郭清とコロナのスライス標本マウス下垂体腺の開発
November 16th, 2017
下垂体腺の解剖し、マウスを開発から下垂体のコロナ セクションを準備するためのプロトコルを提案します。
この手順の全体的な目標は、発育中のマウスから保存状態の良い組織構造を持つ適切な下垂体冠状切片を達成することです。この手順は、下垂体組織学、細胞分化、増殖、アポトーシスなど、下垂体発生の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、発生中のマウスの下垂体を目に見える損傷なしに解剖し、冠状切片を達成するために適切に方向付けることができることです。
この方法を思いついたのは、マウスの下垂体を発症するために、適切な冠状切片を得ることが技術的に難しいことがわかったときでした。テキストプロトコルに従ってマウスに麻酔をかけ、固定した後、ハサミを使用して頭蓋骨を切り開きます。次に、鉗子を使用して、頭蓋骨の基部から後脳をそっと持ち上げます。
次に、セラ・トゥルシカの最初の兆候で、持ち上げるのをやめますが、後脳を保持し、細かいハサミを使用して脳の基部に接続されている下垂体の茎と神経線維を切断します。脳全体を持ち上げて切除し続け、下垂体を完全に露出させます。下垂体は蝶形骨の背側表面にあり、三叉神経によって横方向に囲まれています。
次に、はさみを使用して、下垂体、外側三叉神経、蝶形骨の下を含むセラー領域全体を切断します。PFAを4%含有する35mmの皿に組織を入れ、4°Cで40分から3時間インキュベートします。次に、10 mLのPBSを使用して、固定組織を15分ずつ5回交換します。
固定組織をPBS1mLの入った35mm皿に移し、実体顕微鏡下で下垂体を解離します。P5からP14の下垂体の場合、細かい鉗子とハサミを使用して神経と骨の間の結合膜を取り除き、下垂体を全体として外側三叉神経と一緒に慎重に分離しますが、セラ・トゥルシカを残します。P21および成人の下垂体の場合は、下垂体の周りの神経と結合膜を取り除き、腺を周囲の組織から解放します。
脱水、キシレンの除去、およびワックスの浸潤をテキストプロトコルに従って行った後、組織包埋コンソールシステムで、カセットから試料を取り出し、溶融パラフィンワックスを半分充填したベースモールドに入れます。P21および成人の下垂体の場合は、温めた細い鉗子を使用して、下垂体をベースモールドの底面に垂直な短軸で配置します。P0からP4の下垂体の場合は、蝶形骨がベースモールドの底面に対して垂直になるように標本を向けます。
P5からP14の下垂体の場合は、三叉神経をベースモールドの底面に垂直にして標本を向けます。腺を配置した後、温めた細い鉗子を使用して、ワックスが冷却プレート上で半固体になるまで組織を希望の位置に優しく保持します。溶融したパラフィンワックスを型に補充します。
ワックスが完全に固まるまでパラフィンブロックを冷まします。パラフィンブロックをマイナス20°Cで10〜20分間冷やした後、ミクロトームで薄切りにし、切片化時にパラフィンブロックの位置を微調整します。テキストプロトコルに従って免疫標識を実施します。
このように、新生児マウスから下垂体を解剖するために、下垂体、三叉神経、その下の蝶形骨を含む全腿部を頭蓋底から解剖しました。小さくて繊細な下垂体は、プロセス中に無傷のままでした。5日齢以上のマウスについて、外側三叉神経に付着した下垂体を分離した。
P7マウスから単離された下垂体の成長構造はよく保存されていました。ここでは、P21マウスの下垂体を、周囲の組織を切除しながら、目に見える損傷なしに成功裏に分離されました。この図では、適切に配向された冠切片のH&E染色は、P0、P7、およびP21の下垂体における下垂体前葉と神経下垂体の両方の保存形態を示しています。
最後に、処理されたスライドは免疫蛍光標識にも適合しました。一例として、下垂体前葉と神経下垂体は、それぞれGHとGFAPの特異的な免疫標識を示しました。一度習得すると、解剖から埋め込みまでのプロセスは、成体マウスでは7.5時間で完了し、適切に実行すれば若いマウスではさらに短くなります。
この手順を試みるときは、手術器具で下垂体に触れないように、セラー領域全体を解剖することを忘れないでください。この手順に従って、接頭辞が付いていない下垂体も分離できます。その場合は、望ましくない損傷を避けるために、より注意を払う必要があります。
腺もできるだけ早く解剖する必要があります。このビデオを見た後、マウスの下垂体を解剖する方法と、さまざまな発達段階で下垂体冠状切片を準備する方法についてよく理解しているはずです。
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概要
この記事では、発育中のマウスから下垂体を解剖し、冠状面切片を準備するためのプロトコルを紹介します。この方法は、組織構造を保存しながら下垂体の発生研究を容易にすることを目的としています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 組織学
背景
- 下垂体の発育を理解することは、ホルモン調節の洞察を得るために重要です。
- 発育中のマウスの下垂体から適切な冠状面切片を得ることには課題があります。
- 組織学的分析により、細胞分化と増殖に関する情報を得ることができます。
- 解剖中に組織の完全性を保つための適切な技術が不可欠です。
研究目的
- 下垂体を解剖するための信頼性の高い方法を開発すること。
- 冠状面切片で組織構造を適切に保存すること。
- 下垂体の組織学と関連する発生プロセスの研究を容易にすること。
使用した方法
- 発育中のマウスの麻酔と固定。
- 下垂体にアクセスするための頭蓋骨の解剖。
- 損傷を避けるために後脳を慎重に持ち上げること。
- 組織学的分析のための冠状面切片の準備。
主要な結果
- このプロトコルにより、マウスの下垂体の解剖が成功裏に行えます。
- 冠状面切片は組織構造を効果的に維持します。
- この方法は下垂体の発生に関する様々な研究に適用できます。
- 結果は細胞分化とアポトーシスの理解に貢献します。
結論
- 提示されたプロトコルは、神経科学と発生生物学の研究者にとって貴重なツールです。
- これは品質の高い冠状面切片を得るための以前の課題に対処しています。
- 将来の研究では、この方法を活用して下垂体の機能と障害を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables reliable dissection and coronal sectioning of developing mouse pituitary glands, supporting endocrine and neurodevelopmental research. By preserving tissue architecture across developmental stages, it facilitates mechanistic studies of hormone-secreting cell differentiation and proliferation. The method addresses a key technical barrier in pituitary biology, improving reproducibility in preclinical target validation and biomarker discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of pituitary developmental pathways and endocrine cell specification.
- Operational Value: Provides standardized tissue preparation for consistent histological and molecular readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible coronal sections suitable for immunohistochemistry and immunofluorescence screening.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent orientation and preservation of adenohypophysis and neurohypophysis structures.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links developmental phenotypes to hormonal regulation mechanisms relevant to endocrine disorder modeling.
- Operational Value: Enables longitudinal analysis across postnatal developmental windows (P0-P21) for phenotype tracking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by providing intact pituitary tissue for downstream analysis, supporting target validation and phenotypic screening in endocrine-related disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pituitary cell differentiation and proliferation through preserved coronal sections.
- Screening: Enables quantitative immunohistochemical and immunofluorescence assays with consistent tissue morphology.
- Analytics: Facilitates morphometric and molecular readouts that allow comparison across developmental stages and experimental conditions.
- Translational Research: Connects developmental phenotypes to endocrine function, supporting preclinical modeling of pituitary-related disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable dissection and sectioning protocol applicable across multiple pituitary development studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in pituitary developmental studies by ensuring tissue integrity and section quality.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and developmental timepoints.
- Strategic Value: Reduces technical failure rates in endocrine research, improving resource efficiency and timelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in hormonal regulation pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse dissection and histological processing techniques.
- Dependent on access to microtome, embedding consoles, and histological staining infrastructure.
- Necessitates standardization of dissection timing and fixation protocols across developmental stages.
- Requires adaptation of embedding orientation based on age-specific anatomical landmarks (sphenoid bone, trigeminal nerves).
- Limited by tissue fragility in early developmental stages, necessitating careful handling to avoid damage.
