Name: バイオミメティック化学ニューロモデュレーション神経伝達物質グルタミン酸の in Vitroラット網膜のための方法論 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: 学ぶグルタミン酸を用いたラット網膜の化学的神経調節法。光受容体変性による失明治療のため、生体模倣的アプローチで視力回復の可能性を探索する革新的な神経科学技術です。

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本稿で仕事に支えられた全米科学財団、研究の新たなフロンティアとイノベーション (NSF-年度に新設された) プログラム許可番号 0938072。本稿の内容は著者の責任であり、NSF の公式見解を必ずしも表さない。著者はまた彼の仕事の設計とテストの化学刺激の初期の実験のセットアップおよび氏 Ashwin ラグーネイサンで使用するマルチポート マイクロ流体デバイスを評価の設計、製造、および彼の仕事のための博士国内過激派を感謝したいです。本研究では。

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<li>Zrenner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+subretinal+microphotodiodes+successfully+replace+degenerated+photoreceptors%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors?</a> Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).</li>
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著者が明らかに何もありません。

ここで紹介した方法は、前記網膜神経細胞は化学的に網膜体外の地下にネイティブの神経伝達物質の化学物質を注入することによって刺激されるユニークな神経刺激パラダイムを示します。この化学刺激テクニック選択性高い焦点ターゲット ニューロン特異性など従来の電気刺激法をいくつかの利点を提供しています。上記の詳細をどのように小さなターゲット網膜神経細胞のいずれかを使用して近くに神経伝達物質グルタミン酸の量空気注射配信のシングル ポート ガラス マイクロ ピペットまたはカスタム マイクロ マルチポート マイクロ流体デバイスを引き出すプロトコル生理学的に有意な RGC 反応。このプロトコルは、グルタミン酸だけで実証されている、プロトコルは他の種類の神経伝達物質と網膜の化学的刺激を調べる場合に役立ちます。さらに、このプロトコルは、他の MEA のデザインで説明した電気生理学的記録32 pMEA を使用することが望ましいですが非穿孔型などされる可能性があります、pMEA として同様の結果を達成するために。次の段落で、プロトコルの最も重要な手順の一般的な問題と制限をトラブルシューティングする方法と...

視細胞変性疾患、網膜色素変性症、加齢に伴う黄斑変性症などの主要な視野の損失の継承可能な原因は、現在不治1,2。これらの病気は、さまざまな特定の遺伝の突然変異から起こるが、視細胞の変性疾患はグループとして最終的に盲目を引き起こす網膜の光受容細胞の進歩的な損失によって特徴付けられます。光受容体のトリガーの広範な網膜全体改造しますが、双極細胞など、網膜の神経細胞生存の損失のままそのまま視細胞変性3 の高度な段階でも比較的機能、4,5,6,7。
メカニズムとこれらの疾患の病態はよく特徴付けられて3,4,5,6,7をされているが、効果的な治療法は、とらえどころのないままです。過去 3 年間、世界中の研究者が視細胞変性疾患遺伝子療法8、幹細胞治療9を含む影響を受けた人々 に視力を回復のための治療のさまざまなを検討しました。網膜移植10、および存続の網膜ニューロンの人工的な刺激11,12 。これらの最も臨床的に利用可能な従来の目標を特定のパターンで双極細胞または Rgc を電気刺激するために電極の配列を利用して人工神経機器である人工患者11人工視覚認識を作成します。アーガス II13アルファ IMS14デバイスなどの現在の世代電気補綴臨床承認を達成しているし、復元することによって患者の生活の質を改善できるという予備調査は示した、網膜 (網膜の前面) 上と subretinal 視 (網膜) 背の測定デバイス15,16を注入しました。世界中の研究グループはこれらの第一世代のデバイス17,18,19,20の成功を超えて人工網膜の進展に取り組んでいるが、直面しています。電気の義足患者への法的な失明レベル以下高視力視力の回復が可能の設計の難しさ。最近の調査は示したこと安全に刺激するために大規模な電極の使用が余儀無くされる電荷注入制限のため人工の電気ベースは挑戦により、現在の世代よりも高分解能を達成するため、空間分解能、すなわち視力11,21を犠牲にして網膜神経細胞。さらに、電気刺激はさらに主な理由はそれが本質的に不自然な刺激パラダイム21それは通常近くのすべてのセルを刺激し、したがって患者では、不自然と混乱の認識を引き出すために、制限します。それにもかかわらず、電気刺激の初期の成功は、その人工の神経は、視細胞の変性疾患の効果的な治療をすることができますを示しています。これはさらに効果的な治療は、神経伝達物質の化学物質、化学シナプスでコミュニケーションの自然なエージェントと網膜を刺激することによって達成可能なかもしれないことを仮定する 1 つを導きます。本稿で紹介した方法の目的は、化学的刺激、生体電気に代わる刺激として、網膜の神経細胞間のシナプス通信の自然のシステムを模倣するように努めるの治療の可能性を探索するには人工。
化学人工網膜へ治療の化学刺激の概念の翻訳はネイティブ神経伝達物質のグルタミン酸塩、マイクロを介してリリースなど少量でターゲット網膜神経細胞を化学的に活性化に依存しています。視覚刺激への応答で microports の大規模な配列を構成するデバイス。このように、化学人工になる自然化学信号を網膜に達する光子を変換するバイオミメティック人工視細胞層本質的に。これらの化学信号通常網膜シグナル伝達に利用されている同じ神経伝達物質を使用し、正常な視力経路、結果として得られる visual によって使用される同じシナプス経路を介して変性網膜の存続の網膜神経細胞を刺激するので化学の人工網膜を通じた知覚可能性がありますより自然で分かりやすい 1 つを介して電気的人工誘発に比べています。さらに、非常に小さく、電極とは異なり、高密度に配列した神経伝達物質を解放する microports を行うことができますので潜在的な化学補綴できるかもしれないより焦点刺激を達成するために高い空間電気義足より解像度。したがって、これらの潜在的な利点に基づいて、化学人工網膜は電気義足に非常に有望な代替手段を提供しています。
網膜の化学的刺激、検討されている比較的少し最近まで。一方、網膜の電気刺激は体外22,23、生体内で23,24、および臨床研究13 を通じて仕事の十年にわたっても特徴とされています。 ,14, 化学的刺激の研究はいくつかの in vitro作品25,26,27,28に排他的に限定されています。梨田と Finlayson26と過激派ら27は、網膜上の網膜培養網膜ニューロンのグルタミン酸誘発反応を記録する単一電極と電極 (MEA) をそれぞれ、使用して化学的刺激を示した。もっと最近、ラウントゥリーら28は、網膜上の複数のサイトから神経細胞の反応を記録する網膜側と MEA からグルタミン酸を使用してオフにして網膜の経路の差の刺激を示した。更なる研究が多くを調べることが不可欠であるが、これらの作品は予め化学的刺激の可能性を確立して、このアプローチ以外の側面に対処ところ25,26,27,28、前述の通り化学人工網膜にこの概念を翻訳する前に両方の in vitroとin vivoの動物モデルで治療刺激パラメーターを微調整します。しかし、現在本邦網膜の化学的刺激を達成するための確立された方法論がない、そのような細部で以前の作品で使用される方法が記載されていない複製研究のために不可欠になります。したがって、メソッド本の根拠体外前研究27を複製するどちらかに興味がある研究者の網膜の化学的刺激を実施するための適切に定義されたフレームワークを提供することです。 28または化学神経のこの初期のコンセプトをさらに進めます。
Wholemount 網膜視細胞変性の進行を密接に模倣視細胞変性ラット モデルおよび野生型ラットの網膜神経細胞の化学的刺激培養を行うためのメソッドを示す人間の病気。生体外モデルでこの刺激法の開発の背後にある理論的根拠はさまざまな刺激パラメーターの治療の範囲を評価してが不可能または困難でで観察する神経応答特性に関する研究vivoモデルでは、初期の研究、特に中に焦点を当てたこのアプローチの可能性を評価します。この手順では市販のシングル ポート ガラス マイクロ ピペットとカスタムを介してターゲット網膜近く 1 mM グルタミン酸の少量を提供することにより網膜のシングル サイトと同時複数サイトの化学的刺激を表示します。マイクロ多ポート マイクロ流体デバイスをそれぞれ。一方、単一サイト、複数サイトの両方の刺激は、化学神経の治療の可能性の調査の基本的な目的を達成する、それぞれはユニークな利点と異なる目的を果たします。市販の予ガラス マイクロ ピペットを達成する可能性があります、単一サイト刺激単一サイトで網膜の地下に直接化学物質を注入するため、オブザーバブル RGC スパイク率を調査する提供しています視覚誘発の光応答に似た応答は、注射部位の下で先んじて誘発されることができます。その一方で、マルチサイト刺激を特殊加工したマルチポート マイクロ流体デバイスを必要とする網膜の表面に複数のサイトで空間的化学物質を注入するため、どれだけグルタミン酸誘発 RCG を調査するのに役立つ応答パターンはパターン刺激研究におけるグルタミン酸噴射パターンに対応します。

<table><tbody><tr><td>微小電極アレイ、穴あきレイアウト</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>60pMEA200/30iR-Ti-pr</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti</td></tr><tr><td>MEA amplifier</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv</td></tr><tr>pMEA <td>Multi Channel Systems, GmbH</td> <td>の底部灌流グランドプレート</td><td>MEA1060-Inv-(BC)-PGP</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp</td></tr><tr><td>3軸電動マイクロマニピュレーター</td><td>サッター機器 カリフォルニア州ノヴァト</td><td>MP-285</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレータ制御システム</td><td>サッター機器 カリフォルニア州ノヴァト</td><td>MPC-200</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html</td></tr><tr><td>ガントリー型リニアスライド付きマイクロマニピュレータースタンド</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MT-75/LS</td><td></td></tr><tr><td>https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html 8チャンネル プログラマブルマルチチャンネル圧力インジェクター</td><td>OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ ベンダー: Harvard Apparatus UK</td><td>PM-8000 or PM-8</td><td>OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm ベンダー: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail</td></tr><tr><td>Axopatch 200A 統合パッチ クランプ アンプ</td><td>分子デバイス、サニーベール、カリフォルニア州</td><td>Axopatch 200A</td><td>Axopatch 200A は、新しいモデル Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier</td></tr><tr><td>パッチ クランプに置き換えられましたheadstage</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV 201A</td><td>http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage</td></tr><tr><td>Vacuum waste kit</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VMK</td><td></td></tr> <tr><td>http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ Pipette holder</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>QSW-A10P</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915</td></tr><tr><td>プリプル 10 &mu;m先端径ガラスマイクロピペット</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>TIP10TW1</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ Zoom stereomicroscope</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td>SMZ-745T</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745T</td></tr><tr><td>Microscope boom stand with dual linear ballベアリングアーム</td><td>Old School Industries, Inc., Dacono, CO</td><td>OS1010H-16BB</td><td></td></tr><tr><td>http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td>SMZ-445 https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope system</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td>EclipseTi-E</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420</td></tr><tr><td>L-Glutamic Acid (Glutamate)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G5667 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S8761</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761</td></tr><tr><td>60 mm ペトリ皿 (高さ 10 mm)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>FB0875713A</td><td>60 mm Clear Petri Dish;</td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a Jewelers #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>555227F</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/</td></tr> <tr><td>Standard Scalpel Blad #24</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500247</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/</td></tr> <tr><td>Scalpel Handle #4</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500237</td><td></td></tr><tr><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ Vannas Tubingen Dissection Scissors</td><td>World Precision Instruments、フロリダ州サラソタ</td>、<td>503378</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ ナイロンメッシュキット</td><td>、ワーナーインスツルメンツ、ハムデン、CT</td><td>のNYL/MESH</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173</td></tr><tr><td>ハープスライスグリッド</td><td>ALAサイエンティフィックインスツルメンツ、ファーミングデール、ニューヨーク</td><td>HSG-5AD</td><td></td></tr> <tr><td>http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ Ag/AgCl参照電極ペレット</td><td>マルチチャネルシステム、GmbH</td><td>P1060</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/p1060</td></tr><tr><td>4チャネルバルブ制御重力灌流システム</td><td>ALAScientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VC3-4xG</td><td>http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/</td></tr> <tr><td>Zyla 5.5 sCMOS顕微鏡カメラ</td><td>Andor Technology, ベルファスト, 英国</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td>http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos</td></tr><tr><td>銀線 (50 &mu;m直径)</td><td>Fischer Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ</td><td>州AA44461G5</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 タイゴンマイクロボアチューブ(直径1.6 mm)</td><td>コールパーマー、バーノンヒルズ、イリノイ州</td><td>EW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 チルティングツールホルダー、スチールカニューレ付き</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>TILTPORT</td> One <td>of these were used for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/</td></tr> <tr><td>Roscolux #26 Light Red Filter Sheet</td><td>Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT</td><td>R2611</td><td>メーカー: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux ベンダー: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html</td></tr><tr><td>Smith &ウェッソンギャラクシーレッド懐中電灯</td><td>スミス&ウェッソン、2100ルーズベルトアベニュー、スプリングフィールド、マサチューセッツ</td>州<td>4588</td><td>メーカー:https://www.smith-wesson.com/ ベンダー: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588</td></tr><tr><td>MC_Rack Software</td><td>MultiChannel Systems, GmbH</td><td>MC_Rack</td><td>http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack</td></tr><tr><td>Labview Software</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.ni.com/labview/ NIS-Elements: 基礎研究ソフトウェア</td><td>ニコン, 東京, 日本</td><td>NIS-Elements BR</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research</td></tr></tbody></table>

バイオミメティック化学ニューロモデュレーション神経伝達物質グルタミン酸の in vitroラット網膜のための方法論

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

視細胞の変性疾患は、網膜の光受容細胞の進歩的な損失を取り返しのつかない失明を引き起こします。人工網膜は、人工的に患者に分かりやすい視覚認識を引き出すことを願って存続の網膜神経細胞を刺激することによって視力を回復しようとすると、視細胞の変性疾患の新たな治療法です。現在人工網膜電気網膜を刺激するが、患者にナチュラル ビジョンの高い視力の回復に相当な物理的な障壁に直面する電極の配列を使用している患者に限られた視力を回復の成功を実証しています。ネイティブの神経伝達物質を使用して化学神経生体電気に代わる刺激し、電気神経刺激を用いた人工網膜に関連する根本的な制限を回避することが可能します。具体的には、化学的神経網膜によって使用される通信と同じ自然剤神経伝達物質の非常に少量を注入することにより患者に同程度以上の visual acuities とより自然なビジョンを復元する可能性があります。化学シナプス、現在電気補綴物に比べはるかに細かい解像度で。ただし、比較的未踏刺激パラダイムとして培養網膜の化学的刺激を達成するための確立されたプロトコルではありません。この作業の目的は、網膜の化学ニューロモジュレーションの潜在的なまたは類似を勉強したい者の網膜の化学的刺激を達成するための詳細なフレームワークを提供する神経組織体外。今回、実験のセットアップと網膜神経節細胞 (RGC) スパイク応答視覚と同様の軽い応答野生型を引き出すための方法論について述べるし、注入による視細胞変性 wholemount ラット網膜のボリュームの制御ガラス マイクロ ピペットとカスタム マルチポート マイクロ流体デバイスを用いた網膜の空間に神経伝達物質グルタミン酸。この方法論とプロトコルが他の神経伝達物質やその他の神経組織を用いた神経調節のために適応する十分な一般的です。

通常、野生型の網膜と視細胞を化学的に刺激するためにこのプロトコルを使用することができる退化網膜光受容体の喪失による実質的な携帯電話改造にもかかわらず。退化したどちらかの光受容体を用いた実験を開始または野生型網膜、準備するのに記録と刺激装置 (図 1および図 2) 必要性および pMEA (図 5) を最小限に抑えるにきれいになるべきである前に、各電極のチャネル (図 6) のノイズ。視細胞変性網膜が薄く、そのため野生型網膜より敏感、両方同じ解剖手順 (図 4) に使用します。新鮮な酸素のエイムズ媒体とすることができます継続的に潅次郭清、網膜が慎重に神経節細胞面を電極にして pMEA と (図 3 a)、MEA アンプ内...

このプロトコルでは、化学 wholemount ラット網膜培養神経伝達物質グルタミン酸神経の形態を調査するための手法について説明します。化学神経は網膜視細胞の変性疾患による不可逆的な失明の治療のための従来の電気神経刺激する有望な代替手段です。

バイオミメティック化学ニューロモデュレーション神経伝達物質グルタミン酸の in Vitroラット網膜のための方法論

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

この方法論の全体的な目標は、神経伝達物質を使用して網膜ニューロンの新しい化学ベースの神経調節を可能にすることであり、これにより、神経変性失明患者の欠陥のある網膜細胞の機能を置き換えることができ、視力を回復できる可能性があります。この方法は、人工視覚の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、主要な網膜神経伝達物質であるグルタミン酸は、視細胞の変性した網膜を治療的に刺激するために使用できるのでしょうか?私たちの技術の主な利点は、生体模倣であり、この方法で網膜を刺激すると、電気刺激よりも高い視力とより自然な視力の可能性を提供することです。この技術の意味は、変性した網膜の早期治療介入が網膜ニューロンのグルタミン酸感受性を回復する可能性があるため、光受容体変性疾患による失明の治療にまで及びます。この手順を開始するには、除核した両眼を、新鮮な酸素化エイムズ培地溶液を入れた直径60ミリメートルのシャーレに入れます。解剖実体顕微鏡を使用して、メスまたは鋭利なハサミを使用して角膜顔面に小さな切開を行います。次に、この小さな切開部から角膜の端まで切り込みを入れます。そして、角膜の縁全体の周りに円周方向に伸ばします。次に、剥離した角膜をレンズ、半透明の房水、および硝子体液とともに取り除きます。1対の鉗子でアイカップを優しく持ちながら、アイカップの反対側に2つの小さな切開を慎重に行います。次に、2対の鉗子を使用して、各切開部でアイカップをそっと引き離します。そして、網膜を強膜から分離します。網膜全体を強膜とアイカップからゆっくりと持ち上げ、視神経がまだ付着している場合は切断します。その後、網膜に縦方向の切り込みを入れて、半分または4分の1の切片を取得します。次に、神経節細胞がメッシュの反対側を向くようにして、1つの網膜切片をナイロンメッシュにそっと広げます。メッシュと網膜を、神経節細胞がPMEA表面に接触した穴あきMultiElectrode Array上に置きます。次に、網膜を所定の位置に保つために、メッシュの上に重りを置きます。この手順では、薄暗い赤色の照明の下で、PMEAをMEAに配置します amplifier そして、 amplifierラッチを閉じます。上部灌流出口をPMEAチャンバー内に配置し、上部灌流バルブをオンにすると、毎分約3ミリリットルの灌流速度を達成します。次に、上部の吸引インレットを目的のパーフューズ8レベルに配置します。動作していることを確認します。その後、データ集録ソフトウェアを開き、再生ボタンをクリックしてデータの受信を開始します。すべてのPMEAチャネルにノイズがなく、神経信号を記録していることを確認します。そうでない場合は、アンプ内のPMEAの位置を変更して、アンプのピンとPMEAの接点との間の接触を改善します。次に、下部の灌流ラインに気泡がないことを確認します。下部の灌流バルブをオンにして、網膜に酸素と栄養素が供給されていることを確認します。続いて、倒立光学顕微鏡に取り付けられたハイスピードカメラの電源を入れ、イメージングソフトウェアを開きます。底部灌流が流れていることが確認されたら、倒立顕微鏡で網膜を観察しながら、真空廃液キットの真空圧ノブを手動で回して、下部吸引をゆっくりと上げます。吸引力が網膜に作用することが観察されたら、吸引力の増加を停止します。.網膜が下部吸引によって所定の位置に保持されていることを確認した後、鉗子を使用して網膜から体重を取り除き、網膜から片方の角を慎重に剥がしてナイロンメッシュをそっと取り除きます。灌流を約30分間実行し続けて、網膜が外科的外傷から安定するようにします。このステップでは、事前に引っ張った直径10マイクロピペットを、直径50マイクロメートルの銀-塩化銀ワイヤー電極を含む標準ピペットホルダーに慎重に挿入します。代わりにマルチポートマイクロ流体デバイスを使用する場合は、デバイスに接続されたステンレス鋼ロッドをワイヤー電極のない標準のピペットホルダーに挿入します。ガラス製マイクロピペットを使用する場合は、ピペットホルダーをパッチクランプヘッドステージとインターフェースし、ピペットホルダーの圧力ポート下部接続部を圧力注入システムのチャネル1つに接続します。または、マルチポートデバイスを使用している場合は、8つの注入ポートのそれぞれの圧力ポートルアー接続を、圧力注入システムのチャネル1〜8に接続します。次に、圧力注入システムを手動でオンにし、チャネル1をオンにします。システムが大気中に排出されていることを確認し、射出圧力を0.1ポンド/平方インチに設定します。その後、マイクロマニピュレータの電源を入れ、マニピュレータコントローラのキャリブレーションボタンを押してキャリブレーションします。マイクロピペットの先端がMEAアンプから約30mm上になるようにマイクロマニピュレーターを配置します。次に、小さなシャーレにグルタミン酸溶液を入れ、マイクロマニピュレーターの下に置きます。マイクロピペットの先端を溶液に下げ、ガラスマイクロピペットまたはマルチポートデバイスチューブに約20mmの溶液を満たします。その後、マイクロピペットの先端またはデバイスを持ち上げて溶液から取り出します。ペトリ皿を取り外し、マイクロマニピュレーターをPMEAチャンバーの上に配置します。ブームスタンドに取り付けられた実体顕微鏡を使用して、マイクロピペットの先端またはデバイスの角を位置合わせし、PMEAチャンバーリングにエッチングされたリファレンスマークを付けます。次に、ストア参照Aボタンとストア参照Bボタンを使用してマニピュレータの位置を制御面に格納し、PMEA電極のマニピュレータの座標系をマッピングします。その後、マニピュレータ制御ソフトウェアを使用します。自発的な活動が活発なターゲットPMEA電極を選択し、move to channelボタンをクリックして、ガラスマイクロピペットをターゲット電極に位置合わせします。マルチポートデバイスを使用する場合は、同じプロセスを使用して、デバイスのマイクロポートをターゲットPMEA電極に位置合わせし、堅牢な自発的な活動を実現します。インピーダンス測定が利用可能な場合は、パッチクランプアンプをオンにし、スタートボタンをクリックしてインピーダンス視覚化ソフトウェアを起動し、ピペットホルダー内の銀-塩化銀電極のインピーダンスを視覚化します。リアルタイムのインピーダンス信号を観察しながら、インピーダンス信号の急激な増加によって示されるように、マイクロピペットまたはデバイスを網膜表面に接触するまでゆっくりと下げます。表面下刺激の場合は、S334テラスリー網膜の場合はピペットをさらに40マイクロメートル、野生型網膜の場合は70マイクロメートル下げます。圧力注入システムを使用して、短時間の注入を数回行います。マイクロピペットの先端近くの細胞、またはデバイスのマイクロポートが、神経信号を観察することにより、グルタミン酸刺激を受け入れているかどうかを判断すること。次に、緑色のLEDを網膜の上面に向けます。データ集録ソフトウェアを使用して録音を開始するには、ファイル名を入力し、録音ボタンをクリックします。録音が開始されたら、刺激制御プログラムを開き、デフォルトの刺激をロードします file [刺激ファイルの読み取り]ボタンをクリックして。次に、[刺激ファイルの実行]ボタンをクリックして、デフォルトの刺激ファイルを開始します。スティミュラスファイルが完成したら、記録を停止して、将来のスパイクソートとデータ分析のためにファイルを保存します。これは、9つのPMEA電極からの代表的な記録であり、緑色LEDによる視覚光刺激中のハイパスフィルタリング電極データを示しており、各長方形は一意の電極からの神経データを示しています。各電極の記録は、緑色のLEDをオンにした後の最初の1秒間に収集されたデータを示しています。スパイクは、マイナス18マイクロボルトのしきい値電圧を使用して特定されました。視覚刺激は、光に対する抑制反応を持つ上部中央の電極を除くすべての電極にスパイクのバーストを引き起こしました。同じ電極に対する同様のプロットで、視覚刺激や注射刺激を伴わない自発的な神経活動を示しています。より小さなバーストが存在したが、スパイクのパターンは視覚刺激に反応して記録されたものとは大きく異なっていた。これは、中央電極にグルタミン酸を注入した直後に記録された同じ電極のサブセットからの代表的な記録です。注入されたグルタミン酸は、視覚的に誘発されたスパイクバーストと非常によく似たスパイクのバーストを中心電極に引き起こしました。他のすべての電極はグルタミン酸注入の影響を受けず、化学刺激技術の優れた空間分解能を示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4〜6時間で完了します。この手順を試行する際は、実験全体を通じて網膜に酸素と栄養素が継続的に供給されるように、灌流を監視することを忘れないでください。この技術は、人工視覚および視覚補綴物開発の分野の研究者が、光受容体変性疾患による失明を治療するための化学物質ベースの神経調節を探求するための道を開く可能性があります。このビデオを見れば、神経伝達物質を使用して網膜ニューロンの神経調節を達成する方法についてよく理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

免疫組織化学プロトコルは、網膜中の特定のタンパク質の局在化を研究するために使用される。カルシウムイメージング技術は、網膜神経節細胞および軸索のカルシウム動態を研究するために使用される。...

ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

本研究では、我々は将来の前臨床治療試験のための孤立した灌流ウシ網膜のための標準化された応力モデルをご紹介。 A及びB波振幅によって表さ網膜機能上のいずれかの低酸素（純粋なN 2）またはグルタミン酸ストレス（250μMグルタミン酸）の効果を評価した。...

単離された灌流脊椎動物の網膜のためのストレスモデルとしてグルタミン酸および低酸素症

ポストエンベッドイムノゴールド法は、特定の分子の細胞内局在を高解像度で分析するための最も効果的な方法の一つです。ここでは、網膜リボンシナプスにおけるグルタミン酸受容体を定量的に解析するためのプロトコールについて述べます。...

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

この記事は、神経伝達物質受容体の発現を定量化する方法と、光遺伝学的ツールのウイルス形質導入と凍結骨折レプリカ免疫標識技術の組み合わせを使用して、シナプス前およびシナプス後要素が特定されたシナプスでのパターンを分析する方法を示しています。...

複合光遺伝学および凍結破砕レプリカ免疫標識をマウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力固有の配置を検討すること

ここでは、トニックおよび酵素結合微小電極アレイ（MEA）を使用して、in vivoで相性の細胞外グルタミン酸変化を測定の空間的及び時間的に正確な方法のセットアップ、ソフトウェアナビゲーション、およびデータ分析を記載しています。...

アルツハイマー病のマウスモデルにおけるトニックと相性グルタミン酸を測定するための酵素ベースのバイオセンサーを使用して

ここでは、中脳ニューロンのin vitro Ca2+ フラックスを測定するプロトコルと、プライマリマウス中脳培養を用いたカスパーゼ-3に対するその下流の影響を提示する。このモデルは、中脳ニューロンにおける異常なCa2+...

主マウス中脳ニューロンにおける自発的Ca2+ フラックスとその下流効果の定量化

神経損傷後の嗅覚神経再生能力(OEG)の神経再生能力を評価するインビトロモデルを発表する。これは、OEG単層上のアキソトマイズ化された直上神経節ニューロン(RGN)の共培養と、RGN軸索およびソマト樹状マーカーを分析することによって、軸索再生のその後の研究に基づいています。...

アキソトマイズ化ラットレチナル神経節ニューロンの嗅覚エンシアシンググリアの共培養、成人軸索再生のインビトロモデルとしての

in vivoイメージングは、健康と疾患における生物学の研究のための強力なツールです。このプロトコルは、標準的な2光子顕微鏡によるマウス網膜の経瞳孔イメージングについて説明しています。また、網膜の複数の細胞コホートを蛍光標識するためのさまざまなin...

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

既存の多電極アレイまたはパッチクランプ装置の改造により、 ex vivo 網膜電図がより広く利用できるようになります。 生体外...

大小眼の網膜機能を研究するための Ex Vivo 網膜電図のセットアップと条件の最適化

このプロトコルは、アフリカ ツメガエル・ラエビス 卵母細胞へのシナプス膜の微小移植を行うことによって、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸およびγ-アミノ酪酸受容体の一貫した信頼性の高い応答を記録することが可能であることを実証する。...

機能研究のためのヒトシナプス受容体を再活性化するためのシナプス膜の微小移植

人工網膜には、視覚を発生させる能力があります。新しいプロテーゼの開発を進めるためには、移植前にデバイスを試験する ex vivo...

電気刺激フラットマウント網膜におけるカルシウムイメージング

学ぶグルタミン酸を用いたラット網膜の化学的神経調節法。光受容体変性による失明治療のため、生体模倣的アプローチで視力回復の可能性を探索する革新的な神経科学技術です。

バイオミメティック化学ニューロモデュレーション神経伝達物質グルタミン酸の in Vitroラット網膜のための方法論

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