高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

この手順の全体的な目標は、封入体から化学受容体リガンド結合ドメインを再拡張し、構造的および機能的研究で使用するために精製することです。細菌の化学受容器がどのようなシグナルをどのように送るのかを解明するために、単離されたリガンド結合ドメインを使用して、低分子ライブラリーに対してスクリーニングしたり、リガンドの有無にかかわらず構造を決定したりすることができます。大腸菌の細胞外リガンド結合ドメインの抑制は、しばしば封入体への沈着をもたらします。

ここでは、封入体からミリグラムの量の機能性タンパク質を回収する方法を示します。まず、アンピシリン1mLあたり50マイクログラムを含む150mLの滅菌LBブロスに、ヘキサヒスチジンTIp3-LBDの発現のためにpET151 D-TOPOベクターで形質転換したBL21-CodonPlus RIPL細胞を接種します。培養物を200 RPMおよび摂氏37度で一晩インキュベートします。

800 mLの滅菌LBブロスと50 μg/mLのアンピシリンを含む6つの2L三角フラスコを準備します。.各フラスコに20mLの一晩培養液を接種します。フラスコを摂氏37度でインキュベートし、OD600が0.6に達するまで200RPMで連続的に振とうします。

この時点で、各フラスコに1ミリモルのIPTGを添加してタンパク質発現を誘導します。フラスコを摂氏37度で200回転のシェーカーでさらに4時間インキュベートし続けます。5000 xgおよび4°Cで15分間遠心分離することにより、細胞を回収します。

次に、上清を捨てます。すべての細胞ペレットを250mLのビーカーに移し、100mLのバッファーAを加えます。凍結した場合は、細胞を完全に解凍してから、ペレットを再懸濁します。特に明記されていない限り、サンプルを氷の上に置いてください。

次に、再懸濁した細胞を高圧ホモジナイザーに3回通して細胞を溶解し、ゲノムDNAの完全なせん断を確保します。次に、ライセートを10, 000 xgおよび摂氏4度で15分間遠心分離します。上清の1 mLサンプルを採取し、その後のSDS-PAGE分析のために摂氏マイナス20度で保存します。

次に、残りの上清を捨て、ペレットを氷の上に置きます。次に、介在物体ペレットを20mLの氷冷バッファーBに完全に再懸濁します。これにより、膜および膜タンパク質の可溶化が促進されます。サンプルを1〜2分間ボルテックスして、再懸濁を助けます。

サンプルを遠心分離した後、最初にチューブを1〜2分間ボロテクスすることにより、ペレットを20 mLの氷冷バッファーBに再度完全に再懸濁します。ペレットが細かく砕かれていることを確認してください。次に、サンプルを上下にピペットで動かして再懸濁します。

前回と同様にサンプルを遠心分離し、上清を捨てます。上清が濁っているか色がついている場合は、サンプルを再度遠心分離し、氷冷したバッファーBを追加で使用して再懸濁します。上清が透明で無色になるまで遠心分離と再懸濁を繰り返してから、再度ペレット化します。

20 mLの氷冷バッファーCをペレットに加え、チューブを1〜2分間ボルテックスして再懸濁します。次に、サンプルを回転させた後、25 mLの氷冷変性バッファーD.チューブを1〜2分間ボルテックスすることにより、またはペレットが細かく砕けるまで、封入体ペレットを完全に再懸濁します。サスペンションを30RPMと4°Cで軸回転させて30〜120分間混合します。

30, 000 xgおよび4°Cで30分間遠心分離することにより、変性タンパク質溶液を清澄化します。次に、上澄みを氷の上に置き、ペレットを捨てます。250 mLのバッファーEを500 RPMで撹拌しながら、ヘキサヒスタジンTIp3-LBDを含む変性タンパク質ミックス60 mgを加えます。

リフォールディングミックスを摂氏4度でインキュベートし、500 RPMで24〜48時間連続的に撹拌します。最終的なタンパク質濃度は0.2 mg/mLです。テキストプロトコルに従って7 Lの予冷バッファーAと透析チューブを調製した後、透析チューブクロージャーを使用して透析膜の一端をクランプし、透析混合物をチューブに移します。

次に、cl オープンエンドを固定し、漏れがないことを確認します。予冷したバッファーAを入れた透析バケツに透析チューブを入れ、次にマグネチックスターバーを追加して、攪拌中に透析チューブに触れないようにします。500 RPMで連続的に攪拌しながら、摂氏4度でサンプルを透析し、バッファーを12時間にわたって少なくとも4回交換します。

最後のバッファー交換後、サンプルを一晩透析します。翌朝、透析チューブをバケツから取り出し、内容物を500mLのビーカーに移します。特に明記されていない限り、タンパク質溶液を氷の上に置いてください。

0.43ミクロンの細孔サイズのメンブレンでタンパク質溶液を500mLのガラス瓶にろ過し、沈殿したタンパク質を除去します。テキストプロトコールに従ってキレートカラムを洗浄、充電、平衡化した後、25 mLの5 M塩化ナトリウム、2.5 mLの1 M tris-HCl、pH 8.0、および2.5 mLの2 Mイミダゾールストック溶液を添加して、得られたリフォールドタンパク質サンプルをバッファーFの組成に調整します。サンプルを毎分5 mL以下の速度でカラムにロードし、未結合タンパク質を含むフロースルーを廃棄します。

次に、50 mLから100 mLのバッファーFでカラムを洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を除去し、フロースルーを廃棄します。ヘキサヒスタジンTIp3-LBDを25 mLのバッファーGで溶出し、次に、タンパク質を含むフロースルー画分をプールします。テキストプロトコルに従ってバッファーHと透析チューブを調製した後、ヘキサヒスタジンタグ付きTEVプロテアーゼをチューブ内のヘキサヒスタジンタグタンパク質に添加します。

タンパク質の8に対して1TEVの最終モル比を追加します。クランプした透析チューブを予冷した4LのバッファーHに入れ、摂氏4度で2時間連続撹拌しながらインキュベートします。その後、バッファーを交換し、透析を一晩続けて、TEVを介した切断反応が完了するのを待ちます。

バッファーIに交換し、タンパク質溶液をろ過し、サンプルを再度調整した後、調製した5 mLのHiTrapキレートHPカラムにサンプルをロードします。毎分 5 mL の流速で、タグなしの TIp3-LBD を含むフロースルーを回収します。切断されたタンパク質では、切断されたヘキサヒスタジンタグとヘキサヒスタジンTEVはカラムによって保持されます。

5 mLのバッファーFを使用してカラムを洗浄し、タグなしタンパク質が流れるようにして溶出液を収集します。次に、サイズ排除カラムを平衡化し、テキストプロトコールに従ってタンパク質サンプルを濃縮して清澄化した後、サンプルを事前に平衡化した26/60ゲルろ過カラムにロードします。バッファーAを毎分4 mLの流速で塗布し、タンパク質の微量溶出についてUV微量をモニターします。

TIp3-LBDは、210〜220mLの保持容量で溶出します。最後に、クロマトグラフィーに続いて、フラクションをプールし、タンパク質濃度を測定し、SDS-PAGEを実施します。このビデオで示したタンパク質単離手順では、細菌培養物1 Lあたり10〜20 mgの純粋なタグなしTIp3-LBDが得られました。

ここに見られるように、ゲルろ過カラムから溶出されたタンパク質は、220 mLの保持量に対応し、計算された分子量が29 kDaの単一の対称的なピークを持っています。SDS-PAGEで示されているように、封入体は主にヘキサヒスタジンTIp3-LBDを含んでおり、見かけの分子量は28 kDaで、これはアミノ酸配列31.8 kDaから計算される値に近い。ヘキサヒスタジンタグの除去、アフィニティークロマトグラフィー、およびゲルろ過のステップにより、高純度のタンパク質が得られました。

CDSSTRを用いたCD分光法により、ヘキサヒスチジンTIp3-LBDの二次構造は31%のα-ヘリックスと23%のβ-シート含有量で構成されていることが明らかになった。これらも、JPred 3サーバを用いた配列解析の予測値である37%と26%に近かった。このプロトコルは、開始から終了まで最低5日間を要し、必要に応じて3つの異なる段階で一時停止することができます。

この手順を試みる際には、ボルテックスまたはピペッティングで上下させることにより、変性バッファー内の介在物体を完全かつ完全に再懸濁することが、この全体の実現にとって重要であることを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、化学受容体TIp3のリガンド結合ドメインを再形成し精製する方法を十分に理解できるはずです。精製されたタンパク質は、この受容体に対するリガンドの特異性を調べるための結合酸に使用できます。

さらに、この手順で得られたタンパク質を使用して高度に秩序化された結晶を生成できることを以前に示し、そのリガンド特異性の構造基盤の研究への道を開きました。この手順は、他の細菌からmg量の化学受容体を結晶化および可溶性の形で産生するのに一般的に有用である可能性があります。私たちは、このプロトコルを元の形またはわずかに修正された形で使用して、結晶学的研究のためにこのタイプの他の化学受容体のリガンド結合ドメインを再折り畳みおよび精製しました。

それぞれの個別のケースでは、プロトコルの最適化、例えば、変性バッファーとリフォールディングバッファーの組成、インキュベーション時間が必要になる可能性が高いことを覚えておいてください。