バイオミメティック化学ニューロモデュレーション神経伝達物質グルタミン酸の in Vitroラット網膜のための方法論

この方法論の全体的な目標は、神経伝達物質を使用して網膜ニューロンの新しい化学ベースの神経調節を可能にすることであり、これにより、神経変性失明患者の欠陥のある網膜細胞の機能を置き換えることができ、視力を回復できる可能性があります。この方法は、人工視覚の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、主要な網膜神経伝達物質であるグルタミン酸は、視細胞の変性した網膜を治療的に刺激するために使用できるのでしょうか?

私たちの技術の主な利点は、生体模倣であり、この方法で網膜を刺激すると、電気刺激よりも高い視力とより自然な視力の可能性を提供することです。この技術の意味は、変性した網膜の早期治療介入が網膜ニューロンのグルタミン酸感受性を回復する可能性があるため、光受容体変性疾患による失明の治療にまで及びます。この手順を開始するには、除核した両眼を、新鮮な酸素化エイムズ培地溶液を入れた直径60ミリメートルのシャーレに入れます。

解剖実体顕微鏡を使用して、メスまたは鋭利なハサミを使用して角膜顔面に小さな切開を行います。次に、この小さな切開部から角膜の端まで切り込みを入れます。そして、角膜の縁全体の周りに円周方向に伸ばします。

次に、剥離した角膜をレンズ、半透明の房水、および硝子体液とともに取り除きます。1対の鉗子でアイカップを優しく持ちながら、アイカップの反対側に2つの小さな切開を慎重に行います。次に、2対の鉗子を使用して、各切開部でアイカップをそっと引き離します。

そして、網膜を強膜から分離します。網膜全体を強膜とアイカップからゆっくりと持ち上げ、視神経がまだ付着している場合は切断します。その後、網膜に縦方向の切り込みを入れて、半分または4分の1の切片を取得します。

次に、神経節細胞がメッシュの反対側を向くようにして、1つの網膜切片をナイロンメッシュにそっと広げます。メッシュと網膜を、神経節細胞がPMEA表面に接触した穴あきMultiElectrode Array上に置きます。次に、網膜を所定の位置に保つために、メッシュの上に重りを置きます。

この手順では、薄暗い赤色の照明の下で、PMEAをMEAに配置します amplifier そして、 amplifierラッチを閉じます。上部灌流出口をPMEAチャンバー内に配置し、上部灌流バルブをオンにすると、毎分約3ミリリットルの灌流速度を達成します。次に、上部の吸引インレットを目的のパーフューズ8レベルに配置します。

動作していることを確認します。その後、データ集録ソフトウェアを開き、再生ボタンをクリックしてデータの受信を開始します。すべてのPMEAチャネルにノイズがなく、神経信号を記録していることを確認します。

そうでない場合は、アンプ内のPMEAの位置を変更して、アンプのピンとPMEAの接点との間の接触を改善します。次に、下部の灌流ラインに気泡がないことを確認します。下部の灌流バルブをオンにして、網膜に酸素と栄養素が供給されていることを確認します。

続いて、倒立光学顕微鏡に取り付けられたハイスピードカメラの電源を入れ、イメージングソフトウェアを開きます。底部灌流が流れていることが確認されたら、倒立顕微鏡で網膜を観察しながら、真空廃液キットの真空圧ノブを手動で回して、下部吸引をゆっくりと上げます。吸引力が網膜に作用することが観察されたら、吸引力の増加を停止します。.

網膜が下部吸引によって所定の位置に保持されていることを確認した後、鉗子を使用して網膜から体重を取り除き、網膜から片方の角を慎重に剥がしてナイロンメッシュをそっと取り除きます。灌流を約30分間実行し続けて、網膜が外科的外傷から安定するようにします。このステップでは、事前に引っ張った直径10マイクロピペットを、直径50マイクロメートルの銀-塩化銀ワイヤー電極を含む標準ピペットホルダーに慎重に挿入します。

代わりにマルチポートマイクロ流体デバイスを使用する場合は、デバイスに接続されたステンレス鋼ロッドをワイヤー電極のない標準のピペットホルダーに挿入します。ガラス製マイクロピペットを使用する場合は、ピペットホルダーをパッチクランプヘッドステージとインターフェースし、ピペットホルダーの圧力ポート下部接続部を圧力注入システムのチャネル1つに接続します。または、マルチポートデバイスを使用している場合は、8つの注入ポートのそれぞれの圧力ポートルアー接続を、圧力注入システムのチャネル1〜8に接続します。

次に、圧力注入システムを手動でオンにし、チャネル1をオンにします。システムが大気中に排出されていることを確認し、射出圧力を0.1ポンド/平方インチに設定します。その後、マイクロマニピュレータの電源を入れ、マニピュレータコントローラのキャリブレーションボタンを押してキャリブレーションします。

マイクロピペットの先端がMEAアンプから約30mm上になるようにマイクロマニピュレーターを配置します。次に、小さなシャーレにグルタミン酸溶液を入れ、マイクロマニピュレーターの下に置きます。マイクロピペットの先端を溶液に下げ、ガラスマイクロピペットまたはマルチポートデバイスチューブに約20mmの溶液を満たします。

その後、マイクロピペットの先端またはデバイスを持ち上げて溶液から取り出します。ペトリ皿を取り外し、マイクロマニピュレーターをPMEAチャンバーの上に配置します。ブームスタンドに取り付けられた実体顕微鏡を使用して、マイクロピペットの先端またはデバイスの角を位置合わせし、PMEAチャンバーリングにエッチングされたリファレンスマークを付けます。

次に、ストア参照Aボタンとストア参照Bボタンを使用してマニピュレータの位置を制御面に格納し、PMEA電極のマニピュレータの座標系をマッピングします。その後、マニピュレータ制御ソフトウェアを使用します。自発的な活動が活発なターゲットPMEA電極を選択し、move to channelボタンをクリックして、ガラスマイクロピペットをターゲット電極に位置合わせします。

マルチポートデバイスを使用する場合は、同じプロセスを使用して、デバイスのマイクロポートをターゲットPMEA電極に位置合わせし、堅牢な自発的な活動を実現します。インピーダンス測定が利用可能な場合は、パッチクランプアンプをオンにし、スタートボタンをクリックしてインピーダンス視覚化ソフトウェアを起動し、ピペットホルダー内の銀-塩化銀電極のインピーダンスを視覚化します。リアルタイムのインピーダンス信号を観察しながら、インピーダンス信号の急激な増加によって示されるように、マイクロピペットまたはデバイスを網膜表面に接触するまでゆっくりと下げます。

表面下刺激の場合は、S334テラスリー網膜の場合はピペットをさらに40マイクロメートル、野生型網膜の場合は70マイクロメートル下げます。圧力注入システムを使用して、短時間の注入を数回行います。マイクロピペットの先端近くの細胞、またはデバイスのマイクロポートが、神経信号を観察することにより、グルタミン酸刺激を受け入れているかどうかを判断すること。

次に、緑色のLEDを網膜の上面に向けます。データ集録ソフトウェアを使用して録音を開始するには、ファイル名を入力し、録音ボタンをクリックします。録音が開始されたら、刺激制御プログラムを開き、デフォルトの刺激をロードします file [刺激ファイルの読み取り]ボタンをクリックして。

次に、[刺激ファイルの実行]ボタンをクリックして、デフォルトの刺激ファイルを開始します。スティミュラスファイルが完成したら、記録を停止して、将来のスパイクソートとデータ分析のためにファイルを保存します。これは、9つのPMEA電極からの代表的な記録であり、緑色LEDによる視覚光刺激中のハイパスフィルタリング電極データを示しており、各長方形は一意の電極からの神経データを示しています。

各電極の記録は、緑色のLEDをオンにした後の最初の1秒間に収集されたデータを示しています。スパイクは、マイナス18マイクロボルトのしきい値電圧を使用して特定されました。視覚刺激は、光に対する抑制反応を持つ上部中央の電極を除くすべての電極にスパイクのバーストを引き起こしました。

同じ電極に対する同様のプロットで、視覚刺激や注射刺激を伴わない自発的な神経活動を示しています。より小さなバーストが存在したが、スパイクのパターンは視覚刺激に反応して記録されたものとは大きく異なっていた。これは、中央電極にグルタミン酸を注入した直後に記録された同じ電極のサブセットからの代表的な記録です。

注入されたグルタミン酸は、視覚的に誘発されたスパイクバーストと非常によく似たスパイクのバーストを中心電極に引き起こしました。他のすべての電極はグルタミン酸注入の影響を受けず、化学刺激技術の優れた空間分解能を示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4〜6時間で完了します。

この手順を試行する際は、実験全体を通じて網膜に酸素と栄養素が継続的に供給されるように、灌流を監視することを忘れないでください。この技術は、人工視覚および視覚補綴物開発の分野の研究者が、光受容体変性疾患による失明を治療するための化学物質ベースの神経調節を探求するための道を開く可能性があります。このビデオを見れば、神経伝達物質を使用して網膜ニューロンの神経調節を達成する方法についてよく理解できるはずです。