Name: 不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶマウス皮質からのシナプトニューロソーム調製法。不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用い、機械的損傷を最小限に抑えつつ翻訳活性を保持するシナプス画分を迅速に分離できます。神経科学研究に有用です。

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我々は電子顕微鏡のためのウィスコンシン大学マディソン電子顕微鏡施設の大学からBKアウグスト感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成金R01 - DA026067とP30 - HD03352（JSMへ）によってサポートされていました。

<ol><li>Westmark, C. J., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+mediates+mGluR5-dependent+translation+of+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein.</a> PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).</li>
<li>Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pin1+and+PKMzeta+sequentially+control+dendritic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis.</a> Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).</li>
<li>Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+isolation+of+synaptosomes+directly+from+an+S1+fraction%3A+Homogeneity+and+morphology+of+subcellular+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions.</a> Brain Res. 441, 59-71 (1988).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li>
<li>Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+a+filtered+synaptoneurosome+preparation+from+guinea+pig+cerebral+cortex%3A+cyclic+adenosine+3%27%3A5%27-monophosphate-generating+systems%2C+receptors%2C+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes.</a> J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).</li>
<li>Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+pre-embedding+double+immunogold-silver+labeling+at+the+ultrastructural+level%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).</li>
<li>Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+translation%3A+stepping+out+of+the+postsynaptic+shadow%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow.</a> Front. Neural Circuits. 3, (2009).</li>
<li>Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whereas+short-term+facilitation+is+presynaptic%2C+intermediate-term+facilitation+involves+both+presynaptic+and+postsynaptic+protein+kinases+and+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis.</a> Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).</li>
<li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49, 349-356 (2006).</li>
<li>Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+synthesis+of+CREB+in+a+presynaptic+neuron+is+required+for+synaptic+enhancement+involved+in+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation.</a> J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).</li>
<li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translational+control+in+dendrites+and+its+role+in+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity.</a> J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).</li>
<li>Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+rat+brain+postsynaptic+density%3A+implications+of+the+diverse+protein+functional+groups+for+the+integration+of+synaptic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology.</a> J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).</li>
<li>Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+proteomic+analysis+of+rat+forebrain+postsynaptic+density+fractions+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).</li>
<li>Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation+triggers+production+and+release+of+Alzheimer%27s+amyloid+%CE%B242+from+isolated+intact+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+ion+stimulation+triggers+protein+translation+in+synaptoneurosomal+poiyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes.</a> Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).</li>
<li>Billard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing%2C+hippocampal+synaptic+activity+and+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Magnes+Res%22%5BJournal%5D)">Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium.</a> Magnes Res. 19, 199-215 (2006).</li>
<li>Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neuronal+excitability%2C+synaptic+plasticity%2C+and+learning+in+aged+Kvbeta1.1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice.</a> Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).</li>
<li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+Age-Related+Alterations+in+Synaptic+Plasticity+by+Blockade+of+L-Type+Ca21+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels.</a> J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li>
<li>Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+kainate+receptor+agonist+ATPA+on+glutamatergic+synaptic+transmission+and+plasticity+during+early+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharm%22%5BJournal%5D)">Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development.</a> Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).</li>
<li>Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+experience-dependent+expression+of+synaptic+NMDA+receptors+in+visual+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo.</a> Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).</li>
<li>Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+control+of+proteins+synthesis+at+developing+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses.</a> Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).</li>
<li>Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+synaptoneurosomes+and+postsynaptic+densities+from+adult+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptors+trigger+postsynaptic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).</li>
<li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+nerve+endings+from+brain%3A+An+electron+microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J. Anat. 96, 79-88 (1962).</li>
<li>Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+Presynaptic+and+Postsynaptic+Markers+by+Size-Based+Gating+Analysis+of+Synaptosome+Preparations+From+Rat+and+Human+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex.</a> Cytometry A. 60, 90-96 (2004).</li>
<li>Hajós, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+preparation+of+synaptosomal+fractions+in+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity.</a> Brain Res. 93, 485-489 (1975).</li>
<li>Bai, F., Witzmann, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptosome+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Synaptosome Proteomics.</a> Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).</li>
<li>Rao, A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+protein+constituents+of+postsynaptic+membrane+specializations+are+locally+synthesized%3A+analysis+of+proteins+synthesized+within+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes.</a> J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).</li>
<li>Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPertoft%2C+H+%22Methods+of+Cell+Separation%22">Methods of Cell Separation</a>. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).</li>
<li>Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+affinity+uptake+of+L-glutamate+and+%26gamma%3B-aminobutyric+acid+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci%22%5BJournal%5D)">High affinity uptake of L-glutamate and &gamma;-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster.</a> J. Biosci. 11, 119-135 (1987).</li>
<li>Munteanu, L. S., Dinu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+granulocytes+from+whole+human+blood+by+centrifugation.+Practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Romanian+J.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints.</a> Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).</li>
<li>Cell separation composition, kit and method. US patent. , 019713 (1997).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここに記載さ不連続パーコール-ショ糖勾配の準備は、シナプス伝達の実験の様々な使用することができるアクティブなSNを、分離するために迅速、信頼性の高い方法です。 Dunkleyら、3,4によって開発された方法に基づいてこの勾配法は、互いに関連付けられている両方の前およびシナプス後膜由来の小胞を分離した細胞内脳分画の手順です。さらに精製することなくこれらのSNは免疫沈降、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、[35S]を経由して- Metの取り込み、電子顕微鏡、および酵素活性アッセイの様々なイソメラーゼを含む監視de novoのタンパク質合成を含む分子生物学的手法、さまざまな互換性がありますキナーゼ活性をアッセイ。 不連続パーコール-ショ糖勾配の手順は比較的簡単ですが、それは4でソリューションと脳の物質を維持するための鍵です° Cの準備を通して、プレチル勾配へ。ホモジネートはタンパク質分解を最小限に抑えるためにすべての回で、氷冷保存されているものの、大きな活性と優れた収量を得るためには、それはあまりにも長い間均質化する前皮質は、GM、バ...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>マイクロBCAタンパク質アッセイキット</td><td>ピアース</td><td> 23235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2で </td><td>フィッシャー</td><td> C79 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2ガス</td><td> Airgasの（UW - MDS） </td><td> CD 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー</td><td> A407SK - 4 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャー</td><td> A142 - 212 </td><td></td></tr><tr><td>パーコール</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td>フィッシャー</td><td> P285 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS - PAGEサンプル前処理キッ​​ト</td><td>ピアース</td><td> 89888 </td><td></td></tr><tr><td> NaClの</td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3の </td><td>フィッシャー</td><td> BP328 - 500 </td><td></td></tr><tr><td>のNa 2 PHO 4 </td><td>フィッシャー</td><td> S381 - 500 </td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td>テトロドトキシン</td><td>シグマ</td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td>エクスプレスProのラベルには、S35簡単タグをミックス</td><td>パーキンエルマー</td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th>機器の</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>解剖ツール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダウンスホモジナイザー、7 mLの（二枚のガラスに付属する&quot;A&quot;と&quot;B&quot;とラベルされた乳棒） </td><td>ホイートン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000ギルソンPipetman </td><td>ギルソン</td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td>アレグラ6KR遠心機</td><td>ベックマンコールター</td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH 3.8ロータ、スイングバケットローター</td><td>ベックマンコールター</td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td>ベックマンJ2 - 21遠心</td><td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キャップ付きベックマンチューブ</td><td>ベックマン</td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td>白壁のアダプタ</td><td>ベックマン</td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td>青い壁のアダプター</td><td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA - 17ローター、固定アングルローター</td><td>ベックマン</td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table>ウエスタンブロットのために使用される抗体の表： <table border="1"><tbody><tr><th>抗体の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>宿主動物種</th><th>希釈係数</th></tr><tr><td> β-アクチン</td><td>シグマ</td><td> A5441 </td><td>マウスを</td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 65343 </td><td>マウスを</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 134509 </td><td>ウサギ</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 7298 </td><td>マウスを</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 6261 </td><td>ヤギ</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitin </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 28259 </td><td>ウサギ</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td>ミリポア</td><td> MAB1596 </td><td>マウスを</td><td> 5μgの/μL </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td>アブカム</td><td> ab5666 - 100 </td><td>ウサギ</td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td>シナプトフィジン</td><td>ミリポア</td><td> MAB368 </td><td>マウスを</td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β- 3 -チューブリン</td><td>サンタクルス</td><td> SC - 80016 </td><td>マウスを</td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からsynaptoneurosomesの調製

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes（SNS）は、マウス脳皮質の均質化と分別の後に得られる。彼らは、小胞または皮質組織が均質化されたときに軸索末端からの脱却孤立端末が再シールされています。 SNはシナプス伝達の研究に有用になる前と後シナプスの特性を、保持する。彼らは神経シグナリングで使用されている分子機構を保持して取り込み、ストレージ、および神経伝達物質の放出が可能です。 アクティブなSNの生産と分離は、細胞毒性になるとSNの機械的損傷に起因する低活性につながる可能性の拡張、高密度のために遠心分離し、ろ過と遠心分離の方法を、必要とすることができるフィコール、のような問題に使用してマスコミのすることができます。しかし、SNを分離するために、不連続パーコール-ショ糖密度勾配の使用は、並進アクティブSNの良好な収率を生成するために迅速な方法を提供する。パーコール-ショ糖密度勾配法では、等張性の条件を採用して、迅速かつ穏やかであり少ないと短い遠心分離スピンを持っており、ペレット、SNSとは、機械的損傷を引き起こすことに遠心操作を避けることができます。

マウス脳皮質から翻訳後のアクティブな、無傷のsynaptoneurosomes（SNS）を準備する方法について説明する。方法は、アクティブなSNの迅速な作成を可能にする不連続パーコール-ショ糖密度勾配を使用しています。

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

シナプトニューロソーム（SN）は、マウス脳皮質のホモジナイズおよび分画後に得られる。これらは、再封鎖された小胞または単離された末端であり、...

この手順の目的は、不連続ショ糖密度勾配を用いて、マウス脳皮質から翻訳活性を持つシナプトニューロゾームを調製することです。まず、マウスの皮質を回収してホモジナイズし、次にそのホモジネートを遠心分離します。その後、遠心分離後のホモジネート（上清）を、あらかじめ調製したショ糖勾配に添加します。最終ステップは、遠心分離してシナプトソーム画分を回収することです。最終的に、ウェスタンブロット分析および S 35 メチオニン取り込み実験により、シナプトソーム画分がシナプス成分を豊富に含み、翻訳活性を有していることが示されます。遠心分離やろ過などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、第一に、密度勾配を利用することで機械的な損傷が回避されること、第二に、Percoll が細胞およびその構成成分に対して低毒性であることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、タイミングが極めて重要であるため、このプロトコルに苦労することがあります。皮質を回収した後は、速やかに操作を完了させる必要があります。操作を開始するには、付随する論文に記載されている通り、GMバッファーに規定量のSIPを加えて、3%、10%、15%、23%の勾配層を調製し、よく混合します。15%、10%、および3%の等張ペロール溶液を、それぞれ2 mLずつピペッティングして、キャップ付きのBeckman遠心管に層状に注ぎます。P1000ピペットを使用し、各層の界面が明確に判別でき、層同士が混ざり合わないようにします。作製した勾配溶液は、使用前に4 °Cで少なくとも20分間静置してください。本手順を開始する前に、付随する論文の記載に従い、その他の必要な溶液を準備してください。P 13からP 21のマウスを安楽死させ、首の後ろと頭部に70% ethanolをスプレーして解剖の準備をします。その後、鋭い鋏を用いて、頭蓋底で脊髄を切断します。次に、頭蓋骨上部の皮膚を取り除きます。頭頂骨と間頭頂骨の間、または大脳と皮質領域の間で、頭蓋骨を側方から切開します。その後、矢状縫合に沿って頭蓋底から鼻に向かって頭蓋骨を切開します。このステップでは、各半球を横に引いて、柔らかい頭頂骨を注意深く除去します。その後、小脳の上の脳にスパチュラを挿入し、皮質を掻き出します。それを氷冷GMバッファーに入れ、さらに皮質を回収するために同様の手順を繰り返します。次に、皮質を氷冷GMバッファーで洗浄します。その後、2つの皮質を5 mLの冷GMバッファーを含むグラス・ダウン・ホモジナイザーに移します。まず緩いペスルのペスルAで5〜10回、続いて密着型のペスルBで5〜10回、皮質を穏やかにホモジナイズします。ストローク数は、使用するホモジナイザーによって異なります。ホモジナイズした検体を15 mLコニカルチューブに移します。1000 ×gで遠心分離します。細胞破片と核をペレット化するため、Allegra six KR遠心機を用いて4 °Cで10分間遠心分離します。各ペルオキシソームまたはスクロース密度勾配に対し、上清を2 mLずつ重ねて加え、チューブにキャップをします。その後、Beckman J 2 21遠心機の固定角ローターを用い、4 °Cで32,500 ×gで5分間遠心分離します。完了後、適切なアダプターを使用して、グラジエントにより強いSNバンドが得られていることを確認し、SNバンドより上の溶液をピペットで吸い出して廃棄します。ガラスパスタピペットを用いて、15%から23%の界面にあるSNバンドを吸い出します。通常、1回のグラジエントで約0.9から1.1 mLのSNが得られます。その後、円錐チューブに移し、氷上で保存します。次に、10倍濃度の刺激バッファーを全量の10分の1量添加し、SNSの塩濃度を調整します。必要に応じて、最終濃度が12 nMとなるように塩化カルシウム（1000倍濃度）を添加します。続いて、非特異的な興奮を抑制するため、最終濃度が1 µMとなるように1 mMのTTXストック溶液を添加します。次のステップは、タンパク質翻訳研究などの適切なダウンストリームアプリケーションにSNSを使用することです。その他のアプリケーションでは、Pierce SDS page sample prep kitを用いてSN溶解液を精製または濃縮させることができます。SNSのタンパク質濃度は、micro BCA protein assay kitを用いて測定できます。ここに6つのバンドまたは分画の例を示します。マウス皮質をホモジナイズし、不連続ペルオキシドショ糖密度勾配遠心法で分離したところ、濃縮されたSNSは23～15%界面のバンド5に含まれていました。このバンドを回収し、電子顕微鏡で観察しました。完全なシナプス小胞の例、およびシナプス前・後要素の保持が、こちらのウェスタンブロットに示されています。不連続スクロース密度勾配分画におけるSNバンドのシナプスマーカーの増加と不純物の減少が示されており、グルタミン酸添加による S 35 methionine 取り込みの増加が、新規タンパク質合成によるものであることが確認されています。タンパク質合成阻害剤である 40 micromolar のアニソマイシンを添加しました。この図は、基底レベルと比較して、グルタミン酸の有無にかかわらず、アニソマイシンの存在下で S 35 methionine の取り込みが著しく減少することを示しています。したがって、不連続パーコアショクロース密度勾配を用いて、タンパク質翻訳の研究に使用可能な、活性が高く比較的純度の高いSNSを迅速に調製することができます。この図は、不連続パーコアショクロース密度勾配のバンド5に、最も高いレベルのde novoタンパク質合成能が含まれていることを示しています。比較として、均質化した皮質を孔径の小さい順に一連のフィルターに通した後、不連続パーコアショクロース密度勾配で遠心分離して調製したSNSには、不連続パーコアショクロース密度勾配法で調製したSNSよりも破砕膜が多く、完全なSNSが少なくなっています。不連続パーコアショクロース密度勾配法を用いて調製したSNSは、ろ過法を用いて調製したSNSよりもde novoタンパク質合成活性が高いことが示されています。若齢マウスから調製したSNSは、高齢マウスよりも翻訳活性が高いことが示されています。このビデオを視聴することで、マウス皮質をホモジナイズし、スイングバケットローターでホモジネートを遠心分離し、さらに固定角ローターで上清をショ糖密度勾配遠心し、得られたシナプトニューロゾームバンドを回収することで、翻訳活性を持つシナプトニューロゾームを単離する方法を十分に理解できるはずです。

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

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