喀痰誘発および実験室の処理のための方法論
2017年12月17日
ここで喀痰誘発の手法について述べる。このプロトコルは、喀痰処理差分セル数を数えるために、喀痰培養上清を収集するために、さらなる分析のための細胞にも説明します。
誘発された痰の技術は、90年代初頭に開発されました。この技術は、喘息、COPD などの閉塞性気道疾患の新しい情報を調査するために提案され、最近では肺線維症の新しい情報を調べることにも関心が寄せられています。この技術の主な利点は、気管支鏡検査とは対照的に、比較的非侵襲的であることです。
この処理には実験室での作業が必要で、時間がかかるため、かなり要求が厳しく、時間がかかり、実験室での専門知識が必要で、どのセンターでも入手するのが難しい技術であることは明らかです。誘発された喀痰の技術は2つの部分で構成されており、最初の部分は誘導であり、2番目の部分は処理です。喀痰を誘発する前に、患者が生成できる量と流量の評価である肺活量測定を実施する必要があります。
そして、喀痰の誘発自体が気管支痙攣を引き起こす可能性があるため、患者の肺活量測定のベースライン値を絶対に知る必要があります。そこで、最初に肺活量測定を行い、次に患者に気管支拡張薬を投与し、通常は400マイクログラムのサルブタモールを投与して、患者の気道を最大限に開き、導入期に発生する可能性のある気管支痙攣を予防します。そして15分後、再び肺活量測定を測定し、肺活量測定のベースライン値、特に患者が1秒以内に吐き出すことができる量であるFEV1を調べます。
推奨レベルまで蒸留水をネブライザーチャンバーに注ぎます。ネブライザーチャンバーにきれいなカップを置きます。充填されたキャップを適切な蓋で覆います。
気管支拡張薬後のFEV1が予測された65%を超える場合は50mLの高張生理食塩水、気管支拡張薬後のFEV1が予測された65%未満の場合は50mLの等張生理食塩水9%でカップを満たします。1.75サルブタモール硫酸塩溶液を5ミリグラム/mlの濃度でカップに加えます。メーカーの指示に従ってチューブとバルブを接続します。
この技術は、医師の監督の下で実行する必要があります。患者に検査の原理を説明します。患者にノーズクリップを使用するように依頼します。
ネブライザーを始動し、エアロゾルとファンの設定の最低レベルを選択します。患者にマウスピースからエアロゾルを吸い込み、潮汐呼吸をするように依頼します。.エアロゾルとファンの設定のレベルは、患者の耐性に応じて増加する場合があります。
呼吸器系の不快感による胸部の圧迫感がある場合は、処置を中止し、肺活量測定を行って患者のFEV1値を測定します。吸入から5分後、または咳や吐き気がある場合は、ネブライザーを停止してください。ノーズクリップを外し、口をすすぎ、水道水で2回うがいをし、この水を流しに捨てるように患者に依頼してください。
その後、患者が喀咳をして咳き込み、プラスチック容器に喉から出ているものを吐き出します。FEV1を測定するために、最初の呼吸操作を行います。喀痰産生の各暫定的な後、FEV1 値を測定します。
FEV1 値が 20% 以上低下した場合、手順を停止し、患者に臭化イプラトロピウムの噴霧を行います。これは、手順中にすでに投与したベータ 2 アゴニストと組み合わせて作用する抗コリン作用薬です。FEV1値が20%以上低下しない場合は、患者が生成する痰の質と量に応じて、合計10〜20分間手順を続行します。喀痰のサンプルを入手したら、処理まで冷蔵庫に保管してください。
したがって、2番目の部分は喀痰の処理で構成されており、このために、最初にこの処理に使用する2つのソリューションを準備する必要があります。だから私たちはDTTとしても知られるDithiothreitolを準備する必要があります。溶液は、6.5ミリモル溶液を得るために、DTTを滅菌水で希釈することによって調製する必要があります。
そのため、DTTを周囲の空気にさらさないようにする必要があり、これには注射器と針を使用します。次に、トリパンブルー溶液を調製する必要があります、そしてこのためにあなたはトリパンブルーでDPBSの希釈を行わなければなりません、0.08%の溶液を得るために、喀痰に関しては、50mLの円錐形の底のプラスチックチューブに全体の喀痰を移し、サンプルを秤量する必要があります。DPBS溶液の3倍の重量を追加します。
サンプルを30秒間ゆっくりとボルテックスし、800gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を50mLの円錐形の底部プラスチックチューブに集め、滅菌ガーゼの2つの単層でろ過します。上清を2mLのプラスチックチューブに割り付け、マイナス80°Cで保存します。
なお、上清サンプルは喀痰の三相成分として有用です。セルパレットの容量が5 mL未満の場合は、DPBSを添加して細胞懸濁液の容量を5 mLにします。細胞懸濁液を1容量のDTTで6.5ミリモルで希釈します。
ベンチワーカーと一緒に室温で20分間細胞懸濁液を揺さぶります。細胞懸濁液をDPBSで少なくとも3倍に希釈します。希釈した細胞懸濁液を550gで4°Cで10分間遠心分離します。
上清を捨てます。セルパレットを約1 mLのDPBSに懸濁します。細胞懸濁液の正確な量を評価し、記録します。
希釈したトリパンブルー溶液50マイクロリットルに50マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、均質化します。ヘモシルサイトメーターのカバースリップの下にサンプルを置き、光学顕微鏡の下に置きます。細胞懸濁液の細胞濃度、扁平上皮細胞の割合、および非扁平上皮細胞の生存率を評価します。
懸濁液の割り当てをDPBSで希釈して、1mLあたり500,000細胞で少なくとも350マイクロリットルの細胞懸濁液を得る。製造元の指示に従ってセルコンセントレーターを組み立てます。細胞濃縮器の3つのコンパートメントのそれぞれに100マイクロリットルの細胞懸濁液を追加します。
細胞遠心分離機で室温150 gで2分間遠心します。上清を捨てます。スライドを風乾させます。
スライドは、メーカーの指示に従ってdiv quickまたはニッケル価染色キットで染色します。封入材とカバースリップで取り付けます。スライドを油浸した光学顕微鏡の下に置きます。
少なくとも500の非扁平上皮細胞、好中球、好酸球、マクロファージ、リンパ球、および上皮細胞を数え、絶対値とパーセンテージ、および細胞タイプを記録します。結果に関しては、血球計算盤を使用して、着色されていない生きている非扁平上皮細胞を数える必要があります。また、青色で着色された死んだ非扁平上皮細胞。
そして扁平上皮細胞。これらの細胞は、口から出てくる上皮細胞です。それらは大きいので、小さな人間の細胞に比べて認識しやすいです。
したがって、バクテリア、酵母、またはスクラップを数えることも避ける必要があります。細胞懸濁液に扁平上皮細胞が80%以上含まれている場合、このサンプルは質が悪く、サイトスピンスライドには適していないと考えられます。したがって、このサンプルは失敗と見なされます。
染色されたサイトスピンのカウントは、細胞の色とその形態に従って行われます。ザ・ 好中球、主な特徴は、細胞の識別を容易にした多葉性核です。これらのセルは丸く小さく、ニュートラルピンクで着色されています。
ザ・ 好酸球、これらの細胞は赤い顆粒で構成されており、簡単に識別できます。これらの細胞のサイズは好中球に近いです。ザ・ マクロファージ、それらは好中球の2〜5倍大きく、青色で着色されています。
細胞質には破片や液胞が含まれている可能性があります。ザ・ リンパ球、これらの細胞は丸くて小さく、青色で着色されており、大きくて密な核を持っています。上皮細胞は円柱状で、ピンク色に着色されており、多くの場合、上部に繊毛が見られます。
ここでは、扁平上皮細胞が80%を超えるサイトスピンサンプルが読めない例をいくつか紹介します。これは非常に有用な技術だと思いますが、喀痰の誘導は医師の監督の下で行わなければならないため、非常に注意する必要がありますが、喀痰の誘導の技術は、気道内の患者の炎症状態について多くの情報を提供します。上清中のさまざまな生化学的マーカーを測定でき、細胞部分のさまざまなものも測定できるため、誘導された喀痰により、フローサイトメトリー、プロテオミクス、トランスクリプトミクス、さらにはゲノミクスを実行できます。
概要
この記事では、呼吸器疾患の分析のために痰サンプルを収集するために使用される非侵襲的な方法である痰誘導の技術について説明します。このプロトコルには、差別的細胞数を数え、さらなる研究のために上清を収集するための痰処理の詳細な手順が含まれています。
主要な研究要素
科学の分野
- 呼吸器内科
- 臨床技術
- 細胞分析
背景
- 90年代初頭に開発された誘導痰技術。
- 喘息やCOPDなどの閉塞性気道疾患を調査するために使用されます。
- 最近、肺線維症に興味が集まっています。
- 気管支鏡検査の非侵襲的な代替手段。
研究目的
- 痰誘導と処理の詳細なプロトコルを提供すること。
- 細胞分析のための痰サンプルの収集を容易にすること。
- 痰分析を通じて呼吸器疾患の理解を深めること。
使用される方法
- ベースラインの肺機能を評価するための肺機能検査を実施すること。
- 誘導中の気管支痙攣を防ぐために気管支拡張薬を投与すること。
- 高張食塩水とネブライゼーションを使用して痰を誘導すること。
- 差別的細胞数と上清の収集のために痰サンプルを処理すること。
主な結果
- 分析のための痰サンプルの成功的な収集。
- 痰処理の詳細な方法が概説されています。
- 細胞の生存能と濃度の評価が達成されました。
結論
- 痰誘導技術は非侵襲的なサンプル収集に効果的です。
- 正確な分析のために痰の適切な処理が重要です。
- このプロトコルは呼吸器疾患の研究と臨床診断に役立ちます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Sputum induction and processing provide a non-invasive method for collecting airway cells and supernatant, enabling mechanistic studies of inflammatory pathways in respiratory diseases. This approach supports target validation by delivering quantitative cellular and biochemical data from the lung microenvironment, which is critical for de-risking hypotheses in asthma, COPD, and fibrosis research. The technique enhances predictive confidence in preclinical models by bridging clinical sample analysis with functional target interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying immune cell populations (neutrophils, eosinophils, macrophages, lymphocytes, epithelial cells) in airway lumen.
- Operational Value: Provides reproducible differential cell counts and viability assessments using standardized hemocytometer and trypan blue exclusion methods.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through analysis of sputum supernatant for mediators and cellular components for flow cytometry, genomics, or proteomics.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated biological systems (cell suspension and supernatant) for downstream assays with defined processing steps including DTT mucolysis and centrifugation.
- Scientific Value: Delivers quantitative outputs such as cell concentration (target: 500,000 cells/mL) and viability percentage, enabling assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Facilitates screening readiness through supernatant storage at -80°C for biomarker analysis and cell concentrator use for slide preparation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery to preclinical continuity by analyzing inflammatory cell profiles in disease-relevant systems (asthma, COPD, pulmonary fibrosis).
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions via quality control thresholds (e.g., <80% squamous cells) to ensure sample suitability for cytospin and downstream analysis.
- Scientific Value: Highlights translational biomarker alignment by enabling measurement of biochemical markers in supernatant and cellular phenotypes linked to disease mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, supporting airway inflammation analysis and biomarker-enabled target prioritization in respiratory disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying cell types and mediators in induced sputum, reflecting airway inflammatory status.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized processing: DTT dilution (6.5 mM), trypan blue staining (0.08%), centrifugation (800 g and 550 g), and cell concentration adjustment to 500,000 cells/mL.
- Analytics: Enables comparative analysis via differential cell counting (neutrophils, eosinophils, etc.), viability assessment, and supernatant collection for biochemical marker measurement.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant cell profiling in asthma, COPD, and fibrosis, supporting biomarker alignment and mechanism validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for longitudinal inflammatory monitoring and target validation across respiratory indications via standardized sputum induction and processing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through quantitative inflammatory profiling and reduction of mechanistic ambiguity in airway disease models.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via defined reagent concentrations (DTT 6.5 mM, trypan blue 0.08%), centrifugation parameters, and cell concentration targets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by providing early human-relevant inflammatory data from non-invasive sampling.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reproducible cell differentials and supernatant biomarker levels indicating target engagement or pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory physiology, cell handling, and microscopic analysis for accurate spirometry, induction monitoring, and cell counting.
- Needs nebulization equipment, centrifuge (800 g and 550 g), hemocytometer, cytocentrifuge, and -80°C storage for supernatant preservation.
- Demands cross-team standardization of processing steps: DTT preparation avoiding air exposure, trypan blue dilution, saline selection based on post-bronchodilator FEV1, and timed mucolysis (20 min rocking).
- Involves adaptation considerations: saline tonicity (5% hypertonic or 9% isotonic) adjusted to patient FEV1, and processing modifications if cell pellet volume <5 mL (DPBS supplementation).
- Includes practical limitations: technical demand, time consumption, need for medical supervision, and sample exclusion if squamous cells >80% indicating oral contamination.
