不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

この手順の全体的な目標は、不連続なペラルスクロース密度勾配を使用して、マウス脳皮質からニューロゾーンへの並進活性シナプを準備することです。これは、最初にマウス皮質を収集して均質化し、次にホモジネートを遠心分離することによって達成されます。これに続いて、遠心分離機のホモジネートまたはsup natantをpreportper coスクロース勾配に適用します。

最後のステップは、シナプトソーム画分を遠心分離して収集することです。最終的に、ウェスタンブロット分析およびS 35メチオニン取り込み実験により、シナプトソーム画分がシナプス的に濃縮され、翻訳活性を有することが示された。遠心分離やろ過などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、密度勾配を利用することで最初の機械的損傷を回避し、2番目の呼び出しごとに、その構成成分内の細胞に対する毒性が低いことです。

一般的に、この方法に不慣れな人は、タイミングが重要な役割を果たすため、このプロトコルに苦労します。皮質が採取されたら、手順は迅速に完了する必要があります。手順を開始するには、添付の原稿に記載されている各量のSIPをGMバッファーに追加して、3、10、15、および23%のグラデーション層を準備し、よく混合します。

23種類の15、10、および3%等価ペロール溶液のそれぞれから2ミリリットルをキャップ付きベックマン遠心分離管にピペットで注入し、グラジエント層を注ぎます。P 1000ピペットを使用すると、層間の界面がはっきりと識別でき、層が混ざり合わずにいなければなりません。使用前に少なくとも20分間摂氏4度の勾配を保管してください。

この手順を開始する前に、添付の原稿に記載されているように、他の必要な解決策を準備してください。マウスをP13〜P21の年齢で安楽死させ、首の後ろと頭に70%エタノールを噴霧して解剖の準備をします。次に、鋭利なハサミを使用して、頭蓋骨の付け根にある脊髄を切り抜きます。

次に、頭蓋骨の上部から皮膚を取り除きます。頭蓋骨を頭頂骨と頭頂間骨の間、または大脳と皮質領域の間を横方向に切ります。その後、矢状縫合糸に沿って頭蓋骨の基部から鼻まで切り込みます。

このステップでは、各半球を横に引っ張って、柔らかい頭頂骨を慎重に取り除きます。その後、小脳の上の脳にヘラを挿入して皮質をすくい取ります。氷冷したGMバッファーに入れ、より多くの皮質を収集するために手順を再度繰り返します。

次に、氷冷したGMバッファーで皮質をすすぎます。次に、2つの皮質を5ミリリットルの冷たいGMバッファーを含むガラスダウンホモジナイザーに移します。5〜10ストロークの乳棒A、緩い乳棒、続いて5〜10ストロークの乳棒B、タイプ乳棒で皮質を穏やかに均質化します。

ストローク数は、個々のホモジナイザーによって異なります。ホモジネートを15ミリリットルの円錐管に移します。1000回で遠心分離します。

Allegra six KR遠心分離機で摂氏4度で10分間重力をかけ、細胞の破片と核をペレット化します。各皮質またはスクロース勾配ごとに2ミリリットルのスピネートを層状にし、皮質全体ごとに1つの勾配でチューブをキャップします。次に、Beckman J 2 21遠心分離機で、重力32、500倍の重力で摂氏4度で5分間、固定角ローターで遠心分離します。

グラジエントが完了したら、適切なアダプターを使用して、強力なSNバンドピペットをオフにし、SNバンドの上の溶液を廃棄する必要があります。ガラスパスタピペットを使用して、15〜23%界面でSNバンドからピペットをオフにすると、1つのグラジエントは一般に約0.9〜1.1ミリリットルのsnsを与えます。その後、円錐形のチューブに移し、氷の上に保管します。

次に、10倍刺激バッファーの10分の1ボリュームを追加してSNSの塩分濃度を調整します。オプションで、塩化カルシウムを1000倍加えて、最終濃度を12ナノモルにします。次に、1ミリモルのTTXストックを添加して最終濃度を1マイクロモルにすると、非特異的な興奮が抑制されます。

次のステップは、タンパク質翻訳研究など、適用可能なダウンストリームアプリケーションでSNSを使用することです。その他のアプリケーションでは、Pierce SDSページサンプル調製キットを使用してSNライセートをクリーンアップまたは濃縮することができます。SNSのタンパク質濃度は、micro BCAタンパク質アッセイキットを使用して決定できます。

これは、6 つのバンドまたは分数の例です。マウス皮質を均質化し、不連続なペロールスクロース勾配で分離したとき、濃縮されたSNSはバンド5の23〜15%界面に含まれており、このバンドは除去され、電子顕微鏡法によって調べられました。無傷のシナプス小胞の例と、シナプス前およびシナプス後要素の保存がウェスタンブロットで示されています。

ナプスマーカーの増加およびスクロース当たりの不連続勾配によるSNバンド中の不純物の減少は、グルタミン酸の添加によるS35メチオニン取り込みの増加がde novoタンパク質合成によるものであることを確認するために示されている。この図は、グルタミン酸が存在するかどうかにかかわらず、アンソマイシンの存在下でのS 35メチオニン取り込みの顕著な減少を示しています。

したがって、不連続なペラルスクロースグラジエントは、タンパク質翻訳の研究に使用できる、非常に活性で比較的純粋なSNSを迅速に生成します。この図は、コアごとの不連続なショ糖グラジエントのバンド5に、最高レベルのde novoタンパク質合成が含まれていることを示しています。均質化された皮質を細孔径を小さくした一連のフィルターに通し、次に不連続なコア毎のショ糖勾配を遠心分離して比較することにより調製されたSNSは、不連続なペロールショ糖勾配法から調製されたSNSよりも多くの壊れた膜を含み、全体のSNSは、不連続なペラルショ糖勾配法を使用して調製されたSNSは、ろ過法を使用して調製されたSNSよりも多くのde novoタンパク質合成活性を含むことが示されています。

若いマウスから調製したSNSは、高齢のマウスよりも翻訳活性が高いことが示されています。このビデオを見た後、マウスの皮質を均質化してスイングバケットローターでホモジネートを遠心分離し、固定角度ローターで上清をコールごとのショ糖勾配で遠心分離し、結果として生じるシナプス神経ゾーンバンドを収集することにより、翻訳活性シナプス神経ゾーンを分離する方法についてよく理解できるはずです。