シリアル結晶の結晶 x 線回折その場その場での動的光散乱のためのマイクロ流体チップ

この手順の全体的な目標は、室温でタンパク質の結晶化X線回折データ収集のためのマイクロ流体デバイスを製造および操作することです。この技術の主な利点は、チップ内部の結晶化により、タンパク質結晶の機械的障害が最小限に抑えられることです。これらのX線透過チップは、製造が容易で、ほとんどのシンクロトロンビームラインのゴニオメーターに直接取り付けることができ、X線回折データを収集する際に利用可能な結晶を効率的に利用することができます。

まず、アルミホイルで裏打ちされた10cmのシャーレにX線チップ設計のマスターモールドを置きます。合計約30gのPDMSベースと硬化剤を10対1の割合で混合し、PDMSをマスターに4mmの高さまで注ぎます。真空デシケーターでPDMSを5分間脱気し、空気を吹き付けてPDMSの表面に残っている気泡を取り除きます。

PDMSを70°Cのオーブンで1時間硬化させます。次に、硬化したPDMSモールドをマスターからそっと剥がします。メスを使って余分なPDMSを切り取ります。

X線チップを製造する前に、エポキシモールドキャスティング中に必要なすべての機器とコンポーネントに簡単にアクセスできるようにワークスペースが配置されていることを確認してください。チップ製造を開始するには、二成分エポキシ樹脂の前駆体をエタノールで希釈し、最終エタノール質量濃度が40重量%になるようにします。ボルテックスミキサーを使用して、エポキシ樹脂とエタノールを混ぜ合わせます。

PDMSモールドを真空デシケーターで30分間脱気し、後でPDMSがエポキシ樹脂から小さな気泡を吸収できることを確認します。70mm×70mmの7.5ミクロン厚のポリイミド箔をカットし、75mm×50mmのスライドガラスに巻き付けます。ホイルの端をスライドの背面にテープで固定して、平らで硬いポリイミド表面を形成します。

スライドバックポリイミドホイルを酸素プラズマで20秒間処理します。次に、ホイルをAPTSまたはGPTSの1容量%水溶液で摂氏20度で5分間インキュベートします。シラン化中は、エポキシ樹脂前駆体溶液を小さなヘラで十分に混合します。

脱気したPDMSモールドを真空デシケーターから平らな面に移します。シラン化ポリイミド箔を加圧空気または窒素ガスで乾燥させます。樹脂混合物の液滴を金型上の各微細構造にすばやく塗布します。

スライド裏面のポリイミドホイルを下向きにしてエポキシ樹脂に置き、スライドをしっかりと押し下げます。アセンブリをプラスチックホイルと金属シートで覆います。金属シートに重りを置き、アセンブリに最大1.4ニュートン/平方センチメートルの圧力を加えます。

15分後、スライドガラスをエポキシパターンのポリイミドホイルからそっと分離し、ポリイミドホイルを乾くまで拭きます。プラスチックホイル、金属シート、重りを上に戻します。エポキシを室温で1時間硬化させます。

その後、重り、金属シート、プラスチックホイルを取り外します。パターン化されたポリイミド箔をPDMS型からそっと剥がします。パターン化されたホイルを20秒間プラズマ処理し、前述のように、パターン化されたホイルをAPTSまたはGPTSでシラン化します。

同じ条件下で、手付かずのポリイミド箔を他のシラン溶液と一緒にシラン化します。両方のホイルを加圧空気で乾かします。次に、脱イオン水を一滴、清潔で乾燥した平らな面に塗布します。

ポリイミド箔に個々のチップ構造を切断し、パターン化されたポリイミド箔エポキシ面を上にして水滴に置き、完全に平らになるまで箔を慎重に滑らかにします。2 番目のポリイミド箔を、シラン化した面を下にして、パターン化された箔の上に置きます。2番目のホイルを角から反対側の角にやさしく手で滑らかにして、気泡を排出し、ポリイミドシートを接着します。

アクセスポートの製造を開始するには、硬化した4mmのPDMSスラブから、結晶化コンパートメントを覆うことなくポリイミドX線チップのすべてのポートを覆うのに十分なサイズのブロックを切り取ります。ポリイミドチップとPDMSブロックをプラズマ処理、シラン化、乾燥します。処理されたブロックをポートを介してチップに押し込みます。

チップをプラスチックホイル、きれいなスライドガラス、金属シートで覆います。1平方センチメートルあたり1.4ニュートンの圧力を1時間加えます。次に、0.75 mm の生検パンチを使用して、チップ設計でマークされた入口と出口の穴を開けます。

チップの裏側をポリイミドフィルム電気絶縁テープでシールします。次に、透明フッ素樹脂コーティング材の9重量%原液をフッ素系溶剤で0.45重量%に希釈します。27ゲージ、5/8インチの針をシリンジに接続します。

ポリテトラフルオロエチレンチューブを針の端に取り付けます。フッ素樹脂溶液を1ミリリットルのルアーロックシリンジに入れます。チューブのもう一方の端をX線チップアウトレットに接続します。

フッ素樹脂溶液をチップ内に注入し、すべてのチャネルが満たされるまで注入し、空気を充填したシリンジを使用して余分なフッ素樹脂溶液を除去します。充填されたチップを平らな面を下にして、摂氏190度のホットプレートに置きます。チップを5分間加熱して溶媒を蒸発させ、チャネルをフッ素樹脂でコーティングします。

結晶化手順の前に、選択したタンパク質溶液を0.2ミクロンフィルターでろ過します。溶液を16、100倍g、摂氏20度で15分間遠心分離し、結晶化実験のために上清を回収します。結晶化手順を開始するには、等量のタンパク質溶液とその沈殿剤を組み合わせます。

この混合物の約20マイクロリットルを注射器に引き込みます。27ゲージ、5/8インチの針とPTFEチューブを使用して、シリンジをX線チップの入口に接続します。フッ素化オイルのシリンジを同じ方法で出口に接続します。

顕微鏡でチップを監視しながら、結晶化溶液を入口からチップに並列レイアウトで充填します。チップ内の結晶化コンパートメントを分離するために、十分なフッ素化オイルを注入します。次に、入口ポートと出口ポートの両方をペーパークリップまたはその他の細いプラグで塞ぎます。

チップは適切な結晶化条件下で保管してください。結晶形成は、顕微鏡下または動的光散乱測定によって観察できるようになりました。データ収集の準備ができたら、両面テープを使用して、X線チップをプレートゴニオメーター用の3Dプリントアダプターに固定します。

チップアダプターをシンクロトロンビームラインのプレートゴニオメーターに取り付けます。回折データを収集して解析します。明視野顕微鏡を使用して、ポリイミド箔チップの結晶化チャンバーからの水の蒸発速度を定量化しました。

動的光散乱は、同等の形状のスライドガラス上のPDMSチップ内のソーマチン結晶の初期核形成を検出でき、結晶化条件の最適化が可能になりました。ポリイミドチップで成長した83個のソーマチン結晶のそれぞれから、各フレームで1度の回転で10の回折パターンが収集されました。データセットをフレームごとに5つのサブデータセットに分割し、正規化された回折電力の経時的な強度減衰を評価しました。

4番目のデータセットまでに、回折電力は50%未満に減少しましたサブデータセットの測定R係数値は時間とともに増加し、データ収集中に結晶が放射線損傷を受けたことを示しています。これは、X線曝露中に生成されたフリーラジカルが、同じコンパートメント内の隣接する結晶を劣化させることに起因していました。二錐体ソーマチン結晶は、X線チップ内で広範囲の配向を持っていました。

斜方晶グルコースイソメラーゼ結晶も同様に、ポリイミドチップで成長すると、広範囲の配向性を示しました。しかし、チオレドキシン結晶は主にxy、xz、およびyz平面に配向を持っていました。これは、その細長い形状が原因である可能性があります。一般に、これらのチップは非常に堅牢で、X線バックグラウンドが低くなっています。

これにより、この作製法は、小角X線散乱などの他のX線イメージング技術に適しています。この手順は、お客様の実験ニーズに合わせて簡単に適応させることができます。たとえば、チップの設計は、個々のコンパートメントの寸法やチップあたりのコンパートメントの総数を調整することで変更できます。

私たちが特に重視したのは、専用ツールやマイクロ流体ポンプなど、コストのかかる機器を必要としないワークフローを設計することでした。このビデオを見て原稿を読んだ後、チップ内での結晶化方法、結晶化プロセスのモニタリング方法、チップアプローチを使用した回折データの記録と分析方法を十分に理解しているはずです。この手法を習得すると、専用のクリーンルームを必要とせずに、PDMSマスターからマイクロ流体チップのバッチ製造が約3時間で可能になります。