Name: 高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: 学ぶ、Campylobacter jejuniの化学受容体Tlp3のリガンド結合領域をインクルージョンボディから高効率に巻き戻し・精製する方法。構造生物学と機能研究のための実用的なプロトコルです。

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ゆう c. リューにありがとう Tlp3 LBD 生産の彼の初期の作品。Mayra A. マチューカ Departamento Admistrativo de サイエンス、テクノロジー e Innovación COLCIENCIAS 博士奨学金に恩義ている。

1. 彼の6の式-Tlp3-大腸菌の LBD
<ol><li>BL21 のコドン-プラス (DE3) と 50 μ g mL-1アンピシリンを含む滅菌ルリア ベルターニカミラ (LB) スープ 150 mL を接種すると彼の6の式の pET151/D ・ TOPO ベクトル変換 RIPL 細胞 - Tlp3-LBD (アミノ酸残基 42-291) と孵化させなさいそれ (軌道直径 25 mm) シェーカーの 37 ° C で 200 rpm で一晩。</li>
	<li>流体培養基 LB の滅菌と 50 μ g mL-1アンピシリンの 800 mL を含む六つの 2 L エルレンマイヤー フラスコを準備します。各ステップ 1.1 から取得された一晩文化の 20 mL のフラスコを接種します。600 nm に達すると 0.6 の光学濃度まで 200 rpm で連続的な揺れで 37 ° C でそれらを孵化させなさい。</li>
	<li>フラスコ (未誘導コントロール サンプル)、ベンチトップ遠心分離機 (13,000 x g, 4 ° C, 10 分) を用いたペレットの 1 つから 1 mL を分注取るし、上澄みを廃棄します。後続の SDS-PAGE 解析のための-20 ° C で細菌のペレットを格納します。</li>
	<li>文化と各フラスコにイソプロピル β-D-thiogalactoside (IPTG) の 1 ミリメートルを追加することでタンパク質の発現を誘導します。さらに 4 時間 200 rpm でシェーカーの 37 ° C でフラスコ培養を続けます。</li>
	<li>4 ° C で 15 分間 5,000 × g で遠心分離によって細胞を収穫し、上澄みを廃棄します。 注: この時点で、プロシージャを一時停止できる細胞ペレットをストレージの-80 ° C のフリーザーに置くことによって。</li>
</ol>2. 分離と封入体の変性
<ol><li>250 mL のビーカーに手順 1.5 で取得したすべての細胞ペレットを転送し、100 mL のバッファー A (10 mM トリス-HCl、pH 8.0、150 mM の NaCl) を追加.細胞は、完全に (冷凍) 場合を解凍して、ペレットを再懸濁します。特に指定しない限り、氷のサンプルを保ちます。</li>
	<li>細胞を溶解し、完全なゲノム DNA のせん断を確認高圧 homogeniser を再懸濁細胞 3 回を渡します。</li>
	<li>ライセートの 4 ° C で 15 分間、10,000 × g で遠心分離します。上清 (可溶性画分) の 1 mL サンプルを収集し、後続の SDS-PAGE 解析のための-20 ° C で保存します。上澄みの残りの部分を破棄し、氷の上、ペレットを配置します。 注: このペレットは色が白い (ブラウンのシェードは、切れ目のない細胞から区別しやすい色で) 封入体が含まれていると。</li>
	<li>20 mL の氷冷バッファー B で徹底的に封入体ペレットを再懸濁します (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、0.2 mM phenylmethanesulfonyl フッ化物 (PMSF) 1% トリトン X-100)。膜と膜タンパク質の脱色が容易になります。巻き上がりを支援するために 1-2 分の渦。</li>
	<li>4 ° C で 15 分間 10,000 x g でサンプルを遠心分離し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>ボルテックス 1-2 分、ペレットが小さな断片に分割されることを確認のためチューブで 20 mL の氷冷バッファー B に徹底的にペレットを再懸濁します。ペレットの再懸濁のため上下にサンプルをピペットで移しなさい。 注: 封入体の不純物から無料を取得徹底的にペレットを再懸濁しますに重要です。</li>
	<li>手順 2.5 を繰り返します。上清が曇りまたは色の場合 2.6 と上清まで (順番) 2.5 手順はクリアで無色。</li>
	<li>ボルテックス チューブに 1-2 分 (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、0.2 mM PMSF) 20 mL の氷冷バッファー C でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>手順 2.5 を繰り返します。</li>
	<li>25 mL の冷たい変性バッファー D (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、8 M 尿素 10 mM ジチオトレイトール (DTT) 0.2 mM PMSF) 封入体ペレットを溶解するを追加します。ボルテックス 1 〜 2 分、またはペレットが小さな部分に分割するまで徹底的に再懸濁します。</li>
	<li>ミックス 4 ° C で 30-120 分の間 30 rpm の回転速度と軸の回転によって懸濁液</li>
	<li>30,000 × g、30 分のための 4 ° C での遠心分離によって変性蛋白質の解決を明らかにする、氷の上清を配置し、ペレットを破棄します。</li>
	<li>ブラッドフォードの試金を使用して蛋白質の集中を測定します。24 SDS ゲルの分析の因数を取るし、-20 ° C に配置 注: この時点で、手順スナップ凍結検体サンプルを液体窒素中で一時停止できる、ストレージの-80 ° C でそれを維持します。</li>
</ol>3. 蛋白質のリフォールディング
<ol><li>250 ml のバッファー E (3 M 尿素 100 mM トリス塩酸 pH 8.0、0.4 M L-アルギニン塩酸塩、20 mM 減少 L-グルタチオン、2 mM 酸化型グルタチオン) 500 mL ビーカーに、4 ° C までバッファーをクール</li>
	<li>彼の6を含む変性タンパク質ミックス 60 mg を追加-Tlp3-LBD がバッファーを 500 rpm で攪拌しながら 2.13 に 250 mL のバッファー E の手順で取得します。24-48 h の 500 rpm で連続攪拌しながら 4 ° C のリフォールディング ミックスを孵化させなさい。この手順で最終的なタンパク質濃度が 0.2 mg mL-1です。</li>
	<li>8-10 L バケツにバッファー A の 7 L を準備し、24-48 h で行われる次のステップ (ステップ 3.4) の準備で 4 ° C まで冷却 (図 1のフローチャートを参照してください)。</li>
	<li>28 mm 膨張した径 10 mM エチレンジアミン四酸ナトリウム塩 (EDTA Na2) 200 mL に 12-14 kDa の分子量カットオフの透析チューブの ~ 50 cm の部分を浸すし、ガスの炎で沸騰するまで加熱します。リンス 200 ml ddH2o. の透析膜</li>
	<li>透析チューブ閉鎖と透析膜の一方の端をクランプし、250 mL の透析チューブに 3.2 で得られる混合物のリフォールディングを転送します。別のクランプの開放端を閉じます。漏れがないことを確認するための膜の整合性を確認します。</li>
	<li>3.3 準備したバッファー A の予冷 7 L の透析バケツに透析チューブを配置します。電磁攪拌棒、攪拌しながら透析チューブに接触しないことを確保するに配置します。</li>
	<li>500 rpm で攪拌を続けると 4 ° C でサンプルを透析しなさい、少なくとも 4 回 12 時間の期間にわたってバッファーを変更します。最後のバッファーの変更後に一晩を透析しなさいサンプルをまま。 注意: 透析中にフォールディングする蛋白質を可能にする変性タンパク質溶液からは徐々 に尿素 (~ 3 M) の超過分は削除します。重い蛋白質の沈殿物は、透析の終わりに観察できます。</li>
	<li>バケツから透析チューブを外し、500 mL ビーカーにその内容を転送します。別段、氷上では、蛋白質溶液を維持します。</li>
	<li>任意の沈殿したタンパク質を削除する 500 mL ガラス瓶の中に 0.43 μ m 孔サイズの膜を通して蛋白質の解決をフィルターします。</li>
</ol>彼の6の清浄化・固定化金属イオンアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーを使用して蛋白質のタグ
<ol><li>
充電し、5 mL プレパックド キレート列を平衡します。
	<ol>
<li>蠕動性ポンプ、接続チューブに閉じ込められた空気がないことを確保するため列に接続します。</li>
		<li>DdH2o. の 25-50 mL を介して渡すことによって列を洗う</li>
		<li>0.1 M NiCl2の 3 mL を読み込んで、ddH2o. の 25 mL を通過して列を充電します。</li>
		<li>バッファー F (読み込みバッファー、20 mM トリス塩酸 pH 8.0、500 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール) 25 mL でコラムを平衡させ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 M トリス-HCl pH 8.0、25 mL の 5 M の NaCl と 2 M イミダゾール溶液 2.5 mL 2.5 mL を追加することによってバッファー F の組成に 3.9 手順で取得したリフォールディングモモルチャリンの蛋白質のサンプルを調整します。</li>
	<li>(自由な蛋白質) 率を 5 mL/min 以下で流れを破棄する列にサンプルをロードします。</li>
	<li>50-100 mL のバッファー F 非具体的バインドされたタンパク質を取り除き流れを破棄を洗い流します。</li>
	<li>溶出が彼の6-Tlp3-25 mL のバッファー G (溶出バッファー、トリス-HCl、20 mM 500 mM, 500 mM のイミダゾールの塩化ナトリウム) と LBD (ブラッドフォード試薬を使用してによって決まります)、蛋白質を含んでいるフロースルー分数をプール。</li>
	<li>ブラッドフォードの試金を使用してプールのサンプルの蛋白質の集中を測定します。小さなの SDS-PAGE 解析の-20 ° C の場所因数を取る</li>
</ol>5. 彼の6-タグの除去 TEV プロテアーゼ (オプション) を使用して
<ol><li>準備、バッファー H (TEV 胸の谷間バッファー、10 mM トリス塩酸 pH 8.0、150 mM の NaCl, 1% (v/v) グリセロール、2 mM DTT) 4 L 4 ° C に冷却し、なさい。</li>
	<li>透析チューブの約 5-7 cm カット (直径 2 ~ 3 cm) ddH2o. の 200 mL に浸し、</li>
	<li>彼の6を追加-彼 TEV プロテアーゼをタグ付き6-1 TEV 最終的なモル比 4.5 の手順で作製したタグ タンパク質: 8 蛋白質。</li>
	<li>透析チューブ閉鎖チューブの一方の端をクランプし、タンパク質/TEV プロテアーゼ混合物でそれを埋めます。もう一方の端を閉じて、漏れがないことを確認します。</li>
	<li>透析 (ステップ 5.1) のバッファー時間の予冷 4 L にチューブし、連続 4 ° C の孵化場所 2 h. 変更バッファーの攪拌と完了する TEV を介した開裂反応できるように一晩透析を続けます。</li>
	<li>一方で、準備し、クール (4 ° C) 4 L バッファーの (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、150 mM の NaCl, 1% (v/v) グリセロール) 次の日の準備のために。</li>
	<li>オーバー ナイト透析後手順 5.6 で覚悟のバッファーにバッファーを交換し、4 ° C でさらに 1-2 時間を透析しなさい</li>
	<li>透析バケツからチューブを削除、チューブの一方の端を外すし、タンパク質溶液を 50 mL ファルコン チューブに転送します。0.43 μ m 孔サイズのシリンジ フィルターを通してソリューションをフィルター特に明記しない限り、氷の上保管してください。</li>
	<li>サンプルの体積を測定し、バッファー F の組成にトリス, 塩化ナトリウム, イミダゾールの集中を調整 (例:バッファー J でタンパク質溶液の 25 ml を追加する 1 M トリス-HCl pH 8.0, 5 の M の NaCl の 1.75 mL 0.25 mL と 2 M イミダゾールの 0.25 mL)。</li>
	<li>手順 4.1 で説明した 5 mL HiTrap キレート HP 列を準備します。</li>
	<li>列にサンプルをロード (流量: 5 mL/分) し、フロースルー、タグなしの Tlp3 LBD (42-291 残基) が含まれている収集します。分解されていないたんぱく質、劈開、彼の6-タグと彼の6- TEV は、列で保持されます。</li>
	<li>洗い流す 5 mL バッファー F (読み込みバッファー) を通過し、溶出液を収集するすべてのタグなしタンパク質を許可します。</li>
	<li>プール、溶出液は 5.11 と 5.12 の手順で取得した、タンパク質の濃度を測定します。小さな因数を取るし、SDS-PAGE 解析のための-20 ° C で保存します。</li>
</ol>6 Tlp3 LBD のサイズ排除クロマトグラフィー (ゲル濾過)
<ol><li>バッファー A の 1 L (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、150 mM の NaCl) を準備し、0.43 μ m の膜を使ってフィルター処理します。</li>
	<li>4 mL/min の流速でバッファー A 26/60 サイズ排除カラムを平衡します。</li>
	<li>手順 5.13 15 mL 遠心濃縮器を用いた 10 kDa カットオフ (4 ° C、4,000 x g) 3-4 mL の量で得られる蛋白質のサンプルを集中します。</li>
	<li>13,000 × g、任意の沈殿したタンパク質を削除する 30 分のための 4 ° C での遠心分離によって蛋白質の解決を明らかにします。</li>
	<li>事前釣合い 26/60 ゲルろ過クロマトグラフィにサンプルをロードします。モニター UV トレース 4 mL/分の流量でバッファー A のクロマトグラフィーを実行します。Tlp3 LBD は 210-220 mL の保存ボリュームでた。ピーク画分をプールします。</li>
	<li>タンパク質濃度を測定します。小さなを取る SDS-PAGE 分析用分注。</li>
</ol>7 蛋白質の浄化の様々 な段階で収集されたサンプルの SDS ページの分析
<ol><li>1 L の SDS ページ実行バッファー (バッファー J) を用意し、25 mM を含むトリス, 250 mM グリシン pH 8.3、および 0.1% (w/v) ナトリウム dodecyl 硫酸 (SDS)。</li>
	<li>SDS ページの読み込みバッファー (バッファー K) × 5 の 10 mL を準備、0.25 M トリス-HCl pH 6.8 を含む 10% (w/v) SDS、グリセリン 50% (v/v)、1 mM DTT、0.05% ブロモフェノール ブルーします。</li>
	<li>浄化の別の手順中に収集される因数を許可 (1.3、2.3、2.13、4.6、5.13、6.6 のステップ) を再開します。</li>
	<li>各サンプルの総蛋白 5 x SDS ページの読み込み、バッファーし、ddH2O. 10 μ L にボリュームを調整の 2 μ L で 15 μ g に対応する量を混ぜる</li>
	<li>95 ° C、5-10 分でサンプルを加熱、30 s や転送のための 10,000 x g でそれらをスピン クリーン チューブにサンプル。</li>
	<li>15% ポリアクリルアミドのゲルの分離を用いた SDS-PAGE ゲルの準備 (5 mL 2.5 mL 30% (w/v) bis-アクリルアミド、1.2 mL の 1.5 M トリス-HCl pH 8.8, 1.2 mL ddH2O、50 μ L の 10% (w/v) SDS、50 μ L 20% (w/v) 過硫酸アンモニウム (AP)、3 μ L テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)5% ポリアクリルアミド ゲルのスタック (2 mL: 340 μ L 30% (w/v) bis-アクリルアミドの 250 μ L 1 M トリス pH 6.8, 1.37 mL ddH2O, 20 μ L 10% (w/v) SDS、20 μ L 20% (w/v) 2 μ L TEMED APS)。</li>
	<li>電気泳動装置を組み立てるし、製造元の推奨に従ってバッファーを実行する SDS ページ × 1 でそれを埋めます。</li>
	<li>タンパク質分子量マーカーと 7.5 の手順で作製したサンプルをロードします。25 の定電流で電気泳動を行う mA。</li>
	<li>容器にゲルを転送、Coomassie の青染色液 25% (v/v) イソプロパノール、酢酸 10% (v/v) と 0.03% (w/v) ブリリアント ブルー R-250 を含む ddH2O. 追加 150 mL でそれをすすいでください。室温で 30 分間水平回転プラットフォーム上のコンテナーを配置します。</li>
	<li>DdH2O でゲルを洗浄し、5% (v/v) メタノールと 7% (v/v) 酢酸脱染め色液に配置します。1 h の水平回転プラットフォームを使用してミキシングしながらすすぐ。</li>
	<li>ゲルをイメージし、分析します。</li>
</ol>8. 円二色性 (CD) 分光分析の二次構造リフォールディングモモルチャリンの純粋な蛋白質の
<ol><li>0.5 - 1 mg の透析チューブに 6.6 のステップで得られるリフォールディングモモルチャリンのタンパク質を転送し、5 L の L のバッファー (50 mM リン酸ナトリウム pH 7.4)、4 ° C に冷却を含む透析バケツ連続攪拌しながら 4 ° C でサンプルを透析しなさいし、少なくとも 3-4 バッファー変更を実行に一晩を透析しなさいサンプルを離れる前に 2-4 h 以上。</li>
	<li>0.06 mg mL-1 10 kDa カットオフ遠心濃縮器を用いた透析タンパク質溶液を集中します。</li>
	<li>13,000 × g、30 分のための 4 ° C での遠心分離によって解決策を明らかにします。</li>
	<li>25 ° C 以上で、性分光を用いた 20 nm 分-1のスキャン レート 200 260 nm の波長範囲でサンプルの遠紫外 CD スペクトルを記録します。空のコントロールとして透析バッファーを使用します。3 通の録音を繰り返し、平均スペクトルを生成します。</li>
	<li>二次構造体の内容を計算による CD スペクトル、DichroWeb から CDSSTR プログラムを使用してサーバー25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk)。</li>
</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

表現と細菌の化学受容器 Tlp3 のペリプラズム LBD の封入体から巻き戻しのための簡単な手順が表示されます。純粋な蛋白質の準備エシェリヒア属大腸菌、浄化および封入体の脱色でペット プラスミド エンコード遺伝子の過剰発現は、連続の親和性によって精製し変性タンパク質のリフォールディングとサイズ排除クロマトグラフィーの手順を実行します。容易に尿素変性とリフォールディング希釈/透析を介したを最適化頻繁に封入体26で堆積した蛋白質の適切な画必要となりますプロトコルで重要な手順です。
それを欠いているバッファーに対してサンプルを dialysing して、最初は、尿素を含むバッファーに変性のサンプルを希釈することによって、二段階の方法で達成された Tlp3 LBD の巻き戻し。このプロトコルを使用して得られるリフォールディングモモルチャリンのタンパク質機能と crystallisable18,23歳だった。た...

細菌の植民地化とホスト1,2,3の侵略を促進することによりカンピロバクターの病因に重要な役割を再生する走化性と運動性が示されています。走化性化学信号によって導かれて細菌の成長のための最適な環境に向かって移動することができます。このプロセスには、化学受容器と呼ばれるタンパク質や探触子のようなタンパク質 (Tlps) のセットによって細胞内および環境化学手掛かりの認識が含まれます。ほとんどの化学受容器は、表層のリガンド結合ドメイン (LBD)、膜貫通ドメインと細胞質信号ドメインの信号を転送する細胞内シグナル伝達蛋白質との相互作用を持つタンパク質を膜に埋め込まれて5,4,76,べん毛モーター。
11 の異なる化学受容器はcゲノム4,8で識別されています。これらの化学受容器の一部だけが特徴づけられているまでと Tlp1113 Tlp712Tlp411Tlp310,11Tlp19のリガンド特異性が知られています。この種の残りの化学受容器と他の細菌の多数の化学受容器の天然リガンドの同定が折り畳まれた、非常に純粋な組換え受容体リガンド14,の生産によって大幅に促進すること15,16しますただし、クローンエシェリヒア属大腸菌細菌化学受容器のペリプラズム リガンドをよく表現しようと封入体17,18,19 に彼らをターゲットに発生。.それにもかかわらず、この現象ことができます簡単に分離とリカバリを実現タンパク質の手に。ここでは、封入体からのタンパク質の回収、リフォールディングと例としてc受容体 Tlp3 のペリプラズム LBD を使用して浄化手法を提案します。この例は、Tlp3 LBD dCACHE 家族20の 2 成分ヒスチジンのキナーゼおよび原核生物20,21,の化学受容器に豊富ある検出ドメインに属するために選ばれました。22,23。
このアプローチで pET151/D ・ TOPO ベクトルに基づいた表現の構成要素は、彼の6N ターミナルを組み込む設計されています-タグの直後にタバコによってエッチング ウイルス (TEV) プロテアーゼ胸の谷間サイト、その後タグ除去19。プロトコルでは、封入体のタンパク質リフォールディング尿素減少によって尿素による脱色、分離大腸菌タンパク質発現について説明します。次のリフォールディング、サンプルは、オプションのタグ除去とサイズ排除クロマトグラフィーとのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによって浄化されます。浄化された蛋白質の折られた状態を確認するには、円偏光二色性分光法を用いた.これは、以前異種受容体、ピロリ菌TlpC19の LBD を浄化し、回復に培われたメソッドの修正版です。この手順は、図 1の要約の蛋白質の純度と純粋なタグなし Tlp3 LBD 細菌文化、1 L あたりの 10-20 mg を得られます > SDS-PAGE により見積もられた 90%。

<table><tbody><tr><td>トリスベース</td><td>AMRESCO</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>MERK MILLIPORE</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>G-BIOSCIENCES</td><td>A051-B</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフッ化物 (PMSF)</td><td>MERCK</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &β;-D-チオガラクトシド (IPTG)</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> AST0487 <tr><td>尿素</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0568</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td>C-1029</td><td></td></tr><tr><td>L-アルギニン一塩酸塩</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5131</td><td></td></tr><tr><td>還元型 L-グルタチオン</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>酸化 L-グルタチオン</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性ナトリウム (Na2HPO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性 (NaH2PO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩脱水 (EDTA)</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC20302.260</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> BIOGB0232 <tr><td>塩化ニッケル (NiCl2)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>アムレスコ</td><td>VWRC0167</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>未染色タンパク質ラダー ブロード範囲 (10-250 kDa)</td><td>NEW ENGLAND BIOLABS</td><td>P7703</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultracel 遠心濃縮器(ミリポア)</td><td>MERCK</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ファルコンチューブ</td><td>FALCON</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td><td>透析</td><td></td></tr><tr><td>スネークスキン透析チューブ</td><td>THERMO SCIENTIFIC&trade;</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>プレパック HiTrap キレート HP カラム</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>17-0408-01</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C5 高圧ホモジナイザー</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex&trade; - C5</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ P-1</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>18-1110-91</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HiLoad 26/60 サイズ排除カラム&nbsp;</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス28989336</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JASCO J-815分光偏光計</td><td>JASCO</td><td>J-815</td><td></td></tr></tbody></table>

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

化学受容器とリガンド特異性の分子基盤の解明を目指した構造研究の天然リガンドの同定は、大きく純粋な折り畳まれたリガンド結合ドメインの少量の生産によって容易にできます。クローン細菌エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 化学受容器のペリプラズム リガンド結合ドメインをよく表現しようと封入体に彼らをターゲットに発生します。ここでは、封入体、そのリフォールディング、例としてカンピロバクター (c) 受容体 Tlp3 のペリプラズム dCACHE リガンド結合ドメインを用いた精製からタンパク質の回収の手法を提案します。アプローチを含む、劈開を持つ興味の蛋白質の表現彼の6-タグ、分離および尿素を介した脱色封入体タンパク質アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによる尿素の枯渇及び精製リフォールディングタグの取り外しとサイズ排除クロマトグラフィーが続きます。円偏光二色性分光は、純粋な蛋白質の折られた状態を確認する使用されます。このプロトコルは一般的に水溶性と crystallisable フォームで他の細菌の化学受容器の dCACHE ペリプラズム リガンド結合ドメインの少量の生産に有用なそれが実証されています。

彼の6の組換え発現-Tlp3-大腸菌の LBD 封入体の蛋白質の沈殿で起因しました。ステップ 2.13 で計算された細菌培養の 1 L から式収量だった彼の6の約 100 mg-Tlp3-LBD 封入体に堆積します。封入体、タンパク質リフォールディング アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、タグの削除、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製・脱色成っている蛋白質の隔離プロシージャは、ここで説明し、図 1に示す、、純粋な、タグなし Tlp3 LBD 細菌文化の 1 L あたりの 10-20 mg を利回り。
220 mL (図 2 a) の保有量に対応する対称的な単一のピークとしてゲルろ過カラムから溶出する蛋白質。対固定ボリューム ログ (MW) の校正印刷を使用して分子...

封入体、ミリグラム単位の微量のタンパク質を生成するための精製からカンピロバクター走 Tlp3 の dCACHE ペリプラズム リガンド結合ドメインの巻き戻しプロシージャが表示されます。

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

この手順の全体的な目標は、封入体から化学受容体リガンド結合ドメインを再拡張し、構造的および機能的研究で使用するために精製することです。細菌の化学受容器がどのようなシグナルをどのように送るのかを解明するために、単離されたリガンド結合ドメインを使用して、低分子ライブラリーに対してスクリーニングしたり、リガンドの有無にかかわらず構造を決定したりすることができます。大腸菌の細胞外リガンド結合ドメインの抑制は、しばしば封入体への沈着をもたらします。ここでは、封入体からミリグラムの量の機能性タンパク質を回収する方法を示します。まず、アンピシリン1mLあたり50マイクログラムを含む150mLの滅菌LBブロスに、ヘキサヒスチジンTIp3-LBDの発現のためにpET151 D-TOPOベクターで形質転換したBL21-CodonPlus RIPL細胞を接種します。培養物を200 RPMおよび摂氏37度で一晩インキュベートします。800 mLの滅菌LBブロスと50 μg/mLのアンピシリンを含む6つの2L三角フラスコを準備します。.各フラスコに20mLの一晩培養液を接種します。フラスコを摂氏37度でインキュベートし、OD600が0.6に達するまで200RPMで連続的に振とうします。この時点で、各フラスコに1ミリモルのIPTGを添加してタンパク質発現を誘導します。フラスコを摂氏37度で200回転のシェーカーでさらに4時間インキュベートし続けます。5000 xgおよび4°Cで15分間遠心分離することにより、細胞を回収します。次に、上清を捨てます。すべての細胞ペレットを250mLのビーカーに移し、100mLのバッファーAを加えます。凍結した場合は、細胞を完全に解凍してから、ペレットを再懸濁します。特に明記されていない限り、サンプルを氷の上に置いてください。次に、再懸濁した細胞を高圧ホモジナイザーに3回通して細胞を溶解し、ゲノムDNAの完全なせん断を確保します。次に、ライセートを10, 000 xgおよび摂氏4度で15分間遠心分離します。上清の1 mLサンプルを採取し、その後のSDS-PAGE分析のために摂氏マイナス20度で保存します。次に、残りの上清を捨て、ペレットを氷の上に置きます。次に、介在物体ペレットを20mLの氷冷バッファーBに完全に再懸濁します。これにより、膜および膜タンパク質の可溶化が促進されます。サンプルを1〜2分間ボルテックスして、再懸濁を助けます。サンプルを遠心分離した後、最初にチューブを1〜2分間ボロテクスすることにより、ペレットを20 mLの氷冷バッファーBに再度完全に再懸濁します。ペレットが細かく砕かれていることを確認してください。次に、サンプルを上下にピペットで動かして再懸濁します。前回と同様にサンプルを遠心分離し、上清を捨てます。上清が濁っているか色がついている場合は、サンプルを再度遠心分離し、氷冷したバッファーBを追加で使用して再懸濁します。上清が透明で無色になるまで遠心分離と再懸濁を繰り返してから、再度ペレット化します。20 mLの氷冷バッファーCをペレットに加え、チューブを1〜2分間ボルテックスして再懸濁します。次に、サンプルを回転させた後、25 mLの氷冷変性バッファーD.チューブを1〜2分間ボルテックスすることにより、またはペレットが細かく砕けるまで、封入体ペレットを完全に再懸濁します。サスペンションを30RPMと4°Cで軸回転させて30〜120分間混合します。30, 000 xgおよび4°Cで30分間遠心分離することにより、変性タンパク質溶液を清澄化します。次に、上澄みを氷の上に置き、ペレットを捨てます。250 mLのバッファーEを500 RPMで撹拌しながら、ヘキサヒスタジンTIp3-LBDを含む変性タンパク質ミックス60 mgを加えます。リフォールディングミックスを摂氏4度でインキュベートし、500 RPMで24〜48時間連続的に撹拌します。最終的なタンパク質濃度は0.2 mg/mLです。テキストプロトコルに従って7 Lの予冷バッファーAと透析チューブを調製した後、透析チューブクロージャーを使用して透析膜の一端をクランプし、透析混合物をチューブに移します。次に、cl オープンエンドを固定し、漏れがないことを確認します。予冷したバッファーAを入れた透析バケツに透析チューブを入れ、次にマグネチックスターバーを追加して、攪拌中に透析チューブに触れないようにします。500 RPMで連続的に攪拌しながら、摂氏4度でサンプルを透析し、バッファーを12時間にわたって少なくとも4回交換します。最後のバッファー交換後、サンプルを一晩透析します。翌朝、透析チューブをバケツから取り出し、内容物を500mLのビーカーに移します。特に明記されていない限り、タンパク質溶液を氷の上に置いてください。0.43ミクロンの細孔サイズのメンブレンでタンパク質溶液を500mLのガラス瓶にろ過し、沈殿したタンパク質を除去します。テキストプロトコールに従ってキレートカラムを洗浄、充電、平衡化した後、25 mLの5 M塩化ナトリウム、2.5 mLの1 M tris-HCl、pH 8.0、および2.5 mLの2 Mイミダゾールストック溶液を添加して、得られたリフォールドタンパク質サンプルをバッファーFの組成に調整します。サンプルを毎分5 mL以下の速度でカラムにロードし、未結合タンパク質を含むフロースルーを廃棄します。次に、50 mLから100 mLのバッファーFでカラムを洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を除去し、フロースルーを廃棄します。ヘキサヒスタジンTIp3-LBDを25 mLのバッファーGで溶出し、次に、タンパク質を含むフロースルー画分をプールします。テキストプロトコルに従ってバッファーHと透析チューブを調製した後、ヘキサヒスタジンタグ付きTEVプロテアーゼをチューブ内のヘキサヒスタジンタグタンパク質に添加します。タンパク質の8に対して1TEVの最終モル比を追加します。クランプした透析チューブを予冷した4LのバッファーHに入れ、摂氏4度で2時間連続撹拌しながらインキュベートします。その後、バッファーを交換し、透析を一晩続けて、TEVを介した切断反応が完了するのを待ちます。バッファーIに交換し、タンパク質溶液をろ過し、サンプルを再度調整した後、調製した5 mLのHiTrapキレートHPカラムにサンプルをロードします。毎分 5 mL の流速で、タグなしの TIp3-LBD を含むフロースルーを回収します。切断されたタンパク質では、切断されたヘキサヒスタジンタグとヘキサヒスタジンTEVはカラムによって保持されます。5 mLのバッファーFを使用してカラムを洗浄し、タグなしタンパク質が流れるようにして溶出液を収集します。次に、サイズ排除カラムを平衡化し、テキストプロトコールに従ってタンパク質サンプルを濃縮して清澄化した後、サンプルを事前に平衡化した26/60ゲルろ過カラムにロードします。バッファーAを毎分4 mLの流速で塗布し、タンパク質の微量溶出についてUV微量をモニターします。TIp3-LBDは、210〜220mLの保持容量で溶出します。最後に、クロマトグラフィーに続いて、フラクションをプールし、タンパク質濃度を測定し、SDS-PAGEを実施します。このビデオで示したタンパク質単離手順では、細菌培養物1 Lあたり10〜20 mgの純粋なタグなしTIp3-LBDが得られました。ここに見られるように、ゲルろ過カラムから溶出されたタンパク質は、220 mLの保持量に対応し、計算された分子量が29 kDaの単一の対称的なピークを持っています。SDS-PAGEで示されているように、封入体は主にヘキサヒスタジンTIp3-LBDを含んでおり、見かけの分子量は28 kDaで、これはアミノ酸配列31.8 kDaから計算される値に近い。ヘキサヒスタジンタグの除去、アフィニティークロマトグラフィー、およびゲルろ過のステップにより、高純度のタンパク質が得られました。CDSSTRを用いたCD分光法により、ヘキサヒスチジンTIp3-LBDの二次構造は31%のα-ヘリックスと23%のβ-シート含有量で構成されていることが明らかになった。これらも、JPred 3サーバを用いた配列解析の予測値である37%と26%に近かった。このプロトコルは、開始から終了まで最低5日間を要し、必要に応じて3つの異なる段階で一時停止することができます。この手順を試みる際には、ボルテックスまたはピペッティングで上下させることにより、変性バッファー内の介在物体を完全かつ完全に再懸濁することが、この全体の実現にとって重要であることを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、化学受容体TIp3のリガンド結合ドメインを再形成し精製する方法を十分に理解できるはずです。精製されたタンパク質は、この受容体に対するリガンドの特異性を調べるための結合酸に使用できます。さらに、この手順で得られたタンパク質を使用して高度に秩序化された結晶を生成できることを以前に示し、そのリガンド特異性の構造基盤の研究への道を開きました。この手順は、他の細菌からmg量の化学受容体を結晶化および可溶性の形で産生するのに一般的に有用である可能性があります。私たちは、このプロトコルを元の形またはわずかに修正された形で使用して、結晶学的研究のためにこのタイプの他の化学受容体のリガンド結合ドメインを再折り畳みおよび精製しました。それぞれの個別のケースでは、プロトコルの最適化、例えば、変性バッファーとリフォールディングバッファーの組成、インキュベーション時間が必要になる可能性が高いことを覚えておいてください。

method-for-efficient-refolding-purification-chemoreceptor-ligand

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