Name: 不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶマウス皮質からのシナプトニューロソーム調製法。不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用い、機械的損傷を最小限に抑えつつ翻訳活性を保持するシナプス画分を迅速に分離できます。神経科学研究に有用です。

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我々は電子顕微鏡のためのウィスコンシン大学マディソン電子顕微鏡施設の大学からBKアウグスト感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成金R01 - DA026067とP30 - HD03352（JSMへ）によってサポートされていました。

<ol><li>Westmark, C. J., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+mediates+mGluR5-dependent+translation+of+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein.</a> PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).</li>
<li>Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pin1+and+PKMzeta+sequentially+control+dendritic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis.</a> Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).</li>
<li>Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+isolation+of+synaptosomes+directly+from+an+S1+fraction%3A+Homogeneity+and+morphology+of+subcellular+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions.</a> Brain Res. 441, 59-71 (1988).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li>
<li>Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+a+filtered+synaptoneurosome+preparation+from+guinea+pig+cerebral+cortex%3A+cyclic+adenosine+3%27%3A5%27-monophosphate-generating+systems%2C+receptors%2C+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes.</a> J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).</li>
<li>Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+pre-embedding+double+immunogold-silver+labeling+at+the+ultrastructural+level%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).</li>
<li>Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+translation%3A+stepping+out+of+the+postsynaptic+shadow%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow.</a> Front. Neural Circuits. 3, (2009).</li>
<li>Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whereas+short-term+facilitation+is+presynaptic%2C+intermediate-term+facilitation+involves+both+presynaptic+and+postsynaptic+protein+kinases+and+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis.</a> Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).</li>
<li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49, 349-356 (2006).</li>
<li>Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+synthesis+of+CREB+in+a+presynaptic+neuron+is+required+for+synaptic+enhancement+involved+in+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation.</a> J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).</li>
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<li>Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+proteomic+analysis+of+rat+forebrain+postsynaptic+density+fractions+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).</li>
<li>Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation+triggers+production+and+release+of+Alzheimer%27s+amyloid+%CE%B242+from+isolated+intact+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+ion+stimulation+triggers+protein+translation+in+synaptoneurosomal+poiyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes.</a> Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).</li>
<li>Billard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing%2C+hippocampal+synaptic+activity+and+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Magnes+Res%22%5BJournal%5D)">Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium.</a> Magnes Res. 19, 199-215 (2006).</li>
<li>Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neuronal+excitability%2C+synaptic+plasticity%2C+and+learning+in+aged+Kvbeta1.1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice.</a> Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).</li>
<li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+Age-Related+Alterations+in+Synaptic+Plasticity+by+Blockade+of+L-Type+Ca21+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels.</a> J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li>
<li>Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+kainate+receptor+agonist+ATPA+on+glutamatergic+synaptic+transmission+and+plasticity+during+early+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharm%22%5BJournal%5D)">Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development.</a> Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).</li>
<li>Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+experience-dependent+expression+of+synaptic+NMDA+receptors+in+visual+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo.</a> Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).</li>
<li>Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+control+of+proteins+synthesis+at+developing+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses.</a> Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).</li>
<li>Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+synaptoneurosomes+and+postsynaptic+densities+from+adult+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).</li>
<li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptors+trigger+postsynaptic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).</li>
<li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+nerve+endings+from+brain%3A+An+electron+microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J. Anat. 96, 79-88 (1962).</li>
<li>Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+Presynaptic+and+Postsynaptic+Markers+by+Size-Based+Gating+Analysis+of+Synaptosome+Preparations+From+Rat+and+Human+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex.</a> Cytometry A. 60, 90-96 (2004).</li>
<li>Hajós, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+preparation+of+synaptosomal+fractions+in+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity.</a> Brain Res. 93, 485-489 (1975).</li>
<li>Bai, F., Witzmann, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptosome+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Synaptosome Proteomics.</a> Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).</li>
<li>Rao, A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+protein+constituents+of+postsynaptic+membrane+specializations+are+locally+synthesized%3A+analysis+of+proteins+synthesized+within+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes.</a> J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).</li>
<li>Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPertoft%2C+H+%22Methods+of+Cell+Separation%22">Methods of Cell Separation</a>. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).</li>
<li>Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+affinity+uptake+of+L-glutamate+and+%26gamma%3B-aminobutyric+acid+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci%22%5BJournal%5D)">High affinity uptake of L-glutamate and &gamma;-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster.</a> J. Biosci. 11, 119-135 (1987).</li>
<li>Munteanu, L. S., Dinu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+granulocytes+from+whole+human+blood+by+centrifugation.+Practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Romanian+J.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints.</a> Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).</li>
<li>Cell separation composition, kit and method. US patent. , 019713 (1997).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここに記載さ不連続パーコール-ショ糖勾配の準備は、シナプス伝達の実験の様々な使用することができるアクティブなSNを、分離するために迅速、信頼性の高い方法です。 Dunkleyら、3,4によって開発された方法に基づいてこの勾配法は、互いに関連付けられている両方の前およびシナプス後膜由来の小胞を分離した細胞内脳分画の手順です。さらに精製することなくこれらのSNは免疫沈降、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、[35S]を経由して- Metの取り込み、電子顕微鏡、および酵素活性アッセイの様々なイソメラーゼを含む監視de novoのタンパク質合成を含む分子生物学的手法、さまざまな互換性がありますキナーゼ活性をアッセイ。 不連続パーコール-ショ糖勾配の手順は比較的簡単ですが、それは4でソリューションと脳の物質を維持するための鍵です° Cの準備を通して、プレチル勾配へ。ホモジネートはタンパク質分解を最小限に抑えるためにすべての回で、氷冷保存されているものの、大きな活性と優れた収量を得るためには、それはあまりにも長い間均質化する前皮質は、GM、バ...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>マイクロBCAタンパク質アッセイキット</td><td>ピアース</td><td> 23235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2で </td><td>フィッシャー</td><td> C79 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2ガス</td><td> Airgasの（UW - MDS） </td><td> CD 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー</td><td> A407SK - 4 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャー</td><td> A142 - 212 </td><td></td></tr><tr><td>パーコール</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td>フィッシャー</td><td> P285 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS - PAGEサンプル前処理キッ​​ト</td><td>ピアース</td><td> 89888 </td><td></td></tr><tr><td> NaClの</td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3の </td><td>フィッシャー</td><td> BP328 - 500 </td><td></td></tr><tr><td>のNa 2 PHO 4 </td><td>フィッシャー</td><td> S381 - 500 </td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td>テトロドトキシン</td><td>シグマ</td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td>エクスプレスProのラベルには、S35簡単タグをミックス</td><td>パーキンエルマー</td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th>機器の</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>解剖ツール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダウンスホモジナイザー、7 mLの（二枚のガラスに付属する&quot;A&quot;と&quot;B&quot;とラベルされた乳棒） </td><td>ホイートン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000ギルソンPipetman </td><td>ギルソン</td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td>アレグラ6KR遠心機</td><td>ベックマンコールター</td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH 3.8ロータ、スイングバケットローター</td><td>ベックマンコールター</td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td>ベックマンJ2 - 21遠心</td><td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キャップ付きベックマンチューブ</td><td>ベックマン</td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td>白壁のアダプタ</td><td>ベックマン</td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td>青い壁のアダプター</td><td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA - 17ローター、固定アングルローター</td><td>ベックマン</td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table>ウエスタンブロットのために使用される抗体の表： <table border="1"><tbody><tr><th>抗体の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>宿主動物種</th><th>希釈係数</th></tr><tr><td> β-アクチン</td><td>シグマ</td><td> A5441 </td><td>マウスを</td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 65343 </td><td>マウスを</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 134509 </td><td>ウサギ</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 7298 </td><td>マウスを</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 6261 </td><td>ヤギ</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitin </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 28259 </td><td>ウサギ</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td>ミリポア</td><td> MAB1596 </td><td>マウスを</td><td> 5μgの/μL </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td>アブカム</td><td> ab5666 - 100 </td><td>ウサギ</td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td>シナプトフィジン</td><td>ミリポア</td><td> MAB368 </td><td>マウスを</td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β- 3 -チューブリン</td><td>サンタクルス</td><td> SC - 80016 </td><td>マウスを</td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からsynaptoneurosomesの調製

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes（SNS）は、マウス脳皮質の均質化と分別の後に得られる。彼らは、小胞または皮質組織が均質化されたときに軸索末端からの脱却孤立端末が再シールされています。 SNはシナプス伝達の研究に有用になる前と後シナプスの特性を、保持する。彼らは神経シグナリングで使用されている分子機構を保持して取り込み、ストレージ、および神経伝達物質の放出が可能です。 アクティブなSNの生産と分離は、細胞毒性になるとSNの機械的損傷に起因する低活性につながる可能性の拡張、高密度のために遠心分離し、ろ過と遠心分離の方法を、必要とすることができるフィコール、のような問題に使用してマスコミのすることができます。しかし、SNを分離するために、不連続パーコール-ショ糖密度勾配の使用は、並進アクティブSNの良好な収率を生成するために迅速な方法を提供する。パーコール-ショ糖密度勾配法では、等張性の条件を採用して、迅速かつ穏やかであり少ないと短い遠心分離スピンを持っており、ペレット、SNSとは、機械的損傷を引き起こすことに遠心操作を避けることができます。

マウス脳皮質から翻訳後のアクティブな、無傷のsynaptoneurosomes（SNS）を準備する方法について説明する。方法は、アクティブなSNの迅速な作成を可能にする不連続パーコール-ショ糖密度勾配を使用しています。

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

シナプトニューロソーム（SN）は、マウス脳皮質のホモジナイズおよび分画後に得られる。これらは、再封鎖された小胞または単離された末端であり、...

この手順の目的は、不連続ショ糖密度勾配を用いて、マウス脳皮質から翻訳活性を持つシナプトニューロゾームを調製することです。まず、マウスの皮質を回収してホモジナイズし、次にそのホモジネートを遠心分離します。その後、遠心分離後のホモジネート（上清）を、あらかじめ調製したショ糖勾配に添加します。最終ステップは、遠心分離してシナプトソーム画分を回収することです。最終的に、ウェスタンブロット分析および S 35 メチオニン取り込み実験により、シナプトソーム画分がシナプス成分を豊富に含み、翻訳活性を有していることが示されます。遠心分離やろ過などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、第一に、密度勾配を利用することで機械的な損傷が回避されること、第二に、Percoll が細胞およびその構成成分に対して低毒性であることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、タイミングが極めて重要であるため、このプロトコルに苦労することがあります。皮質を回収した後は、速やかに操作を完了させる必要があります。操作を開始するには、付随する論文に記載されている通り、GMバッファーに規定量のSIPを加えて、3%、10%、15%、23%の勾配層を調製し、よく混合します。15%、10%、および3%の等張ペロール溶液を、それぞれ2 mLずつピペッティングして、キャップ付きのBeckman遠心管に層状に注ぎます。P1000ピペットを使用し、各層の界面が明確に判別でき、層同士が混ざり合わないようにします。作製した勾配溶液は、使用前に4 °Cで少なくとも20分間静置してください。本手順を開始する前に、付随する論文の記載に従い、その他の必要な溶液を準備してください。P 13からP 21のマウスを安楽死させ、首の後ろと頭部に70% ethanolをスプレーして解剖の準備をします。その後、鋭い鋏を用いて、頭蓋底で脊髄を切断します。次に、頭蓋骨上部の皮膚を取り除きます。頭頂骨と間頭頂骨の間、または大脳と皮質領域の間で、頭蓋骨を側方から切開します。その後、矢状縫合に沿って頭蓋底から鼻に向かって頭蓋骨を切開します。このステップでは、各半球を横に引いて、柔らかい頭頂骨を注意深く除去します。その後、小脳の上の脳にスパチュラを挿入し、皮質を掻き出します。それを氷冷GMバッファーに入れ、さらに皮質を回収するために同様の手順を繰り返します。次に、皮質を氷冷GMバッファーで洗浄します。その後、2つの皮質を5 mLの冷GMバッファーを含むグラス・ダウン・ホモジナイザーに移します。まず緩いペスルのペスルAで5〜10回、続いて密着型のペスルBで5〜10回、皮質を穏やかにホモジナイズします。ストローク数は、使用するホモジナイザーによって異なります。ホモジナイズした検体を15 mLコニカルチューブに移します。1000 ×gで遠心分離します。細胞破

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、後期胚と早期出生後のマウス皮質からニューロン培養を生成するための手順を示しています。これらの培養物は、免疫細胞化学、生化学、電気生理学、カルシウムとナトリウムのイメージングに使用され、出生後致死遺伝子の突然変異を運ぶトランスジェニック動物の神経発達を研究するためのプラットフォームを提供することができます。...

解離マウス皮質ニューロンの培養の準備

このビデオでは、脳卒中研究における炎症応答を研究するために、脳細胞と浸潤性マウスの脳組織から脳細胞と浸潤免疫細胞を酵素消化によって分離し、続いて密度勾配遠心分離によって細胞残骸とミエリンを除去する手順を示しています。...

虚血性マウス脳組織からの細胞懸濁液の取得

出典: Lunelli, L., et.al. 原子間力顕微鏡で脳ポリソームを覗き込む. J. Vis.

原子間力顕微鏡を用いたマウス脳から単離されたポリソームのイメージング

この記事では、不連続スクロース勾配超遠心分離によってシナプス形質膜に関連するタンパク質の濃縮を詳しく説明します。シナプス後肥厚タンパク質のその後の調製も記載されている。タンパク質調製物は、ウェスタンブロットまたは2D DIGE分析に適している。...

不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製

リボソームの構造は広範囲に特徴付けられていますが、ポリソームの組織化はまだ十分に研究されていません。この知識不足を克服するために、ここでは、空気中および液体中の原子間力顕微鏡(AFM)による哺乳類のポリソームの正確なイメージングのための詳細な準備プロトコルを示します。...

原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

シナプスの可塑性と記憶を制御する分子と経路の同定は、神経科学における依然として大きな課題です。ここでは、聴覚学習パラダイムにおける学習および記憶の固定化中にシナプスの分子再編成に関与すると思われるシナプスタンパク質の相対定量化に対処するワークフローについて説明します。...

聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング

ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。...

脳膜分画：<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

我々は、マウス脳ペリサイトの抽出のためのプロトコルを提示する。抗生物質フリー濃縮指向のペリサイト抽出に基づいて、このプロトコルは、高純度と高収率を提供するインビトロ研究のための貴重なツールであり、したがって、使用される実験動物の数を減少させる。...

マウスから脳ペリサイトを分離する高出力法

哺乳類の脳の発達には、翻訳のレベルでの遺伝子発現の適切な制御が必要です。ここでは、発達中の脳におけるmRNAの翻訳状態を評価するための、組み立て易いショ糖勾配および分画プラットフォームを備えたポリソームプロファイリングシステムについて説明する。...

ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析

このプロトコルは、マウスの脳から高純度のシナプトソーム、シナプス小胞、およびその他のシナプス画分を取得するための堅牢で詳細な方法を提供します。この方法は、タンパク質の局在と機能の生化学的分析を含むシナプスプロセスのコンパートメント分解能での評価を可能にします。...

マウス脳からのシナプス成分の単離のための細胞内分画

学ぶマウス皮質からのシナプトニューロソーム調製法。不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用い、機械的損傷を最小限に抑えつつ翻訳活性を保持するシナプス画分を迅速に分離できます。神経科学研究に有用です。

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

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