郭清とコロナのスライス標本マウス下垂体腺の開発

この手順の全体的な目標は、発育中のマウスから保存状態の良い組織構造を持つ適切な下垂体冠状切片を達成することです。この手順は、下垂体組織学、細胞分化、増殖、アポトーシスなど、下垂体発生の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、発生中のマウスの下垂体を目に見える損傷なしに解剖し、冠状切片を達成するために適切に方向付けることができることです。

この方法を思いついたのは、マウスの下垂体を発症するために、適切な冠状切片を得ることが技術的に難しいことがわかったときでした。テキストプロトコルに従ってマウスに麻酔をかけ、固定した後、ハサミを使用して頭蓋骨を切り開きます。次に、鉗子を使用して、頭蓋骨の基部から後脳をそっと持ち上げます。

次に、セラ・トゥルシカの最初の兆候で、持ち上げるのをやめますが、後脳を保持し、細かいハサミを使用して脳の基部に接続されている下垂体の茎と神経線維を切断します。脳全体を持ち上げて切除し続け、下垂体を完全に露出させます。下垂体は蝶形骨の背側表面にあり、三叉神経によって横方向に囲まれています。

次に、はさみを使用して、下垂体、外側三叉神経、蝶形骨の下を含むセラー領域全体を切断します。PFAを4%含有する35mmの皿に組織を入れ、4°Cで40分から3時間インキュベートします。次に、10 mLのPBSを使用して、固定組織を15分ずつ5回交換します。

固定組織をPBS1mLの入った35mm皿に移し、実体顕微鏡下で下垂体を解離します。P5からP14の下垂体の場合、細かい鉗子とハサミを使用して神経と骨の間の結合膜を取り除き、下垂体を全体として外側三叉神経と一緒に慎重に分離しますが、セラ・トゥルシカを残します。P21および成人の下垂体の場合は、下垂体の周りの神経と結合膜を取り除き、腺を周囲の組織から解放します。

脱水、キシレンの除去、およびワックスの浸潤をテキストプロトコルに従って行った後、組織包埋コンソールシステムで、カセットから試料を取り出し、溶融パラフィンワックスを半分充填したベースモールドに入れます。P21および成人の下垂体の場合は、温めた細い鉗子を使用して、下垂体をベースモールドの底面に垂直な短軸で配置します。P0からP4の下垂体の場合は、蝶形骨がベースモールドの底面に対して垂直になるように標本を向けます。

P5からP14の下垂体の場合は、三叉神経をベースモールドの底面に垂直にして標本を向けます。腺を配置した後、温めた細い鉗子を使用して、ワックスが冷却プレート上で半固体になるまで組織を希望の位置に優しく保持します。溶融したパラフィンワックスを型に補充します。

ワックスが完全に固まるまでパラフィンブロックを冷まします。パラフィンブロックをマイナス20°Cで10〜20分間冷やした後、ミクロトームで薄切りにし、切片化時にパラフィンブロックの位置を微調整します。テキストプロトコルに従って免疫標識を実施します。

このように、新生児マウスから下垂体を解剖するために、下垂体、三叉神経、その下の蝶形骨を含む全腿部を頭蓋底から解剖しました。小さくて繊細な下垂体は、プロセス中に無傷のままでした。5日齢以上のマウスについて、外側三叉神経に付着した下垂体を分離した。

P7マウスから単離された下垂体の成長構造はよく保存されていました。ここでは、P21マウスの下垂体を、周囲の組織を切除しながら、目に見える損傷なしに成功裏に分離されました。この図では、適切に配向された冠切片のH&E染色は、P0、P7、およびP21の下垂体における下垂体前葉と神経下垂体の両方の保存形態を示しています。

最後に、処理されたスライドは免疫蛍光標識にも適合しました。一例として、下垂体前葉と神経下垂体は、それぞれGHとGFAPの特異的な免疫標識を示しました。一度習得すると、解剖から埋め込みまでのプロセスは、成体マウスでは7.5時間で完了し、適切に実行すれば若いマウスではさらに短くなります。

この手順を試みるときは、手術器具で下垂体に触れないように、セラー領域全体を解剖することを忘れないでください。この手順に従って、接頭辞が付いていない下垂体も分離できます。その場合は、望ましくない損傷を避けるために、より注意を払う必要があります。

腺もできるだけ早く解剖する必要があります。このビデオを見た後、マウスの下垂体を解剖する方法と、さまざまな発達段階で下垂体冠状切片を準備する方法についてよく理解しているはずです。