洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出

この手順の全体的な目標は、膜タンパク質または他のタンパク質との間の界面活性剤感受性相互作用を検出することです。この手順では、1つのタンパク質がヒスチジンタグ付きで細胞内で過剰発現し、もう1つのタンパク質がmycタグ付きペプチドである必要があります。この方法は、生化学の重要なタンパク質相互作用研究の分野における質問に答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、界面活性剤に敏感な方法で膜タンパク質間の相互作用を検出できることです。手続きは迅速かつ簡単です。この方法は、膜タンパク質相互作用に関する洞察を提供しますが、弱いタンパク質相互作用の研究にも使用できます。

この方法を思いついたのは、膜タンパク質であるサルティリンとGLUT4の間の相互作用を調べたいと思ったときでしたが、哺乳類の溶解からそれらを共免疫沈降させる試みは成功していません。ペプチドを注文するには、相互作用に重要なペプチドの標的配列を選択し、配列の末端またはC末端にmycエピトープを追加します。ペプチドが到着したら、超純水中のペプチドの作業溶液1ミリリットルあたり100マイクログラムをpepareします。

3つの3T3-L1前脂肪細胞を4つの10cm培養皿に播種し、インキュベーターに保管します。次に、2つの培養皿に6X histodynで標識した標的タンパク質をトランスフェクションし、他の2つの皿に2つのコントロールプラスミドでHISPとして標識し、WTとして標識します。トランスフェクション後、細胞をインキュベーターに48時間放置して、80〜90%の密度に達します。細胞ライセートを調製するには、4°Cに冷却した1X緩衝生理食塩水10ミリリットルで細胞を氷上で3回洗浄します。

次に、それぞれに500マイクロリットルの溶解バッファーを追加します。次に、細胞スクレーパーを使用して細胞を皿から分離し、ライセートを調製します。各培養皿から調製した細胞溶解物を4本の別々の1.5mmチューブに移し、すべてのチューブに標識します。

次に、細胞溶解物を26ゲージの針で上下に5回シリンジに通し、細胞全体を溶解します。次に、細胞ライセートを16000xgで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を同じラベルの付いた4つの新しいチューブに移します。

将来のトラブルシューティングおよび制御実験のために、20マイクロリットルの細胞溶解物を分注し、摂氏20度で保存します。後で使用する場合は、洗浄バッファーを塩酸でPH8で滴定してPH6を取得し、バッファーを摂氏4度で保存します。次に、コバルトビーズの均質な懸濁液を調製するために、ボトルを慎重に渦巻かせます。

次に、40マイクロリットルのコバルトビーズ懸濁液を、個別にマークされた4本のチューブすべてに移します。コバルトビーズを加えた後、チューブに1ミリリットルの溶解緩衝液を加えます。次に、チューブを1000xgで5秒間遠心分離します。

上清を捨て、沈殿したビーズに40マイクロリットルの溶解緩衝液をピペットで移します。次に、細胞ライセートを対応するチューブに移し、チューブローテーター上で摂氏4度で90分間インキュベートします。90分後、サンプルを1000xgで5秒間遠心分離します。

次に、Flowthrough-1とラベル付けされた上清を回収し、摂氏20度で保存します。次に、PH8を含む500マイクロリットルの洗浄バッファーを個々のチューブに加え、ビーズを穏やかに再懸濁します。チューブを1000xgで5秒間遠心分離し、上清を排出します。

次に、ラベルに従ってPH8または6の洗浄バッファーをチューブに加え、ビーズをしっかりと懸濁します。チューブを1000xgで5秒間遠心分離し、上清を排出します。ペプチドと水緩衝液の1ミリリットルあたり1マイクログラムの作業溶液をPH6または8で調製します。

次に、100マイクロリットルのペプチド溶液を、同様のPHに対応する洗浄したビーズに加えます。その後、ビーズを4°Cでチューブローテーターに30分間インキュベートします。次に、4つのマイクロカラムを取り、それらを標識し、Flowthrough-2とラベル付けされたコレクションチューブにカラムを配置します。インキュベーションが終了したら、インキュベーション混合物をカラムに加えます。

溶液を重力で通過させ、流れからサンプルを収集します。カラムを新しいコレクションチューブに入れ、摂氏20度で保管します。次に、PH6またはPH8のいずれかを含む500マイクロリットルの洗浄バッファーを重力流で個々のカラムに通し、フロースルーを廃棄します。

この手順を 4 回繰り返します。チューブを1000xgで5秒間遠心分離します。Elutionとラベル付けされた新しい収集チューブにカラムを置きます。

結合していないペプチドを取り除くために、すべてのチューブ内のビーズを非常に注意深く均等に洗浄することが重要です。洗浄したビーズに、ベータメルカプトエタノールを含む40マイクロリットルのトリシンサンプルバッファーを加えます。室温で20分間放置します。

カラムを8000xgで2分間遠心分離します。カラムを廃棄し、収集チューブを摂氏100度で10分間加熱します。その後、1000xgで5秒間遠心分離します。

あるいは、洗浄したビーズに40マイクロリットルの溶出イミダゾール緩衝液を加え、室温で20分間インキュベートします。インキュベーション終了後、チューブを8000xgで2分間遠心分離します。カラムを廃棄し、40マイクロリットルのトリシンサンプルを追加します。

収集チューブを摂氏100度で10分間加熱し、次に1000xgで5秒間遠心分離します。市販の10-20%トリシングラジエントゲルを使用してください。Tris/Tricine/SDSランニングバッファーを使用し、溶出したサンプルと全ライセートをそれぞれ20マイクロリットルずつゲルにロードし、電気泳動ユニットの運転を開始します。

電気泳動が終了したら、20%メタノールを添加した転写バッファーを使用して、ゲルから0.45μmのニトロセルロース膜に材料を移します。メンブレンを塞いだ後、水平にカットします。次に、膜下部に抗His P抗体を付着させた膜上部を、抗myc抗体を塗布した膜下部をプローブします。

GLUT4のコバルトビーズ上の固定化ソーチリン間の相互作用を研究するために、イムノブロット分析を行いました。細胞ライセートと溶出液を野生型およびSortilin-myc/Hisタグ付きトランスフェクト3T3-L1細胞から入手し、SDSページにロードしました。ブロットを抗myc抗体でプローブしました。

ブロットは、トランスフェクションされた溶出液から110 kilodotin Sortili-myc/Hisタグと5 kilotin myc-first luminal loop-GLUT4を示しています。次に、PHの重要性と、コバルトビーズに固定化されたSortilinとGLUT4との間の相互作用を研究するために、イムノブロット分析を行いました。このアッセイでは、Mycファースト管腔ループGLUT4を、PH6およびPH8の両方でSortilin-myc/Hisタグ付きタンパク質を固定化したビーズとインキュベートしました。

このブロットは、Sortilin-myc/Hisタグトランスフェクトされた3T3-L1細胞から得られた溶出液のPH6および8つで、Sortilin-myc/Hisとmyc-first管腔ループGLUT4との間の明確な相互作用を示しています。この手法を習得すると、サンプルが西洋の血液分析の準備が整うまで、3〜4時間で完了します。この手順を試行する際には、できれば水に溶けるペプチドを設計することを忘れないでください。

結果を強化するために、架橋後の免疫沈降などの他の方法を実行することができます。このビデオを見れば、界面活性剤に敏感な手順で膜タンパク質、タンパク質相互作用を検出する方法について十分に理解できるはずです。また、タンパク質断片間の相互作用を探索することもできます。

ソフトなリズミカルなジャズ。