Name: シリアル結晶の結晶 x 線回折その場その場での動的光散乱のためのマイクロ流体チップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学ぶ マイクロ流体チップを用いたタンパク質結晶化とX線回折データ収集の方法。動的光散乱で結晶化をモニタリングし、室温で高品質な構造データを取得する技術を習得できます。

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この作品は、ピア シード基金 PIF-2015-46 によって支えられた、BMBF 付与、ドイツの '超高速イメージング-構造、ダイナミクス、原子スケールでの物質の制御のためのハンブルク中心部' 卓越したクラスターと 05K12GU3、05K16GUA研究振興協会 (DFG)。自由電子レーザー研究センターと共著の作業指向プログラム資金によるヘルムホルツ協会によって資金を供給されました。EMBL ハンブルクでペトラ III ストレージ リング (DESY, ハンブルク, ドイツ) で放射光 MX データを集めた P14 運営のビームラインが。

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<li>Schubert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicrystal+diffraction+data-collection+approach+for+studying+structural+dynamics+with+millisecond+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution.</a> IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat. Commun. 5, 3309(2014).</li>
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<li>Destremaut, F., Salmon, J. -B., Qi, L., Chapel, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+with+on-line+dynamic+light+scattering+for+size+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements.</a> Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).</li>
<li>Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+integrated+synthesis+and+dynamic+light+scattering+measurement+of+block+copolymer+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles.</a> Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).</li>
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<li>Boukellal, H., Selimović, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li>
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</ol>

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窓材として材料とポリイミド箔を充填エポキシ樹脂のパターニングによる x 線回折その場観察のためのマイクロ流体デバイスを作製します。私たちの手順は、以前 x 線チップ デザイン16,21以上作製プロセスの様々 なステップを最適化されています。我々 はウィンドウの厚さを減少、それにより作製も緩和しながら散乱背景として少ないプロセスの手順が必要です。その場で結晶化が記述されているプロトコルを使用してには、実質的な利点があります。室温で回折データ収集し、それによっていくつかのケースでタンパク質構造の人工物を導入するリスクを含んだ低温保護の必要性を除外します。さらに、ネイティブな環境から結晶の転送を避けることができるため、結晶はありません物理的なストレスの対象となります。このプロシージャを介して結晶は最高品質を維持し、任意の治療に苦しむしません。
私たちの経験ではプロトコルの中で最も重要な手順の結晶化プロセスを制御する中心です。適切な寸法と適切な結晶を x 線を取得するパラメーターを経験的に識別する必要があり、蒸気拡散実験から直接撮影することはできません。同一濃度のタンパク質と鉛塩法を使用して常にされませんでした別のチップ、または時同じチップ内でさまざまな坑井の結晶。これは結晶の核生成と成長に影響を与えるすべての要因を (蒸発軌道) を通じて母酒の組成や結晶化速度など、慎重に検討する必要があることを示します。大きい水晶は、高い解像度に回折、適当に大きな結晶が理想的に成長してください。結晶核生成と成長のプロセスは、DLS 測定後すること。~ 50 μ m の中レーザーの焦点を調整するチップの薄い結晶コンパートメントは挑戦することができ、慎重に手動位置合わせを必要とする場合があります。100 μ m よりも深い井戸を用いたレーザー自動整列だった可能で信頼性が高く、自動取得スキームを通じて複数の井戸を監視することが。
ポリイミド ベース x 線チップ生産のみ低バック グラウンドと 3 つのタンパク質のモデル構造を解くことによってルーチン x 線回折データ収集のためのこれらの装置の適合性を示します。大きくタンパク質結晶と従来の x 線データ コレクションから以前達成の解像度と比較してチップの最高解像度が異なっていた。さらに結晶化条件の最適化がさらに回折を向上、これはいくつかの要因かもしれません。最大適用クリスタルが 30 μ m より小さい寸法 1.8 Å 分解能その場回折データを収集することが可能だった。タウマチン回折データの詳細な分析は、放射線被害についての洞察を提供しました。放射線被害の拡張を制限するには、隣接結晶とラジカルの拡散が起こり、マイクロ流体デバイスのコンパートメントあたり 1 つだけの単結晶を公開する必要があります。データ収集の速度を向上させる、これを将来に自動化する必要があります。
結晶形態のためいくつかのケースで配向が発生ことができます。これだったたとえばチオレドキシン データセットの場合、結晶強く配向チップ windows を基準。ここでも、完全な回折データセットを収集することができます。結晶がチップの配向を展示し、特に対応する空間群にも低対称性がある場合、データセットの完全性監視してくださいコレクションされている十分な回折パターン杖、その場合収集。
ポンプ ・ プローブによる反応を誘起光を用いた場合、これらのチップを用いた時間分解研究が直接可能です。ポンプ レーザー用ポリイミド箔の光透過が解明する、また、ポリイミドを光学的にオフする必要があります。 または coc 認証も使用できます。現在のマイクロ形状は基板結晶が成長した後に実験を混合できないようにします。しかし、このような両方の時間分解 x 線回折のためのデザインを混合し同様散乱アプローチ19にも適応するのに記載されている x 線チップ作製プロトコルを見込んでいます。

蛋白質の 3 D 構造を知ることは、その機能を理解することが不可欠です。近く原子分解能の構造は、最もよく、x 線結晶構造解析によって得られるところ。このテクニックを公開タンパク質結晶 x 線放射と精製と構造決定の結果として得られる回折パターンを分析しています。伝統的な x 線結晶構造解析、完全な回折データセットは、極低温における単一、理想的には大きなクリスタルから記録されます。ただし、このような結晶が成長し、些細な大抵ないと適当な低温保存条件を識別することができますそれ自体困難になるし、時々 またネイティブ蛋白質構造5からの逸脱を引き起こす可能性があります。
X 線自由電子レーザ (FEL) および放射光ビームラインにおける最近の技術の進歩より小さい結晶構造を解決するために許可している、新しいマイクロ集束ビームライン増加 x 線ビームの輝きと改善された x 線検出器になった利用可能な6,7。通常、小さい水晶はより大きく成長し、欠陥の遊離結晶8,9やすくなっています。しかし、小さな結晶 x 線照射損傷の大きい水晶よりもはるかに高速に苦しみます。これは大きな結晶に比較するため、同等の解像に回折により小さい結晶ボリュームに高い x 線の線量を投影する必要があります。したがって、でも低温保護はしばしば不十分である単一微小結晶から完全な回折データ セットを記録です。
このハードルを克服するためにシリアルの結晶を回収して完全なデータセットを取得する多くのランダム配向結晶からの回折パターンを結合する選択の方法となっています。放射線 x 線線量が合計を広めることで誘起結晶被害を最小限高結晶5,10数以上のタンパク質の構造を解決するために使用します。'回折破壊する前に' 自由電子レーザー実験、各結晶はあくまでフェムト秒 x 線パルスを使用して 1 つの露出のため。第 3 世代放射光源でマイクロ フォーカス ビームライン順番数ミリ秒短い x 線露光11,12,13,14シリアル結晶構造解析を実行できます。水晶発振またはデータ収集中に回転、しかし、部分的なブラッグ反射だけ記録できる、それゆえ数万人またはより多くの回折パターンが通常構造決定15必要。これまでサンプル配信方法の多様なセットとして開発されたシリアルの結晶学の最近の見直し14,16,17,18,19。中で、いくつかの固定ターゲット ベース サンプル配信など大幅より少ない回折パターンを提供できる、同様に完全なデータセットも低消費しながら正常に x 線露光中に結晶回転と結合された戦略サンプルと比較して古典的なシリアルの結晶学への静止画が、実験記録7,16,20,21,22,23,24。
低 x 線バック グラウンドを持つマイクロ流体デバイスを作製するためのプロトコルを提案します。デバイスのソフト ・ リソグラフィーを用いた 5 分エポキシ接着剤からパターン化されているし、部屋の温度でその場x 線回折実験の場合として x 線セットアップに直接試料を統合するから利益を得るために適しています。次のミキシング誘起動力学18,19時間分解の研究。マイクロ流路、高分子ポリイミド箔、複合厚低 x 線背景イメージングを可能にする約 16 μ m で x 線窓の両側に蓋をします。すべての使用された材料は、良い耐溶剤性を提供します。この工法は、比較的簡単で安価なです。SU 8 マスター基板の調達後、典型的な研究ラボ設定でクリーン ルーム外すべての製造を完了できます。
ゴニオ メーター ベースの固定ターゲット シリアル結晶構造解析アプリケーションの例では、チップをについて説明します。まず、microfluidically ナノリットル サイズの液滴の選択した番号に水性反応を分割するキャピラリー valving を使用しての設計と試作に関する考慮事項を説明します。このローディング機構はチャネルのデッド ボリュームからサンプル損失を回避し、分割することができます簡単に手動で実行する流体の作動のためのポンプやその他の機器を使用せず。タンパク質溶液のような分離ナノリットル サイズ滴監視対象はその場で動的光散乱 (DLS) を使用して制御タンパク質の結晶核生成と成長します。以前、DL 測定をガラス スライド25,26に結合したポリジメチルシロキサン (PDMS) 構造体から成るマイクロ流体デバイスで実行できることが実証されています。ポリイミド膜は 550 より波長が長いため高伝送のため nm、アプローチを拡張する単位の x 線透明チップだけでなく、適切なレーザー波長27,28を使用する場合。DL の結果に基づいて、初期核生成が観察できますとさらに液滴蒸発を停止して、少ないが大きなタンパク質の結晶を得ることができます。
十分な結晶が成長した、完全な x 線回折データセット、収集できます室温でターゲット シリアル x 線回折その場固定ベース角度計を使用します。回折データセットは、蛋白質結晶構造を解決するために一連のソフトウェア ツールとカスタム スクリプトを使用して処理されます。この手法は、従来の結晶学実験で使用される低温保存中に生じる工芸品を回避できます。
私たちは約を使用して解決された 3 つの蛋白質ターゲット構造比較 10-20 μ m の小さな結晶が良いし、2 Å 分解能にチップで成長して。結晶化とその場で、処理およびそれ故に機械的回折によって壊れやすい結晶の妨害が最小限に抑えられます。このプロトコルは、タンパク質結晶回折の高解像度と低解像度 (3.0 Å に 1.7 Å) に適用できます。ほぼすべてのクリスタルは回折のために使えるので、小さなサンプルは、非常に効率的な結晶配信メソッドに浪費されています。
このプロトコルは、蛋白質結晶化と回折データ収集その場x 線透明マイクロ流体チップを準備する方法の詳細なガイドを提供します。手順は、実験室での高度な機器を必要とせずマイクロ精度の恩恵を慎重に設計されました。また、非専門家による専門的なゴニオ メーターや、結果の再現を容易にするため加湿器を必要とせず放射光ビームラインでのデータ コレクションを実行できます。紹介したテクニックは、低温保護または結晶処理によるシリアル ミリ秒結晶学データ収集のため室温照射損傷を最小限に維持しながら、成長後の結晶に応力を導入することがなく適用できます。したがって、この方法はタンパク質結晶化プロジェクトに適しています。

<table><tbody><tr><td>SU-8 3000系</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3000</td><td>フォトレジスト</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>現像液</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td></td><td></td><td>溶剤</td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td>溶剤</td></tr><tr><td>エポキシ接着剤</td><td>UHU</td><td>Plus Schnellfest 5 分</td><td>エポキシ接着剤</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>ダウ コーニング</td><td>シルガード 184</td><td>シリコーン</td></tr><tr><td>カプトン箔</td><td>デュポン/アメリカのデュラフィルム</td><td>HNグレード、ゲージ30(7.5 &mu;m)</td><td>ポリイミド箔</td></tr><tr><td>APTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>化学</td></tr><tr><td>薬品 GPTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440167</td><td>化学薬</td></tr><tr><td>品 Cytop CTX-109AE</td><td>旭硝子(株</td>) <td>Cytop CTX-109AE</td><td>Cytop(サイトップ)フッ素樹脂コーティング</td></tr><tr><td>CT-Solv 100E</td><td>旭硝子(株</td>) <td>CT-Solv 100E</td><td>Cytop(サイトップ)フッ素樹脂</td></tr><tr><td>HFE-7500</td><td>3M</td><td>Novec 7500</td><td>フッ素系オイル</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk Inc.</td><td>AutoCAD</td><td>CADソフトウェア</td></tr><tr><td>生検パンチ</td><td>ハリス</td><td>ユニコア0.75 mm</td><td></td></tr><tr><td>フォトマスク</td>JD<td>写真データ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3インチウェーハ</td><td>大学ウェーハ</td><td></td>シリコン<td>ウェーハ</td></tr><tr><td>マスクアライナーS</td><td>&Uuml;SS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>マスクアライナー</td></tr><tr><td>PDMSミキサー</td><td>Thinky</td><td>ARE-250</td><td></td></tr><tr><td>プラズママシン</td><td>ディーナー電子</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7638</td><td>タンパク質</td></tr><tr><td>グルコース イソメラーゼ</td><td>ハムトンリサーチ</td><td>HR7-102</td><td>タンパク質</td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td>化学</td></tr><tr><td>酒石酸ナトリウム</td><td>メルク</td><td>106664</td><td>化学</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763.2</td><td>化学</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td>化学</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A4418</td><td>化学</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>化学</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>1064060250</td><td>化学</td></tr><tr><td>PEG1500</td><td>分子寸法</td><td>MD2-100-6</td><td>化学</td></tr><tr><td>SPGバッファー</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>CSS-389</td><td>化学</td></tr><tr><td>SpectroLight600</td><td>XtalConcepts</td><td></td><td>DLS機器</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>分光光度計</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker2</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>3Dプリンター</td></tr><tr><td>Form2 Formlabs</td><td></td><td></td><td>3Dプリンター</td></tr><tr><td>Amicon Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>0.2 & micro;m フィルター</td></tr><tr><td>チューブ</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td>Bioblock/05</td><td>PTFE チューブ 0.3 mm 内径 x 0.76 mm</td></tr><tr><td>シリンジ&nbsp;</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1ml ルアーロックチップ</td></tr><tr><td>ニードル&nbsp;</td><td>テルモアガニ針</td><td>AN*2716R1</td><td>27Gx5/8インチ</td></tr></tbody></table>

シリアル結晶の結晶 x 線回折その場その場での動的光散乱のためのマイクロ流体チップ

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

このプロトコルでは、ゴニオメータ ベースの固定ターゲット シリアル結晶構造解析のために最適化された低 x 線バック グラウンドで加工マイクロ流体デバイスについて説明します。デバイスはソフト ・ リソグラフィーを用いたエポキシ接着剤からパターン化されているし、室温でその場x 線回折実験に適しています。サンプル井戸低 x 線バック グラウンドを持つ回折データ収集を許可する高分子ポリイミド箔窓の両側には、蓋をします。この製作方法は多くを求めない安価です。SU 8 マスター基板の調達後、典型的な研究ラボ環境でクリーン ルーム外すべての製造を完了できます。チップの設計と試作のプロトコルは、microfluidically 定義ナノリットル サイズの液滴に水性反応を分割するキャピラリー valving を利用します。このローディング機構チャネル デッド ボリュームからサンプル損失を回避し、簡単に流体の作動のためのポンプやその他の機器を使用せず手動で実行することができます。我々 はどのように分離ナノリットル サイズ タンパク質溶液滴できますが監視対象の in situ動的光散乱制御タンパク質の結晶核生成と成長にについて説明します。適切な結晶を成長した後、室温でターゲット シリアル x 線回折その場固定ベース ゴニオ メーターを使用して完全な x 線回折データセットを収集できます。プロトコルは、ソフトウェア ツールのスイートを使用して解決し、蛋白質結晶構造を絞り込む回折データセットを処理するカスタム スクリプトを提供します。このアプローチでは、工芸品の低温保存または従来の結晶学実験の処理マニュアルの結晶中に誘発する可能性を回避できます。チップで育つ約 10-20 μ m の寸法で小さい水晶を使用して解決された 3 つの蛋白質の構造を比較し、.結晶化とその場で、処理およびそれ故に機械的回折によって壊れやすい結晶の妨害が最小限に抑えられます。プロトコルは、その場でシリアル結晶構造解析に適したカスタム x 線透明マイクロ流体チップを作製する方法を説明します。ほぼすべてのクリスタルは、回折データ収集の使用ことができます、これらのマイクロ チップ、非常に効率的な結晶配信方法です。

このプロトコルでは、作製し、室温での x 線回折データ収集のためのマイクロ流体デバイスを操作する方法について詳しく説明します。さらに、動的光散乱法によるタンパク質の結晶化を監視する方法を説明し、処理し、分析する方法得られた回折データ。

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

この手順の全体的な目標は、室温でタンパク質の結晶化X線回折データ収集のためのマイクロ流体デバイスを製造および操作することです。この技術の主な利点は、チップ内部の結晶化により、タンパク質結晶の機械的障害が最小限に抑えられることです。これらのX線透過チップは、製造が容易で、ほとんどのシンクロトロンビームラインのゴニオメーターに直接取り付けることができ、X線回折データを収集する際に利用可能な結晶を効率的に利用することができます。まず、アルミホイルで裏打ちされた10cmのシャーレにX線チップ設計のマスターモールドを置きます。合計約30gのPDMSベースと硬化剤を10対1の割合で混合し、PDMSをマスターに4mmの高さまで注ぎます。真空デシケーターでPDMSを5分間脱気し、空気を吹き付けてPDMSの表面に残っている気泡を取り除きます。PDMSを70°Cのオーブンで1時間硬化させます。次に、硬化したPDMSモールドをマスターからそっと剥がします。メスを使って余分なPDMSを切り取ります。X線チップを製造する前に、エポキシモールドキャスティング中に必要なすべての機器とコンポーネントに簡単にアクセスできるようにワークスペースが配置されていることを確認してください。チップ製造を開始するには、二成分エポキシ樹脂の前駆体をエタノールで希釈し、最終エタノール質量濃度が40重量%になるようにします。ボルテックスミキサーを使用して、エポキシ樹脂とエタノールを混ぜ合わせます。PDMSモールドを真空デシケーターで30分間脱気し、後でPDMSがエポキシ樹脂から小さな気泡を吸収できることを確認します。70mm×70mmの7.5ミクロン厚のポリイミド箔をカットし、75mm×50mmのスライドガラスに巻き付けます。ホイルの端をスライドの背面にテープで固定して、平らで硬いポリイミド表面を形成します。スライドバックポリイミドホイルを酸素プラズマで20秒間処理します。次に、ホイルをAPTSまたはGPTSの1容量%水溶液で摂氏20度で5分間インキュベートします。シラン化中は、エポキシ樹脂前駆体溶液を小さなヘラで十分に混合します。脱気したPDMSモールドを真空デシケーターから平らな面に移します。シラン化ポリイミド箔を加圧空気または窒素ガスで乾燥させます。樹脂混合物の液滴を金型上の各微細構造にすばやく塗布します。スライド裏面のポリイミドホイルを下向きにしてエポキシ樹脂に置き、スライドをしっかりと押し下げます。アセンブリをプラスチックホイルと金属シートで覆います。金属シートに重りを置き、アセンブリに最大1.4ニュートン/平方センチメートルの圧力を加えます。15分後、スライドガラスをエポキシパターンのポリイミドホイルからそっと分離し、ポリイミドホイルを乾くまで拭きます。プラスチックホイル、金属シート、重りを上に戻します。エポキシを室温で1時間硬化させます。その後、重り、金属シート、プラスチックホイルを取り外します。パターン化されたポリイミド箔をPDMS型からそっと剥がします。パターン化されたホイルを20秒間プラズマ処理し、前述のように、パターン化されたホイルをAPTSまたはGPTSでシラン化します。同じ条件下で、手付かずのポリイミド箔を他のシラン溶液と一緒にシラン化します。両方のホイルを加圧空気で乾かします。次に、脱イオン水を一滴、清潔で乾燥した平らな面に塗布します。ポリイミド箔に個々のチップ構造を切断し、パターン化されたポリイミド箔エポキシ面を上にして水滴に置き、完全に平らになるまで箔を慎重に滑らかにします。2 番目のポリイミド箔を、シラン化した面を下にして、パターン化された箔の上に置きます。2番目のホイルを角から反対側の角にやさしく手で滑らかにして、気泡を排出し、ポリイミドシートを接着します。アクセスポートの製造を開始するには、硬化した4mmのPDMSスラブから、結晶化コンパートメントを覆うことなくポリイミドX線チップのすべてのポートを覆うのに十分なサイズのブロックを切り取ります。ポリイミドチップとPDMSブロックをプラズマ処理、シラン化、乾燥します。処理されたブロックをポートを介してチップに押し込みます。チップをプラスチックホイル、きれいなスライドガラス、金属シートで覆います。1平方センチメートルあたり1.4ニュートンの圧力を1時間加えます。次に、0.75 mm の生検パンチを使用して、チップ設計でマークされた入口と出口の穴を開けます。チップの裏側をポリイミドフィルム電気絶縁テープでシールします。次に、透明フッ素樹脂コーティング材の9重量%原液をフッ素系溶剤で0.45重量%に希釈します。27ゲージ、5/8インチの針をシリンジに接続します。ポリテトラフルオロエチレンチューブを針の端に取り付けます。フッ素樹脂溶液を1ミリリットルのルアーロックシリンジに入れます。チューブのもう一方の端をX線チップアウトレットに接続します。フッ素樹脂溶液をチップ内に注入し、すべてのチャネルが満たされるまで注入し、空気を充填したシリンジを使用して余分なフッ素樹脂溶液を除去します。充填されたチップを平らな面を下にして、摂氏190度のホットプレートに置きます。チップを5分間加熱して溶媒を蒸発させ、チャネルをフッ素樹脂でコーティングします。結晶化手順の前に、選択したタンパク質溶液を0.2ミクロンフィルターでろ過します。溶液を16、100倍g、摂氏20度で15分間遠心分離し、結晶化実験のために上清を回収します。結晶化手順を開始するには、等量のタンパク質溶液とその沈殿剤を組み合わせます。この混合物の約20マイクロリットルを注射器に引き込みます。27ゲージ、5/8インチの針とPTFEチューブを使用して、シリンジをX線チップの入口に接続します。フッ素化オイルのシリンジを同じ方法で出口に接続します。顕微鏡でチップを監視しながら、結晶化溶液を入口からチップに並列レイアウトで充填します。チップ内の結晶化コンパートメントを分離するために、十分なフッ素化オイルを注入します。次に、入口ポートと出口ポートの両方をペーパークリップまたはその他の細いプラグで塞ぎます。チップは適切な結晶化条件下で保管してください。結晶形成は、顕微鏡下または動的光散乱測定によって観察できるようになりました。データ収集の準備ができたら、両面テープを使用して、X線チップをプレートゴニオメーター用の3Dプリントアダプターに固定します。チップアダプターをシンクロトロンビームラインのプレートゴニオメーターに取り付けます。回折データを収集して解析します。明視野顕微鏡を使用して、ポリイミド箔チップの結晶化チャンバーからの水の蒸発速度を定量化しました。動的光散乱は、同等の形状のスライドガラス上のPDMSチップ内のソーマチン結晶の初期核形成を検出でき、結晶化条件の最適化が可能になりました。ポリイミドチップで成長した83個のソーマチン結晶のそれぞれから、各フレームで1度の回転で10の回折パターンが収集されました。データセットをフレームごとに5つのサブデータセットに分割し、正規化された回折電力の経時的な強度減衰を評価しました。4番目のデータセットまでに、回折電力は50%未満に減少しましたサブデータセットの測定R係数値は時間とともに増加し、データ収集中に結晶が放射線損傷を受けたことを示しています。これは、X線曝露中に生成されたフリーラジカルが、同じコンパートメント内の隣接する結晶を劣化させることに起因していました。二錐体ソーマチン結晶は、X線チップ内で広範囲の配向を持っていました。斜方晶グルコースイソメラーゼ結晶も同様に、ポリイミドチップで成長すると、広範囲の配向性を示しました。しかし、チオレドキシン結晶は主にxy、xz、およびyz平面に配向を持っていました。これは、その細長い形状が原因である可能性があります。一般に、これらのチップは非常に堅牢で、X線バックグラウンドが低くなっています。これにより、この作製法は、小角X線散乱などの他のX線イメージング技術に適しています。この手順は、お客様の実験ニーズに合わせて簡単に適応させることができます。たとえば、チップの設計は、個々のコンパートメントの寸法やチップあたりのコンパートメントの総数を調整することで変更できます。私たちが特に重視したのは、専用ツールやマイクロ流体ポンプなど、コストのかかる機器を必要としないワークフローを設計することでした。このビデオを見て原稿を読んだ後、チップ内での結晶化方法、結晶化プロセスのモニタリング方法、チップアプローチを使用した回折データの記録と分析方法を十分に理解しているはずです。この手法を習得すると、専用のクリーンルームを必要とせずに、PDMSマスターからマイクロ流体チップのバッチ製造が約3時間で可能になります。

microfluidic-chips-for-situ-crystal-x-ray-diffraction-situ-dynamic

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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迅速なIII-Vヘテロ特徴付けのための電子チャネリングコントラストイメージング

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シリアル結晶の結晶 x 線回折その場その場での動的光散乱のためのマイクロ流体チップ

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