混合リジン型/アルギニン型モノマーおよびそれらの抗リーシュマニア活性の評価とペプトイドの合成のための効率的な方法

この手順の全体的な目標は、同じペプトイド配列内にリジン型とアルギニン型の両方のモノマーを導入し、顧みられない熱帯病皮膚リーシュマニア症の原因寄生虫であるリーシュマニアメキシコに対するこれらの化合物の活性を評価することです。皮膚リーシュマニア症には新しい治療法が緊急に必要とされており、この手順は、この顧みられない熱帯病の新しいクラスの潜在的な抗感染症としてペプトイドを特定し、開発するのに役立ちます。このプロトコルの主な利点は、混合カチオン性機能を含むペプトイドを合成できることです。

これは、配列の生物学的活性を調節するのを助けることができるので、非常に望ましいです。この寄生虫は哺乳類型に対して試験を行いますが、Leishmania mexicanaの昆虫期に対しても使用したり、哺乳類の細胞株に適用したりすることもできます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、合成の段階的な性質と、リーシュマニアメキシカーナのライフサイクルのさまざまな時点での寄生虫の培養を示すため、非常に便利です。

この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、ジメチルホルムアミドで溶液を準備します。次に、0.1ミリモルのFmoc保護リンクアミド樹脂を、2つのフリットが付いたキャップ付きの20ミリリットルポリプロピレン反応容器に加えます。5ミリリットルのジメチルホルムアミドを加え、容器を室温で60分間放置します。

次に、固相抽出真空プラットフォームを使用してDMFを排出します。次に、調製したピペリジン溶液を2ミリリットル加えます。容器を室温で450RPMのシェーカープラットフォームに置き、5分間振とうします。

バキュームステーションを使用して溶液を排出します。次に、2ミリリットルのピペリジン溶液を加え、同じ条件で15分間振とうします。振とうが完了したら、バキュームステーションで溶液を排出します。

DMFを2ミリリットル加え、30秒間混合してレジンを洗浄します。DMFを水気を切り、洗浄を3回繰り返します。サブモノマー合成を開始するには、調製したブロモ酢酸溶液1ミリリットルと調製したDIC溶液0.2ミリリットルを追加します。

室温で20分間振とうします。次に、溶液を排出し、毎回2ミリリットルのDMFを使用して3回洗浄します。調製したアミン溶液を1ミリリットル加えます。

その後、樹脂を室温で60分間振とうします。溶液を水気を切り、毎回2ミリリットルのDMFを使用してレジンを3回洗浄します。次に、ブロモ酢酸溶液1ミリリットルとDIC溶液0.2ミリリットルを加えます。

室温で20分間振とうします。次に、溶液を排出し、毎回2ミリリットルのDMFを使用して3回洗浄します。グアニジン官能化モノマーを導入するには、1ミリリットルの保護されていないジアミン溶液を樹脂に加えます。

室温で60分間振とうします。その後、溶液を水気を切り、2ミリリットルのDMFでレジンを3回洗浄します。調製した2-アセチルジメドン溶液0.5ミリリットルを加えます。

室温で60分間振とうします。その後、溶液を水気を切り、2ミリリットルのDMFでレジンを3回洗浄します。目的の配列が作成されるまで、サブモノマー合成を続けます。

次に、調製した4ミリリットルのヒドラジン溶液を加え、室温で3分間振とうします。溶液を排出し、3回繰り返します。その後、1回の洗浄で2ミリリットルのDMFを使用してレジンを3回洗浄します。

DIPEAと、遊離アミンあたり6等量のピラゾール-1-カルボキサミジンをペプトイド配列に添加します。室温で60分間振とうします。振とうが完了したら、溶液を排出します。

レジンは、1回の洗浄に2ミリリットルのジクロロメタンを使用して3回洗浄します。樹脂を10分間風乾し、将来の使用のために保管します。アミン添加後にテストクリーブを行い、合成の進行を確認することができます。

最終的な切断を開始するには、合成に使用したのと同じフリット反応カートリッジに4ミリリットルの切断カクテルを加え、容器を覆います。室温で90分間振とうします。次に、フリット反応容器を使用して、樹脂からの切断カクテルを丸底フラスコにろ過します。

ロータリーエバポレーターを使用して劈開カクテルを蒸発させます。2ミリリットルの無水ジエチルエーテルを加えて、ペプトイドを沈殿させます。ピペットを使用して、ジエチルエーテルを取り出して廃棄します。

その後、ジエチルエーテル沈殿を3回繰り返します。沈殿が完了したら、粗ペプチドを調製したアセトニトリルおよび酸性水溶液10ミリリットルに溶解します。事前に計量した容器に移します。

その後、マイナス20°Cで凍結し、逆相HPLCによる精製準備が整った乾燥粉末に凍結乾燥します。リーシュマニア・メキシカーナ寄生虫を培養し、無軸性アマスチゴート病期に形質転換した後、テキストプロトコルに概説されているように化合物ストック溶液を調製して細胞毒性アッセイを開始します。テキストプロトコルで概説されているように、2マイクロリットルの5ミリモルペプトイドストック溶液、アムホテリシンBコントロール、およびDMSOコントロールを96ウェルプレートの最上列に加えます。

マルチチャンネルピペットを使用して、48マイクロリットルの新鮮な培地を一番上の列に加えます。他のすべての列に25マイクロリットルの新鮮な培地を追加します。次に、上の列から25マイクロリットルの溶液をピペッティングし、下の列に加えて混合することにより、段階希釈を行います。

プレート全体に対して希釈を繰り返し、最後の25マイクロリットルを最下列からピペッティングして廃棄します。次に、寄生虫培養物を50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。447 回 g で 5 分間遠心分離します。

古い培地を注ぎ、10ミリリットルの新鮮な培地を追加します。次に、ピペットを使用して、寄生虫のペレットを新しい培地に穏やかに再懸濁します。ノイバウアーの改良型血球計算盤を使用してカウントし、培養物をミリリットルあたり800万寄生虫に希釈します。

培養物を希釈した後、各ウェルに25マイクロリットルの寄生虫を加えます。プレートを摂氏32度で60分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、各ウェルから40マイクロリットルの溶液を取り出します。

各ウェルに90マイクロリットルの新鮮な培地を加え、摂氏32度で24時間インキュベートします。次に、10マイクロリットルのレサズリンベースの細胞生存率溶液を各ウェルに加えます。摂氏32度で4時間インキュベートします。

インキュベーションが完了したら、プレートリーダーを使用して蛍光を測定します。平均バックグラウンドを除去し、DMSOコントロールに対する切除による標準化後のウェルの蛍光を比較することにより、データを分析します。この研究では、それぞれ120ミリグラムのリンクアミド樹脂を使用して2つのペプトイドを合成します。

逆相高圧液体クロマトグラフィーにより生成物を精製し、目標質量に対応する画分を組み合わせ、白色粉末として得る。2つのペプトイドについて収集された量は、純度が90%を超える画分で約30%の収率でここに示されています。製品の純度は、分析用逆相HPLCを使用して評価され、アミド骨格の吸光度である220ナノメートルで視覚化されます。

ペプトイドは両方とも均質であることがわかります。L Mexicanaに対する細胞毒性アッセイの代表的な結果をここに示します。化合物の5ミリモルストック溶液は、細胞培養グレードのDMSOで作られ、堅牢なデータを確保するために少なくとも2回トリプリケートで試験されます。

ペプトイドBは、ペプトイドAよりも生存可能な寄生虫の割合を減らすのに効果的であり、どちらも用量依存的な効果を持っていることがわかります。この分析法を見た後、リジン型モノマーとアルギニン型モノマーの両方を含むペプトイドを合成、特性評価、精製する方法、およびリーシュマニアメキシコに対する細胞毒性アッセイでこれらを使用する方法について十分に理解できるはずです。ペプトイドにデュアルカチオン性機能を付加する方法は、一般的に使用されるペプトイド合成のサブモノマー法に、さらに1つの簡単なステップを追加するだけです。

この方法に従って、長さの異なるリジンまたはアルギニン型サブモノマーを添加して、例えば、炭素数が2〜6の側鎖を持つなど、ライブラリーの多様性を高めることができます。ペプトイド合成を試みる際には、不要な製品の追加や削除を防ぐために、ステップの合間にレジンをよく洗うことを忘れないことが非常に重要です。この方法は、研究者が混合カチオン官能基化ペプトイドの生物学的活性を調査し、この活性をリジンまたはアルギニン型モノマーのみを含むものと比較する道を開きます。

最後に、このプロトコルで使用される寄生虫やいくつかの試薬は非常に危険であることを忘れないでください。したがって、常に適切な個人用保護具を使用し、必要に応じてドラフトまたは微生物学的安全キャビネット内で作業することが重要です。