., Cerbino, R., Bischofberger, I. Emergence of multiscale dynamics in colloidal gels. Physical Review Letters. 124 (8), 088005 (2020).</li>
	<li>Giavazzi, F., Trappe, V., Cerbino, R. Multiple dynamic regimes in a coarsening foam. Journal of Physics: Condensed Matter. 33 (2), 024002 (2020).</li>
	<li>He, K. et al. Diffusive dynamics of nanoparticles in arrays of nanoposts. ACS Nano. 7 (6), 5122-5130 (2013).</li>
	<li>Jacob, J. D. C., He, K., Retterer, S. T., Krishnamoorti, R., Conrad, J. C. Diffusive dynamics of nanoparticles in ultra-confined media. Soft Matter. 11 (38), 7515-7524 (2015).</li>
	<li>Sentjabrskaja, T. et al. Anomalous dynamics of intruders in a crowded environment of mobile obstacles. Nature Communications. 7, 11133 (2016).</li>
	<li>Hitimana, E., Roopnarine, B. K., Morozova, S. Diffusive dynamics of charged nanoparticles in convex lens-induced confinement. Soft Matter. 18 (4), 832-840 (2022).</li>
	<li>Wilson, L. G. et al. Differential dynamic microscopy of bacterial motility. Physical Review Letters. 106 (1), 018101 (2011).</li>
	<li>Martinez, V. A. et al. Differential dynamic microscopy: a high-throughput method for characterizing the motility of microorganisms. Biophysical Journal. 103 (8), 1637-1647 (2012).</li>
	<li>Germain, D., Leocmach, M., Gibaud, T. Differential dynamic microscopy to characterize Brownian motion and bacteria motility. American Journal of Physics. 84 (3), 202-210 (2016).</li>
	<li>Croze, O. A. et al. Helical and oscillatory microswimmer motility statistics from differential dynamic microscopy. New Journal of Physics. 21 (6), 063012 (2019).</li>
	<li>Safari, M. S., Vorontsova, M. A., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of weakly scattering and polydisperse protein-rich clusters. Physical Review E. 92 (4), 042712 (2015).</li>
	<li>Wang, J., McGorty, R. Measuring capillary wave dynamics using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 15 (37), 7412-7419 (2019).</li>
	<li>Cerbino, R., Giavazzi, F., Helgeson, M. E. Differential dynamic microscopy for the characterization of polymer systems. Journal of Polymer Science. 60 (7), 1079-1089 (2021).</li>
	<li>Cerbino, R., Cicuta, P. Perspective: differential dynamic microscopy extracts multi-scale activity in complex fluids and biological systems. The Journal of Chemical Physics. 147 (11), 110901 (2017).</li>
	<li>Drechsler, M., Giavazzi, F., Cerbino, R., Palacios, I. M. Active diffusion and advection in Drosophila oocytes result from the interplay of actin and microtubules. Nature Communications. 8 (1), 1-11 (2017).</li>
	<li>Burla, F., Sentjabrskaja, T., Pletikapic, G., Beugen, J. v., H. Koenderink, G. Particle diffusion in extracellular hydrogels. Soft Matter. 16 (5), 1366-1376 (2020).</li>
	<li>Regan, K., Wulstein, D., Rasmussen, H., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. M. Bridging the spatiotemporal scales of macromolecular transport in crowded biomimetic systems. Soft Matter. 15 (6), 1200-1209 (2019).</li>
	<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).</li>
	<li>Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).</li>
	<li>Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv:2112.11260 .(2021).</li>
	<li>Chen, X. et al. Coaxial differential dynamic microscopy for measurement of Brownian motion in weak optical field. Optics Express. 26 (24), 32083-32090 (2018).</li>
	<li>Reufer, M., Martinez, V. A., Schurtenberger, P., Poon, W. C. K. Differential dynamic microscopy for anisotropic colloidal dynamics. Langmuir. 28 (10), 4618-4624 (2012).</li>
	<li>Giavazzi, F., Haro-P&#233;rez, C., Cerbino, R. Simultaneous characterization of rotational and translational diffusion of optically anisotropic particles by optical microscopy. Journal of Physics: Condensed Matter. 28 (19), 195201 (2016).</li>
	<li>Cerbino, R., Piotti, D., Buscaglia, M., Giavazzi, F. Dark field differential dynamic microscopy enables accurate characterization of the roto-translational dynamics of bacteria and colloidal clusters. Journal of Physics: Condensed Matter. 30 (2), 025901 (2017).</li>
	<li>Safari, M. S., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of bidisperse colloidal suspensions. npj Microgravity. 3 (1), 21 (2017).</li>
	<li>Giavazzi, F., Pal, A., Cerbino, R. Probing roto-translational diffusion of small anisotropic colloidal particles with a bright-field microscope. The European Physical Journal E. 44 (4), 61 (2021).</li>
	<li>Schwarz-Linek, J. et al. Escherichia coli as a model active colloid: a practical introduction. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 137, 2-16 (2016).</li>
	<li>Kurzthaler, C. et al. Probing the spatiotemporal dynamics of catalytic Janus particles with single-particle tracking and differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li>
	<li>Mandal, S., Kurzthaler, C., Franosch, T., L&#246;wen, H. Crowding-enhanced diffusion: an exact theory for highly entangled self-propelled stiff filaments. Physical Review Letters. 125 (13), 138002 (2020).</li>
	<li>Norouzisadeh, M., Chraga, M., Cerchiari, G., Croccolo, F. The modern structurator: increased performance for calculating the structure function. The European Physical Journal E. 44 (12), 146 (2021).</li>
	<li>Gu, M., Luo, Y., He, Y., Helgeson, M. E., Valentine, M. T. Uncertainty quantification and estimation in differential dynamic microscopy. Physical Review E. 104 (3), 034610 (2021).</li>
	<li>Hoyer, S., Hamman, J. xarray: N-D labeled arrays and datasets in Python. Journal of Open Research Software. 5 (1), 10 (2017).</li>
	<li>Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. Stiffening and inelastic fluidization in vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 15 (36), 7127-7136 (2019).</li>
	<li>Guo, M. et al. The role of vimentin intermediate filaments in cortical and cytoplasmic mechanics. Biophysical Journal. 105 (7), 1562-1568 (2013).</li>
	<li>Lavenus, S. B., Tudor, S. M., Ullo, M. F., Vosatka, K. W., Logue, J. S. A flexible network of vimentin intermediate filaments promotes migration of amoeboid cancer cells through confined environments. Journal of Biological Chemistry. 295 (19), 6700-6709 (2020).</li>
	<li>Patteson, A. E. et al. Loss of vimentin enhances cell motility through small confining spaces. Small. 15 (50), 1903180 (2019).</li>
	<li>Lin, Y.-C. et al. Origins of elasticity in intermediate filament networks. Physical Review Letters. 104 (5), 058101 (2010).</li>
	<li>Pawelzyk, P., M&#252;cke, N., Herrmann, H., Willenbacher, N. Attractive interactions among intermediate filaments determine network mechanics in vitro. PLOS ONE. 9 (4), e93194 (2014).</li>
	<li>Schepers, A. V. et al. Multiscale mechanics and temporal evolution of vimentin intermediate filament networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (27), e2102026118 (2021).</li>
	<li>Wu, H. et al. Effect of divalent cations on the structure and mechanics of vimentin intermediate filaments. Biophysical Journal. 119 (1), 55-64 (2020).</li>
	<li>Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).</li>
	<li>Giavazzi, F., Malinverno, C., Scita, G., Cerbino, R. Tracking-free determination of single-cell displacements and division rates in confluent monolayers. Frontiers in Physics. 6, 120 (2018).</li>
	<li>Cho, J. H. Multiscale Probing of Colloidal Gelation Dynamics., Massachusetts Institute of Technology (2018).</li>
	<li>Krall, A. H., Weitz, D. A. Internal dynamics and elasticity of fractal colloidal gels. Physical Review Letters. 80 (4), 778-781 (1998).</li>
	<li>Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Probe microrheology without particle tracking by differential dynamic microscopy. Rheologica Acta. 56 (11), 863-869 (2017).</li>
	<li>Edera, P., Bergamini, D., Trappe, V., Giavazzi, F., Cerbino, R. Differential dynamic microscopy microrheology of soft materials: a tracking-free determination of the frequency-dependent loss and storage moduli. Physical Review Materials. 1 (7), 073804 (2017).</li>
	<li>Wang, B., Kuo, J., Bae, S. C., Granick, S. When Brownian diffusion is not Gaussian. Nature Materials. 11 (6), 481-485 (2012).</li>
	<li>soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0.&#160;Zenodo&#160;(2021).</li>
	<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li>
	<li>Nixon-Luke, R., Arlt, J., Poon, W. C. K., Bryant, G., Martinez, V. A. Probing the dynamics of turbid colloidal suspensions using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 18 (9), 1856-1867 (2022).</li>
</ol>

著者らには開示するものは何もありません。

ここで説明するソフトウェアパッケージでは、DDMを用いて、光学顕微鏡で取得した画像から観察される濃度変動を解析します。ビメンチンネットワークに埋め込まれたトレーサー粒子のデータからの代表的な結果が最初に示された。このようなデータの分析は、細胞骨格ネットワークの多くの過去の研究で単一粒子追跡がどのように使用されてきたかと同様に、ネットワークのメッシュサイズおよび剛性を特徴付けるために使用することができる6,12,13。単一粒子トラッキングよりも DDM を使用する利点は、DDM でパーティクルを局在化する必要がないことです。したがって、粒子密度が高すぎたり、粒子が小さすぎて局在化および追跡できない画像であっても、DDMは依然としてダイナミクスを決定することができます。単一粒子追跡が有利になるのは、粒子間の変動性を検査する場合です。DDMでは、アンサンブル平均ダイナミクスを見つけることができますが、単一粒子追跡では、単一粒子のMSDとアンサンブル平均MSDの両方を計算できます。ただし、DDM を使用して、広い視野内の複数の関心領域を分析することによって、異種ダイナミクスを調査できます。
次に、2つの異なる標識細胞骨格フィラメントタイプからなる活性ネットワークにおける蛍光標識フィラメントのデータからの代表的な結果が11に示された。このデータにより、弾道運動は、画像内に局在化可能な特徴を必要とせずに特徴付けられた。DDMは少数のユーザー入力でアンサンブル平均ダイナミクスを抽出するので、異なる条件で取得した画像系列の比較を容易にします(例えば、50で行われたように、微小管に対するアクチンの比率が異なるサンプルまたはミオシンの濃度が異なるサンプルの比較)。さらに、蛍光イメージングを使用して、多色標識を使用してネットワークのさまざまなコンポーネントのダイナミクスを調べることができます。これは11,50で行われ、アクチンと微小管のダイナミクスが、多色イメージングを使用してアクティブなアクチン-微小管複合ネットワークで別々に分析されました。ここでの代表的な結果欄では、微小管チャネルからの結果のみを示したが、前回の研究では、微小管フィラメントとアクチンフィラメント11の動態を比較した。
我々は、これらの代表的な結果が、受動的亜拡散または能動的弾道運動のいずれかを示していることに留意する。重要なことに、DDMは、中間の時間スケールまたは長さスケールでダイナミクスのタイプにクロスオーバーがあるシステムを分析するために使用できます。例として、KurzthalerらはDDMを活性ヤヌスコロイドの系とともに使用して、短い時間スケールでのアクティブな指向運動およびより長い時間スケールでの配向のランダム化を探求した59;Giavazziらは、DDMを粗大化した泡で使用し、気泡33の長さスケールに対応するダイナミクスのクロスオーバーを発見した。ChoらはDDMをコロイドゲルと共に使用し、フラクタルクラスターからネットワーク全体にまたがる異なる長さスケールの3つの区別可能なレジームを発見した32。
代表的な結果セクションに含まれるデータは、明視野顕微鏡およびレーザー走査共焦点顕微鏡で取得されました。ただし、前述のように、DDM は多くのイメージング モダリティで使用できます。どのようなイメージングモダリティでも、ユーザーは光学的断面の程度や被写界深度などの光学設定を考慮する必要があります。高度な光学的セクショニングは、焦点の合っていない物体からの信号を減らすかもしれないが、物体が被写界深度25,28から移動するためのタイムスケールよりも大きい時間スケールにわたってダイナミクスを正確に測定することはできない。q依存の被写界深度がDDM分析にどのように影響するかについてのより詳細な議論は、22で見つけることができます。明視野イメージングの場合、ユーザーはサンプルの厚さも考慮する必要があります。弱く散乱するサンプルの場合、より厚いサンプルはより多くのシグナル42を提供し得るが、濁ったサンプルは、複数の散乱81を考慮するように分析を修正することを必要とし得る。最後に、線形空間不変ではないイメージング方法(つまり、オブジェクトのカメラによって記録される強度が、そのオブジェクトがx-yサンプル平面内のどこにあるかに依存する)の場合、暗視野DDM27で実証されるように、線形空間分散を考慮する必要があるかもしれません。
DDMを使い始める人のために、私たちは空間的および時間的分解能を考慮することの重要性を強調したいと思います。決定された減衰時間を波数の関数として検査する場合、分解能の限界( すなわち、図5に示すように、最大および最小のラグタイムと最大波数)をマークすることが重要です。最適な対物レンズ、画像サイズ、フレームレート、およびムービーの長さを選択できるように、データを収集する前に、これらの制限について慎重に検討する必要があります。もう 1 つの重要な考慮事項は、バックグラウンド パラメーター B を推定する方法 です。バックグラウンドを推定するための複数の方法が文献で使用されており、 B を過大評価または過小評価することの効果は、先行出版物62、77に記載されている。 図 10 に示すように、PyDDM を使用すると、 B を推定するためのさまざまな方法を実装できるため、新しいユーザーはこれらの方法を試して、どれを使用するのが適切かを評価することをお勧めします。
このパッケージの強みは、サンプルデータ、解析の実行方法を追跡するためのメタデータの保存と編成、DDMマトリックスの解析方法の柔軟性(さまざまなフィッティングモデル、バックグラウンドパラメータBを推定するための複数の方法、MSDを見つける機能)を特徴とする徹底的なドキュメントとチュートリアルです。ただし、このコードには改善可能な複数の側面があります。現在、コードは高速な計算速度のために最適化されていません。計算を高速化するメソッドは61,62 件報告されており、これらは将来のリリースで実装される予定です。さらに、不確実性をより適切に推定し、ユーザーを適切なISFモデル62に導くためのシミュレーションを採用するために、最近報告された方法を実装する予定です。その他の改善点については、ユーザーがご提案をご連絡いただければ幸いです。

細胞骨格は、真核細胞の細胞質を横切って広がるタンパク質フィラメントのネットワークであり、細胞表面を核に結びつける。これは、独自の材料特性を有し、大きくて繰り返される機械的負荷に対する機械的保護を提供するだけでなく、動的セル形状変化を駆動する1。再構成された細胞骨格ネットワークは、埋め込み粒子のケージから分子モーターによって駆動される弾道運動まで、さまざまな興味深い動的挙動を生じさせることができる2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 .このようなネットワークのダイナミクスを分析する方法は、埋め込みトレーサー微小球の動きを追跡する6、7、12、13、14、経時的なタンパク質密集クラスターのサイズを追跡する画像解析8、動的光散乱15、粒子画像速度測定4、16、17、18、19を含む、経時的な画像のパワースペクトル密度を計算する19、およびカイモグラフ解析20。再構成された細胞骨格ネットワークに関する研究が進むにつれて、細胞力学を理解するにせよ活性物質を理解するにせよ、ダイナミクスを特徴付けるための堅牢で偏りのない、再現可能な方法がますます必要になっています。示差動的顕微鏡(DDM)21,22は、細胞骨格ダイナミクスの研究に使用されている比較的新しい技術であり、少数のユーザー定義パラメータでダイナミクスを効率的に定量化するそのような技術の1つです。ここで説明するソフトウェアパッケージを使用すると、プログラミングや画像解析の経験がほとんどない研究者は、DDMを自分の仕事に活用することができます。
DDMは、サンプルのダイナミクスを抽出するための画像解析技術です。粒子追跡や粒子画像速度測定と同様に、DDMは、典型的には顕微鏡で記録された時系列画像(しばしば数千枚の画像)を必要とする。粒子追跡とは異なり、個々のフィーチャやトレーサービーズは、画像内で局在化(または局在化可能)である必要はありません。粒子追跡と粒子画像速度測定の両方とは異なり、DDMでは、ユーザー指定のパラメータが比較的少ない状態でアンサンブルダイナミクスを回復します。DDMでは、画像はフーリエ空間で解析され、q(q = 2πu、uは空間周波数<img alt="Equation004" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq004.png">の大きさ)の範囲にわたる密度変動の減衰時間を決定します。人は散乱のような情報を得るが、顕微鏡21,22,23で取得した実空間画像を用いる。したがって、広視野蛍光22、24、共焦点蛍光25、偏光26、暗視野27、または明葉状蛍光28顕微鏡などの顕微鏡の様々なコントラスト発生方法を利用することができる。さらに、DDM分析に使用される画像は、相補的な情報を提供するために、粒子追跡または粒子画像速度測定に使用され得る。
動的光散乱と光学顕微鏡の機能のこの組み合わせにより、DDMは強力で汎用性の高い技術となっています。2008年のセルビーノとトラップによる最初の記述以来、DDMが73nmコロイド粒子の拡散を測定することが実証された21、DDMは、流動コロイド29、コロイド凝集30、31、ネマチック液晶26の粘弾性、コロイドゲル32のダイナミクス、粗大化フォーム33、閉じ込められた環境におけるナノ粒子34、 35、36、37、細菌運動性38、39、40、41、弱散乱タンパク質クラスター42、流体界面43での毛細血管波、および他の系の拡散。DDMを採用した出版物のより完全なリストを探している人は、主題22,23,44,45に関する徹底的なレビュー論文を参照することができます。
DDMは、生物学的ネットワークのダイナミクスを調査するためにも使用されています。DrechslerらはDDMを用いて、生きたショウジョウバエ卵母細胞におけるアクチンの動態を測定した46。Burlaらは、ヒアルロン酸およびヒアルロン酸-コラーゲン複合体のネットワークにおけるトレーサー粒子の動態を定量化した47。再構成された細胞骨格ネットワーク9,10におけるトレーサー粒子のダイナミクスを研究するためのDDMのいくつかの使用、そのようなネットワークにおけるDNA分子の輸送48,49、および活性再構成されたネットワークのダイナミクスも文書化されている11、50、51。このような系のダイナミクスを測定する際のDDMの利点は、個々の粒子または分子を局在化および追跡する必要がないことです。したがって、例えば、混雑した環境におけるDNA分子のダイナミクスは、そのような小さくて非球状の分子を追跡するのが難しいにもかかわらず、DDMで測定することができる。さらに、蛍光顕微鏡では、多色標識を使用して、複雑な複合材料中の個々の成分のダイナミクスを選択的に測定することができます。
DDM を実行するには、一連のイメージ I(x,y,t) が時間の経過と共に取得されます。所与のラグタイムΔtについて、そのラグタイムによって区切られた画像のすべての(またはサブセットの)ペアが見出される。前記各ペアの差の二乗フーリエ変換と、
<img alt="Equation007" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq007.png" style="margin-bottom: 0px;">
は一緒に計算および平均化されます。この量は、 <img alt="Equation008" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq008.png" style="margin-bottom: 0px;">ダイナミクスが等方性であることを条件に、放射状に平均化されます。これにより、DDM 行列 (イメージ構造関数とも呼ばれます) <img alt="Equation009" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq009.png" style="margin-bottom: 0px;">が生成されます。このプロセスを 図 1 にグラフィカルに示します。この DDM 行列からサンプルのダイナミクスを決定するために、DDM 行列は次の形式をとると仮定します。
<img alt="Equation010" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq010.png" style="margin-bottom: 0px;">
ここで、Aは顕微鏡の詳細とサンプルの構造に依存する振幅、Bは画像内のノイズに依存する背景、f(q、Δt)はダイナミクス21,22に関する情報を含む中間散乱関数(ISF)です。単純なケースでは、
<img alt="Equation014" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq014.png" style="margin-bottom: 0px;">
ここで、τ は特性減衰時間または非相関時間です。このようなISFは、希薄コロイド懸濁液21、24、27、37、40、52のようなエルゴード系にDDMを採用するいくつかの研究において使用されている。ただし、他の形式の ISF を使用して、さまざまな種類のダイナミクスをモデル化できます。たとえば、キュムラント展開を使用して、多分散サンプルのISFを次のようにモデル化することができます。
<img alt="Equation016" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq016.png" style="margin-bottom: 0px;">
ここで、μは多分散度の尺度である42,53;密度の変動が2つの別々のモードで減衰する場合、次のようなISFを使用できます
<img alt="Equation018" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq018.png" style="margin-bottom: 0px;">26, 54, 55, 56 , 57;
他のISFは、遊泳微生物または他の活性粒子38、39、40、41、58、59に使用することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63931/63931fig1v2.jpg"> 図 1: DDM 分析の概要 画像の時系列から、画像差のフーリエ変換が計算され、DDM行列が計算されます。DDM 行列をモデルに当てはめて、 q 値の範囲にわたる密度変動の時間スケールを決定することができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63931/63931fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ここでは、Python で開発された DDM 解析ソフトウェアパッケージ PyDDM の使用について説明します。このソフトウェアパッケージは、過去数年間に私たちの研究所やその他の出版された研究によって行われた作業に基づいています。このソフトウェアパッケージを作成する主な動機には、(1)分析で使用されるメタデータとパラメータを追跡して保存する必要性が含まれます。(2)最初から最後までの詳細な分析例を含む徹底的な文書化。(3)データをフィッティングするために異なる数学モデルを採用する(または新しい)数学モデルを使用する簡単な方法(例えば、アクティブフィラメント60用に最近開発されたようなISFモデルを追加するのは簡単です)。DDM分析用の他のソフトウェアパッケージも存在しますが、すべてが十分に文書化され、オープンソースのプログラミング言語で書かれているわけではありません。たとえば、GPU (https://github.com/peterlu/ConDDM)25 で計算する C++ コード、フーリエ変換を時間内に使用して計算を高速化する C++ コード (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61、MATLAB および Python バージョン (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40、MATLAB コード (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27、不確実性定量化 (https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62。このPyDDMパッケージは十分に文書化されており、DDMマトリックスの計算方法と分析方法に多くの柔軟性を提供するため、プログラミングや画像解析のバックグラウンドに関係なくDDMを実装しようとしている研究者にとって役立つことを願っています。
このプロトコルは、このソフトウェアパッケージを使用して 、in vitro再構成 された細胞骨格ネットワークのダイナミクスを定量化する方法を示しています。これは、(1)明視野顕微鏡で撮影したビメンチンネットワークに埋め込まれたサブミクロントレーサー粒子の画像と、(2)レーザー走査共焦点顕微鏡で撮影したミオシン駆動活性と絡み合った複合ネットワーク内の蛍光標識アクチンおよび微小管フィラメントの画像の2つの異なるイメージングデータセットを使用することによって行われます。これら2つのデータセットの分析は、さまざまなイメージングモダリティ(明視野または共焦点蛍光など)で撮影された画像を分析し、埋め込みトレーサーまたは標識フィラメントからダイナミクスを抽出し、さまざまなダイナミクス(例えば、亜拡散性および拘束性または弾道性)を定量化する機能を含む、DDMの注目すべき強みを強調しています。

<table><tbody><tr><td>CMOSカメラ、オルカフラッシュ、4.0</td>、<td>ハマツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>、F-127、プルロニック</td><td>シグマ、アルドリッチ</td><td></td><td></td>、</tr><tr><td>ジュピターノート、</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ</td><td>、サーモフィッシャー</td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>ニコン、Ti-Eclipse顕微鏡</td>、<td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>、PLL-PEG-bio</td>、<td>SuSos AG、D&uuml;ベンドルフ、スイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンビーズ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>タンパク質透析ミニカセット</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyDDM</td><td>サンディエゴ大学</td><td>N/A</td><td>https://github.com/rmcgorty/PyDDM から入手可能なオープンソースソフトウェア</td></tr></tbody></table>

微分動的顕微鏡を用いた細胞骨格ダイナミクスの定量化

Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy

細胞は、その非常にダイナミックな細胞骨格のために、這い回り、自己修復し、そしてその硬さを調整することができる。そのようなものとして、細胞骨格バイオポリマーの再構成ネットワークは、活性で適応可能な材料のホストをもたらし得る。しかし、正確に調整された特性を持つそのような材料を設計するには、ダイナミクスがネットワーク組成および合成方法にどのように依存するかを測定する必要があります。このようなダイナミクスを定量化することは、複合ネットワークの時間、空間、および定式化空間にわたる変動によって挑戦される。ここでのプロトコルは、フーリエ解析技術である微分動的顕微鏡(DDM)が生体高分子ネットワークのダイナミクスを定量化する方法を説明し、特に細胞骨格ネットワークの研究に適しています。DDMは、レーザースキャンコンフォカル、広視野蛍光、明視野イメージングなど、さまざまな顕微鏡モダリティを使用して取得した画像の時系列を処理します。このような画像シーケンスから、波動ベクトルのスパンにわたる密度変動の特徴的な非相関時間を抽出することができます。DDM分析を実行するためのユーザーフレンドリーなオープンソースのPythonパッケージも開発されています。このパッケージを使用すると、中間フィラメント(ビメンチン)ネットワークおよび活性アクチン-微小管ネットワークのデータでここで実証されているように、標識された細胞骨格成分または埋め込みトレーサー粒子のダイナミクスを測定することができます。プログラミングや画像処理の経験がないユーザーは、このソフトウェアパッケージと関連ドキュメントを使用してDDMを実行できます。

差動動的顕微鏡(DDM)は、動的光散乱と顕微鏡の機能を兼ね備えています。ここでは、DDMを使用して、ビメンチンネットワーク内の粒子の亜拡散およびケージドダイナミクスおよび活性ミオシン駆動アクチン - 微小管複合体の弾道運動を定量化することによって、再構成された細胞骨格ネットワークを特徴付けるプロセスを提示する。

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal ...

当社のプロトコルは、さまざまな光学顕微鏡技術を使用して、多くのシステムのダイナミクスを定量化できます。我々は、この方法が、特に、再構成された細胞骨格ネットワークのダイナミクスを特徴付けるのにどのように役立つかを強調する。当社の差動顕微鏡ソフトウェアパッケージを使用する主な利点は、それが十分に文書化されており、複数のサンプル分析ファイルを持ち、異なるタイプのダイナミクスを研究するために容易に適応させることができるということです。当社のソフトウェアパッケージは、再構成された細胞骨格ネットワークだけでなく、他の柔らかく生物学的に関連する材料のダイナミクスを定量化するためにも使用できます。プローブする時間と長さスケールに基づいて、Micro-Managerなどの顕微鏡制御ソフトウェアを使用して、1,000フレームを超える画像シーケンスを取得します。PyDDM コードリポジトリにある examples フォルダで、example_parameter_file.yml という名前のパラメータファイルのコピーを作成します。このEMLファイルをメモ帳+のようなテキストエディタまたはJupyterLabのテキストエディタで開きます。コピーしたEMLファイルで、解析する画像シーケンスに対応するデータディレクトリとファイル名を指定します。メタデータ セクションで、ピクセル サイズとフレーム レートを指定します。「分析パラメーター」セクションで、DDM マトリックスの計算に使用するパラメーター (異なるラグ・タイムの数や最長のラグ・タイムなど) を選択します。DDM 行列のフィッティングまたは中間散乱関数の詳細を、モデルとモデル・パラメーターの名前、初期推定値、下限、上限など、フィッティング・パラメーター・セクションに入力します。EML ファイルのファイル名を DDM 分析へのフル・ファイル・パスとともに渡すことによって、分析パラメーターにメタデータを指定して、DDM 分析クラスのインスタンスを初期化します。または、メタデータとパラメーターを Python ディクショナリ データ構造として渡します。この関数を実行して、DDM マトリックスを計算します。返されたデータを、Xarray パッケージにデータセットとして格納されている関連する変数とメタデータと共に検査します。次に、PDFファイルとデータディレクトリとして保存されているプロットと図を調べます。これらのプロットの1つは、背景の推定方法のデフォルトの方法を示しています。必要に応じて、EML ファイル内のパラメーターバックグラウンドメソッドを使用するか、またはオプションのキーワード引数として DDM 行列を計算する関数に対して、バックグラウンドを推定する方法を変更します。イメージメタデータとフィッティングパラメータを含むEMLファイルのファイル名を渡すことによって、DDM 適合クラスのインスタンスを初期化します。機能印刷継ぎ手モデルを実行して、使用可能なモデルを一覧表示します。EML パラメーター・ファイルで使用するモデルを指定するか、関数「再ロード適合モデル」を名前で使用して指定します。選択したモデル内の各パラメーターについて、関数セット・パラメーターの初期推測および設定パラメーター境界を使用して、EML ファイルで指定された値と異なる場合は、初期推測および境界を設定します。関数 fit で fit を実行します。関数適合レポートを使用して、適合パラメータのq依存性の適合度を検査するためのプロットを生成します。適合値とともに4つのq値でDDM行列またはISFを示す2×2のサブプロットを含む出力を確認してください。Jupyter ノートブック環境でクラス参照 DDM 適合を使用して、DDM 行列または ISF を、対話的な方法で最適なものと共にプロットします。減衰時間対波数プロットの点をクリックすると、データと適合度が表示されます。Xarrayデータセットに保存されたフィットの結果を確認し、関数2つのnetCDFまたはPythonの組み込みのpickleモジュールを使用して、このデータ構造をディスクに保存します。DDM分析は、ビメンチンネットワーク内の0.6ミクロンビーズの明視野画像シリーズおよびスペクトル的に異なる蛍光標識を有する活性アクチン-微小管複合ネットワークからの共焦点顕微鏡画像に対して実施した。中間散乱関数は、異なる波数でのラグタイムの関数としてプロットし、ビメンチン濃度が19マイクロモルおよび34マイクロモルのネットワークを有する。ゼロをはるかに上回る値での関数の長いラグタイムプラトーは、非人間性を示します。ビメンチン濃度の異なる2つのネットワークについてqの関数としてプロットされた崩壊時間タウは、亜拡散性または閉じ込められた運動を示す。34および49マイクロモルのビメンチンを有するネットワークについてqの二乗の関数としてプロットされた非人間性パラメータcは、cの対数が閉じ込められた運動について期待されるようにqの二乗に比例することを示した。平均二乗変位対ラグタイムプロットは、DDMから決定された値が単一粒子追跡によって見出された値とよく一致することを示した。より集中したネットワークの場合、値はより長いラグタイムで頭打ちになります。活性アクチン-微小管複合ネットワークのDDMマトリックス対ラグタイムは、特定のq値に対するDDMマトリックスが低ラグタイムでプラトーを有し、その後、大きなラグタイムでさらにプラトー化して増加したことを示した。DDM行列への適合からタウへの特徴的な減衰時間は、タウとqの関係が弾道運動を示していることを示しています。このPyDDMソフトウェアパッケージを開発した後、我々はそれを使用して、活性細胞骨格ネットワークおよび他のシステムの異方性および時間変化ダイナミクスを調査した。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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微分動的顕微鏡を用いた細胞骨格ダイナミクスの定量化

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