標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

この手順の全体的な目標は、ヒト多能性幹細胞から高度に標準化され再現性のある前脳型オルガノイドを作製することです。この手法は、新規開発NTZのメカニズムをモデル化するための強力なツールです。特に、初期のヒト皮質起源に関連する重要な問題に対処するのに役立ちます。

この技術の主な利点は、個々のオルガノイドとオルガノイドバッチ間のばらつきがほとんどなく、標準化された時間効率の良いヒト皮質組織の生成を可能にすることです。オルガノイド技術は、特に低等生物種の脳モデルでは見られない側面について、ヒトの脳の発達、構造、機能に関する洞察を提供することができます。多能性幹細胞凝集体を生成するには、幹細胞培養物が70〜90%の密度に達したら、500マイクロリットルの細胞解離試薬を6ウェル培養プレートのうち1ウェルに追加して細胞を剥離します。

単層培養条件に適応した人工多能性幹細胞は、解離および凝集手順中にストレスによって細胞死を起こしにくいため、凝集体を生成するのに適した細胞タイプです。摂氏37度で5〜10分後、プレートを軽くたたき、2ミリリットルのDMEM/F-12を使用してウェルの底から細胞を洗い流します。得られた細胞懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、DMEM/F-12培地を増やして細胞溶液の量を最大10ミリリットルにします。

計数後、多能性幹細胞凝集体あたり10の4.5倍を第3の細胞に新たな15ミリリットルチューブに移し、遠心分離により細胞を回収する。ペレットを適切な量の多能性幹細胞培地に懸濁し、50マイクロモルの岩石阻害剤を添加して、中濃度150マイクロリットルあたり10〜3番目の細胞の4.5倍を達成します。次に、96ウェルの低付着U底プレートの個々のウェルに150マイクロリットルの細胞を加え、プレートを摂氏37度および5%二酸化炭素インキュベーターに置きます。

前部神経外胚葉の誘導をモニタリングするには、組織培養顕微鏡を使用して、低倍率で毎日多能性幹細胞凝集体の形態学的変化を綿密に観察します。1日目には、明確な境界を持つ細胞凝集体が観察されるべきです。2日目に、各ウェルの底部にある細胞凝集体を乱さずに、培地の約3分の2を慎重に吸引し、廃棄した培地を100マイクロリットルの新鮮な多能性幹細胞培地と交換します。

4〜6日後、細胞凝集体の直径が350〜450マイクロメートルに達し、滑らかなエッジを示したら、改造された100マイクロリットルのピペットチップを使用して、最大20個の凝集体を5ミリリットルの皮質誘導培地を含む単一の6センチメートルの低付着培養プレートに移します。皮質誘導培地を3日に1回新鮮な培地と交換し、4X対物レンズの下で毎日凝集体の形態を監視します。皮質誘導培地で4〜5日後、細胞凝集体の縁が表面で明るくなり始め、神経外胚葉の分化と偽層状上皮の放射状組織が現れるはずです。

神経外胚葉凝集体をマトリックス足場に埋め込むには、氷上で基底膜抽出物を2〜3時間解凍します。抽出物を解凍している間に、滅菌ハサミを使用してプラスチックパラフィンフィルムを16個のオルガノイドごとに4×4センチメートル四方に切断し、各フィルムを空の100マイクロピペットチップトレイの上に置きます。手袋をはめた指先でパラフィンフィルムを小さなくぼみが現れるように押し、70%エタノールでフィルムを清掃します。

密閉された滅菌バイオセーフティキャビネットで30分間UV照射した後、1.5〜2ミリメートルの開口部を備えた改造された100マイクロリットルのピペットチップを使用して、各細胞凝集体をフィルム内の1つのディンプルに移します。すべての凝集体を移し終えたら、未切断の100マイクロリットルのピペットチップを使用して、各ディンプルから培地を慎重に吸引し、各細胞凝集体に40マイクロリットルの希釈されていない基底膜抽出物を追加します。乱暴な操作やピペットチップへの吸引によってオルガノイドを損傷しないように注意してください。

ピペットチップを使用して骨材を各滴の中央に配置し、滅菌鉗子を使用してプラスチックパラフィンフィルムシートを10センチメートルのシャーレに慎重に移します。ディッシュをインキュベーターに15〜20分間置きます。抽出物が固化している間に、5ミリメートルの新鮮な皮質誘導培地を6センチメートルの低付着培養皿1つに加えます。

インキュベーションの最後に、パラフィンフィルムシートを裏返し、滅菌鉗子を使用して、最大16個の重合液滴を各6cmの皿に静かに絞ります。次に、凝集体を細胞培養インキュベーターに戻します。翌日、オルガノイド培養皿を、細胞培養インキュベーター内で14rpmで5度の角度で傾けたロッキング細胞培養シェーカーに移し、凝集体が目的の分化段階に達するまで毎日光学顕微鏡でモニタリングします。

20日目に、3〜3.5ミリリットルの開口部を持つ改造された1ミリリットルのピペットチップを使用して、凝集培養物から6つのオルガノイドを回収します。500マイクロリットルのPBSを含む24ウェルプレートの1つのウェルに3つのオルガノイドを入れ、5ミリリットルのピペットを使用してオルガノイドを500マイクロリットルの新鮮なPBSで2回洗浄します。2回目の洗浄後、オルガノイドを冷たい4%パラホルムアルデヒドに15分間固定し、続いて室温PBSで10分間3回洗浄し、最後に摂氏4度の30%ショ糖溶液で一晩脱水します。

翌日、脱水したオルガノイドを1〜50 Trypan Blue希釈液で10分間事前に染色し、凍結切片処理中にオルガノイドを可視化し、スクロースを新たに調製した包埋培地と交換します。プレートを摂氏60度の加熱パッドで15分間加熱して、包埋培地中のオルガノイドを平衡化し、オルガノイドごとに1つの包埋型モールドの底を新しい包埋培地で覆います。型を氷上に置いて包埋培地を固化させ、オルガノイドを包埋型に移し、各オルガノイドが覆われるまで新しい包埋培地を追加します。

次に、オルガノイドを100%エタノールドライアイス凍結浴で少なくとも1分間衝撃凍結し、クライオスタットを使用して免疫細胞化学分析のために各オルガノイドの厚さ20マイクロメートルの切片を取得します。前脳型オルガノイドを作製するには、開始集団に未分化細胞の均質な単層として存在するIPSC培養物のみを使用します。2日目には、凝集体は滑らかなエッジを持つコンパクトな細胞芽を形成しているはずです。

10日目の凝集体は、神経外胚葉の誘導を表す、外面に滑らかで光学的に滑らかで光学的に半透明の組織を示す必要があります。プロトコールが厳密に守られている場合、バッチ内およびバッチ間で分極した神経外胚葉形成が90%以上の均質性を示す高度に標準化されたオルガノイドバッチが生成されます。20日目のオルガノイドの免疫細胞化学的分析により、神経幹細胞マーカーSox2、前脳マーカーPax6およびOtx2、および背側皮質マーカーEmx1を発現する層状神経上皮ループが明らかになりました。

これらの皮質ループは、N-カドヘリンおよびZO-1の頂端局在、心室ゾーン放射状グリア細胞由来の微小管(頂端から構造の基底側まで広がる)、およびリン酸化ビメンチンに陽性を染色する頂端に位置する分裂細胞によってさらに特徴付けられる。ビメンチンとTpx2の二重染色を行った頂端橈骨グリア細胞の分裂面を解析するために、有糸分裂紡錘体と運動間核移動中の頂端プロセスを視覚化するために使用できる微小管関連タンパク質を実行できます。このビデオを見れば、ヒト多能性幹細胞から高度に標準化された均質な前脳型オルガノイドを生成する方法について十分に理解できるはずです。

この手法は、神経組織特異的に配置された複雑な3D細胞モデルを用いて、神経発達障害のヒト特異的な側面の研究を容易にします。この技術を習得すると、これらの皮質オルガノイドは、神経発達、進化、または疾患モデリングや薬物試験や治療を含む遺伝子機能研究など、さまざまなアプリケーションに使用できます。