研究室住宅のターコイズ メダカ (による furzeri) のためのプロトコル

このプロトコルの全体的な目標は、ターコイズメダカの実験室コロニーを成功裏に育て、老化や加齢性疾患を迅速かつ高スループットで研究することです。この方法は、単一遺伝子の突然変異や環境介入が脊椎動物種の老化プロセスを調節できるかどうかなど、老化分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、基本的なプロトコルに従うことで、いくつかの研究室がターコイズメダカを使用した実験を行えるようになったことです。

一般的に、この方法に不慣れな個人は、メダカの飼育にはいくつかのユニークな特徴があるため、苦労するでしょう。例えば、胚は孵化する前に乾燥した基質で育てられますが、これはゼブラフィッシュなどの標準的な魚類モデルとは大きく異なります。まず、生後5週間のオスと6〜7週間のメス2匹ずつが入った9.5リットルの飼育タンクを設置します。

次に、プラスチック容器にオートクレーブ処理した砂を約2〜3センチの深さで満たし、サンドボックスを繁殖タンクの中央に置きます。ターコイズメダカを連続的に繁殖させ、胚の孵化のために週に一度胚を収穫します。トランスジェニック系統の注入と作製に使用する1細胞期の胚を採取するには、先ほど示したように、オス1匹とメス2匹の魚で繁殖水槽を設置します。

胚採取の2日前に、オスを個々のタンクに移し、成体のメスと視覚的に接触させてください。採集当日は、オスと砂場を繁殖水槽に加え、魚を2時間産卵させます。スポーンしてサンドボックスをタンクから取り除いた後、サンドボックスを空にしてストレーナーに入れ、システム水を使用してすすぎます。

次に、ストレーナをシステム水に部分的に沈め、胚が中央に集まるようにゆっくりと渦巻きます。2ミリリットルのパスツールピペットを使用して、胚を採取し、約40ミリリットルのシステム水が入った90ミリメートルのペトリ皿に移します。光学顕微鏡で、ペトリ皿内の胚を検査し、絨毛膜の破裂と損傷の兆候を示す胚を取り除きます。

テキストプロトコルに従って胚を漂白した後、青色に染まる死んだ胚を検査して取り除きます。胚を新鮮なメチレンブルー溶液でインキュベートしたら、発達した胚に黒い目が見えることを確認します。次に、使い捨てのパスツールピペットまたは細い湾曲したピンセットを使用して、胚を濾紙プレートに移します。

未発達の胚をメチレンブルーで保持し、毎日監視します。黒目が発達したら、それらを固体基材媒体に移します。鉗子を使用して、胚を約5ミリメートル間隔で広げ、90ミリメートルプレートあたり最大100個の胚を広げます。

次に、パラフィンを使用して皿を密封し、胚が完全に金色の虹彩を発達させて孵化の準備が整うまで、胚を摂氏28度で2〜3週間インキュベートします。最長1年間の長期保存の場合、メチレンブルー溶液で3日間インキュベートした後、示したように胚を固体基質培地プレートに移し、摂氏17度でインキュベートします。魚を孵化させるには、細い湾曲したピンセットを使用して、50〜100個の発達した胚を孵化ボックスに慎重に移し、摂氏4度で2センチメートル以下の深さのフミン酸溶液に完全に浸します。

このプロトコルの重要なステップは、乾燥基質上でインキュベートされた胚を十分な曝気を備えたフミン酸を含む孵化溶液に移すことによって達成されるメダカ胚の孵化です。孵化ボックスを蓋で覆い、孵化インキュベーターで摂氏28度でインキュベートします。十分なエアレーションを供給するには、ボックスをチューブでエアサプライに接続します。

孵化ボックス内の水質を十分に維持するために、孵化翌日から1日1回、最終的な深さを2cmに維持するオートクレーブ水が1対1の割合でボックスを補充します。孵化していない胚を固体基質に戻し、1週間後に孵化を試みます。孵化後5日で稚魚と成魚を育てるには、使い捨てのプラスチックピペットまたはプラスチックスプーンを使用して稚魚を水循環システムに移し、400マイクロメートルの稚魚スクリーンを備えた0.8リットルの水槽ごとに5匹の稚魚を慎重に移します。

生後14日で、稚魚を850マイクロメートルのフライスクリーンを備えた2.8リットルの水槽に移します。この時点から、各タンクに魚のIDをラベル付けします。サバイバルアッセイでは、各魚を1つのタンクに個別に収容します。サバイバルアッセイのために飼育された魚も、2.8リットルのタンクに個別に飼育されています。

次の7日間、1日2回、5ミリリットルのブラインシュリンプに1〜3匹の生きた血液ワームを補給して、幼魚に餌を与えます。生後4週間で、各魚に1日2回、ブラインシュリンプと1ミリリットルのブラッドワームを与えます。この段階では、オスには色の兆候がある大きな背びれ、肛門、尾びれの存在を確認し、メスには卵でいっぱいの丸い腹部の存在を確認して、魚が完全な性的成熟に達することを確認します。

ここに示されているのは、70匹のオスのターコイズメダカの代表的な生存曲線です。適切な飼育により、GRZ株の生存期間の中央値は12〜28週間になります。生存期間の中央値の変動は、食事、摂食頻度、および住居の温度条件によって異なります。

貧しい畜産の下で育てられた魚の生存曲線は、最適な飼育条件下で育てられた魚と比較して、早期死亡率の増加と時間の経過とともに生存率の突然の繰り返しの低下を明らかにしています。このプロトコルに従いながら、孵化したばかりの稚魚の水分状態と余分な食物を清潔な環境で維持することが不可欠であるため、これらを注意深く監視することが重要です。開発後、この技術は、研究者がトランスジェネシス、ゲノム編集、食事操作など、ターコイズメダカの実験的操作を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、実験室でターコイズメダカをうまく育てる方法をよく理解し、このモデルを使用して、飼育下で飼育できる最短寿命の脊椎動物の老化の生物学を探る方法を理解することができます。