Name: 洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学ぶ膜タンパク質相互作用の検出法。ソルチリンとGLUT4の結合を例に、洗剤に敏感な条件下でヒスチジンタグとマイクタグを用いて膜タンパク質間の相互作用を検出する生化学的手法です。

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この作品は、DK52057 と K.V.K. X.P に NIH から DK107498 は、NIH からの研修制度の助成金 2T32DK007201 によって支えられた研究補助金によって支えられました。

1. ペプチドの取り扱い
<ol><li>デザインとペプチドの順序<ol>
<li>ペプチドの任意のシーケンスを選択し、myc エピトープ (EQKLISEED) でそのいずれか N- または C 末端などのタグを追加します。</li>
		<li>ペプチドの溶解度電卓 http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php を用いた水中ペプチドの予測の溶解度をチェックします。溶解度が低い場合は、電荷バランスを変更する別の水溶性タグを追加ましょう。 注意: 使用して GLUT4 myc エピトープ (太字) タグの最初の内腔ループ (fll) に対応するペプチド N 末端 (Myc-fll-GLUT4): 水に「良い」予測への溶解度は、 EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA.</li>
		<li>注文少なくとも 75% のカスタムのペプチド純度、試金のためだけで十分ですし、溶解テストのプロバイダーに依頼します。ペプチドの溶解と予期しない問題がある場合、少なくとも 2 つの因数に順序を分けます。 注: 2 つの因数で Myc fll GLUT4 が命じられました。純水で溶解性報告は ≤10 mg/mL です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ペプチドの溶解 注: 超純水は最高の溶剤です。水溶性ペプチドが表示されない場合は、手順については http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html を参照してください。<ol>
<li>純水または 100 μ g/mL の濃度で選択、バッファーの中のペプチドの実用的なソリューション x 100 を準備します。</li>
		<li>50-100 μ 因数にソリューションを分離し、-20 ° C で保存</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細胞の取り扱い
<ol><li>細胞培養<ol>
<li>否定的な制御、および 6 ヒスチジン (HisP) が付いたターゲット蛋白質を発現する細胞として野生型 (WT) セルを使用します。 注意: 3T3 L1 前脂肪細胞安定発現するソーティリン myc/彼5を使用します。</li>
		<li>ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 高糖度, 10% 牛ウシ血清を添加した細胞を成長グルタミン (2 mM) とペニシリン/ストレプトマイシン (5 μ g/mL) 10% CO2の 37 ° C で。</li>
		<li>細胞の 4 つの 10 cm 皿に座る、HisP とそれらの 2 つを transfect し、transfect 制御プラスミド (WT) と他の 2 つ。トランスフェクション後 48 時間は、電池が 80-90% の confluency に達する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セル Lysates の準備<ol>
<li>換散バッファー (10 mM Hepes、30 mM の NaCl、5% グリセロール、10 mM のイミダゾール、0.5% トリトン X-100 およびプロテアーゼ抑制剤のカクテル edta、pH 7.4 の彼の付けられた蛋白質の分離) を準備し、4 でそれを維持 ° c:</li>
		<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 4 ° C で × 1 の 10 mL で 3 回セルを洗浄します。</li>
		<li>氷の上の皿を入れて、それぞれの皿に換散バッファーの 500 μ L を追加します。細胞スクレーパーを使用してセル lysates を収穫します。</li>
		<li>場所別 1.5 mL チューブに各皿から細胞ライセート。WT pH6、WT pH8、HisP pH6、HisP pH8 チューブ ラベルを付けます。</li>
		<li>セル lysates を通過注射器 26 G 針、5 回上下、完全溶解。</li>
		<li>4 ° C で 10 分間 16,000 x g でセル lysates を遠心分離します。</li>
		<li>培養上清を新しい同じラベルの付いたチューブに転送します。</li>
		<li>BCA タンパク質アッセイ キットや他のキットを使用して蛋白質の集中を分析します。</li>
		<li>換散バッファーを使用すると、すべての 4 つの溶解液のタンパク質濃度を均等化します。</li>
		<li>各ライセートの小 (約20 μ L) 因数を分離可能な制御実験やトラブル ・ シューティングのための-20 ° C で保管してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. HisPur コバルト ビーズに彼の付けられた蛋白質の結合
<ol><li>市販の洗浄バッファーを使用または 1 つ (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール、pH 8) を準備し、4 ° C で維持</li>
	<li>準備洗浄バッファーを幸せそうな洗浄バッファー pH 8 による pH 6 塩酸維持それ 4 ° C で</li>
	<li>均質な懸濁液にコバルト ビーズのボトルを軽く旋回します。</li>
	<li>上記のようについた 4 つの 1.5 mL チューブ (ステップ 2.2.4) にコバルト ビーズ懸濁液 40 μ L を分注します。</li>
	<li>各管に 1 mL の溶解バッファーを追加し 5 s. 吸引、上澄みの 1000 x g でチューブを遠心し、定住ビーズに換散バッファーの 40 μ L を追加します。</li>
	<li>対応する管にセル lysates を追加します。</li>
	<li>4 ° C で 20 rpm 管回転で 90 分の管を孵化させなさい。</li>
	<li>遠心分離機管 1000 g は 5 s、収集清 x。4 ° C で上澄みを維持します。</li>
	<li>対応するチューブに pH 8 の pH 6 洗浄バッファー 500 μ L を追加し、再優しくビーズを中断します。</li>
	<li>5 s と破棄のため 1000 x g でチューブを遠心培養上清。</li>
	<li>手順 3.9 および 3.10 を 4 回。</li>
</ol>4. ビーズに固定化した彼の付けられた蛋白質をペプチドの結合
<ol><li>PH 6 または 8 の pH 洗浄バッファー (各 2 つ 100 μ 因数、1 μ g/mL) で稼動するソリューション x 1 ペプチド (ステップ 1.2.1) の 100 倍実用的なソリューションを使用して準備します。</li>
	<li>対応する pH と洗浄のビーズに 1 x ペプチド溶液 100 μ L を追加します。</li>
	<li>4 ° C で 20 rpm 管回転で 30 分のビーズをインキュベートします。</li>
	<li>5 1,000 x g でチューブを遠心分離機 s、上澄みを収集し、-20 ° C でそれを維持</li>
	<li>手順 3.9 および 3.10 を 4 回。 注: 可能なバック グラウンドを低減するために次の手順は 4.4 と 4.5 の手順を置き換えることができます。</li>
	<li>30 μ m の孔を持つ 4 つのマイクロ列を取り出して 2.2.4 には、ステップのようにラベルを貼ってコレクション チューブに列を配置します。</li>
	<li>4.3、ステップの終了時は、列にインキュベーション混合物を転送後、は、重力によって通過するソリューションを許可します。-20 ° C で流れを維持します。</li>
	<li>重力によって洗浄バッファー pH 6 または pH 8 対応する列との 500 μ L を渡します。流れを破棄します。</li>
	<li>手順 4.8 4 回繰り返します。</li>
	<li>最後の洗浄後遠心 15 1,000 x g で列 s。</li>
</ol>5. コバルト ビーズから溶出
<ol><li>商業トリシン サンプル バッファーを使用 (200 mM トリス-HCl、40% のグリセロール、2% SDS 0.04% pH 6.8 ブルー) と β-メルカプトエタノールを加える最終濃度 2%。</li>
	<li>ビーズ洗浄と渦サンプル (β-メルカプトエタノール) とトリシン サンプル バッファーの 40 μ L を追加します。</li>
	<li>100 ° C で 10 分間のサンプルを熱渦再度、サンプル 5 1,000 x g でチューブを遠心分離機と s。 注: 溶出の可能な非特異的結合を減少するために次の手順は手順 5.1 5.3 を置き換えることができます。</li>
	<li>洗浄に溶出イミダゾール バッファー (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM の NaCl、0.25 M イミダゾール) の 40 μ L を追加ビーズ、渦と 20 分間室温でチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>3,000 x 30 g のチューブを遠心分離機 s、上清 (溶出サンプル) を収集し、新しいラベルの付いた管にそれを転送します。</li>
	<li>各管にトリシン サンプルバッファーの 40 μ L を追加、100 ° C、渦および遠心分離機で 10 分間のサンプルを加熱チューブ 5 1,000 x g で s。 注: は、20 分間インキュベート マイクロ列を使用すると、洗浄のビーズに溶出バッファーを追加する場合と 2 分 8,000 × g で遠心分離して溶出を収集します。 注: サンプルは電気泳動の実行まで、-20 ° C で保存できます。</li>
</ol>6. 電気泳動および西部にしみが付くこと
注: サンプルは SDS のページおよびそれに続く西部のしみによる分離の準備ができています。ゲル電気泳動 (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) 次の修正のプロトコルに従ってください。
<ol><li>市販の 10-20% トリシン勾配ゲルを使用します。</li>
	<li>ゲル、溶出サンプルの 20 μ L と 20 μ L の lysates (ステップ 2.2.10) をロードします。トラブルの撮影のため、非連結材 (ステップ 3.8) の 20 μ L をロードお勧め 10 ペプチド; ng、読み込み前にこれらのサンプルをトリシン サンプル バッファーの等しい量を追加します。</li>
	<li>商業トリス/トリシン/SDS バッファー (100 mM 100 mM トリシン、トリスと 0.1 %sds、pH 8.3) を実行しているの電気泳動を行います。</li>
	<li>転送バッファー (25 mM Tris ベース、192 mM グリシン、pH 8.4) 20% メタノールを添加したを使用して 0.45 μ m ニトロセルロース膜にゲルから材料を転送します。</li>
	<li>3% の膜をブロック ウシ血清アルブミン (BSA) 室温で 1 時間。事前にステンド グラスの分子量のマーカーを使用すると、ガイドとして、膜を水平にカット、HisP、抗体と上の部分のしみ、myc タグ付きペプチドを識別する myc エピトープ抗体に底の部分のしみ。 注: 特定の例、膜の切削は必要ありません HisP と Myc fll GLUT4 は反 myc 抗体を検出できるので。</li>
</ol>7. 結果の分析
<ol><li>イメージ ステーションや ImageJ のプログラムを使用してすべての西部のしみの信号の強さを定量化します。</li>
	<li>両方の pH 値で HisP から信号に対して myc タグ付きペプチドから信号を正規化します。</li>
</ol>

<ol><li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li>
<li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sugar+is+sIRVed%3A+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li>
<li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li>
<li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li>
<li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li>
<li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shortcut+to+the+lysosome%3A+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li>
<li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li>
<li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95%2Fsortilin%2C+a+non-G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li>
<li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li>
<li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li>
<li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li>
</ol>

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ソーティリンは両方のシグナル伝達の細胞膜と細胞内の並べ替えイベント6,7に関連する進化的保存されている複数のリガンド蛋白質受容体です。ただし、本格的なソーティリン配位子 (一部が内腔や不可欠な膜蛋白質) の検索は、その結合パートナーのいくつかとソーティリンの相互作用が洗剤に敏感であるように複雑です。したがって、簡単および蛋白質蛋白質の相互作用を研究するための広範なアプローチ co-免疫沈降を容易に適用できません。いくつかの研究グループは、ソーティリンとその潜在的な配位子8,9の間の対話を示す co 免疫沈降を使用しています。しかし、これらの実験実施されている 0.1% のいずれかトリトンまたは 0.6% チャップス膜可溶化の完成度に疑問をキャスト。
他の研究者は、表面プラズモン共鳴10、</s...

GLUT4 はそれが食後血ブドウ糖クリアランス1インスリンの効果を仲介する脂肪と骨格筋細胞に主に発現するグルコース輸送タンパク質です。非常に安定したタンパク質であること、GLUT4 は翻訳後修飾レベルで調整されます。インスリンのない場合は、GLUT4 は、主細胞膜 (それゆえ低グルコースの基底透水性) から除外され、主に小さなインスリン応答性小胞 (IRVs) の細胞内局在とトランスゴルジ ネットワーク (TGN) を表す可能性があります。IRV ドナー コンパートメントです。インスリン投与時に、IRVs は細胞膜と融合し、その機能のサイトに GLUT4 を提供します。脂肪細胞、骨格筋細胞に血液からブドウ糖取り込み上昇する 10 倍、これはグルコースの細胞膜の透過性を増加します。インスリン離脱後 GLUT4 は並べ替えと初期エンドソームに取り込ま、TGN、IRVs、再結成に取得されます。両方の並べ替え手順 GLUT4 経路、すなわち末梢早期エンドソームから核 TGN に取得し、IRVs の形成の TGN ドナーの Vps10p 家族のメンバー、ソーティリンは、型を表しますで膜が有効 I膜貫通型タンパク質と並べ替えの受容体。1 つのモデルによるとソーティリンは、膜貫通足場蛋白質として働く: それはエンドソームと TGN の内腔の GLUT4 を連結して、その C 末端の2、 、ドナー膜を介して細胞質側にレトロマーやクラスリン アダプターを募集3。 これは容易に細胞内コンパートメント間 GLUT4 を若し小胞のキャリアへの GLUT4 の分配。
ソーティリンの細胞質テール レトロマーとさまざまなアダプター蛋白質との相互作用はよく記載されています。ただし、ソーティリン GLUT4 (とその他のタンパク質のリガンドのいくつか) のバインドに証明するためにチャレンジしております。特に、co immunoprecipitate ソーティリンと GLUT4 の試みこれらの 2 つの蛋白質間の相互作用の洗剤に敏感な性質のためにおそらく成功されていません。また、典型的な輸送体タンパク質 GLUT4 が 12 の膜貫通ドメインと六つの内腔ループの組み合わせはソーティリン結合部位を表すことができる可能性があります。同時に酵母 2 ハイブリッド系の架橋膜透過性の DSP との相互作用のセルで、実質的なの共局在などの間接証拠の大きいボディは、そのソーティリンは GLUT4 にバインドすることをお勧めします。さらに、変異をスキャン アラニンと組み合わせで後者のアプローチを使用して、以前決定した GLUT4 の最初の内腔のループに主にソーティリンの Vps10p ドメインがバインドされていること。しかし、哺乳類細胞でこのような相互作用の証拠が行方不明になっています。ここでは、酸性の環境でのようなソーティリン コバルト樹脂を使用し、pH 6 および 8 の pH で GLUT4 の最初の内腔ループに対応する化学的に合成されたペプチドがやり取りできることを示した transfected 3t3-l1 細胞からの彼の付けられた分離した、エンドソーム内腔と TGN 膜の内腔で中立的な環境。同じビーズで非トランスフェクト細胞から調製した抽出物を読み込んだ制御実験のペプチド結合が見つかりませんでした。

<table><tbody><tr><td>ヒスチジンタグタンパク質</td><td></td>リン酸緩衝生理食塩水の精製に使用する<td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td>Sigma <td>P8849</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>PBS</td></tr><tr><td>1mL インスリンシリンジ U-100</td><td>BD</td><td>329652</td><td>26G x 1/2</td></tr><tr><td>BCA タンパク質アッセイキット</td><td>Pierce</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td></td><td>His-tag タンパク質精製用</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-234</td></tr><tr><td>HisPur Cobalt Resin</td><td>Thermo Scientific</td><td>89964</td><td></td></tr><tr><td>Tricine sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0739</td><td>SDS付き、bメルカプタエタノールを添加すべき</td></tr><tr><td>溶出&nbsp;バッファー</td><td>ボストンバイオプロダクツ</td><td>BP-236</td><td>250mMイミダゾール</td></tr><tr><td>ミニプロティアントリストリシンプレキャストゲル10-20%&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>456-3115</td><td>ペプチドと低分子タンパク質</td></tr><tr><td>の分離用 Tris/Tricine/SDS ランニングバッファー&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0744</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-190</td><td>20% メタノール</td></tr><tr><td>ニトロセルロース膜を追加&nbsp; 0.45 mm</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>抗 Myc 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>2272</td><td>Rabbit</td></tr><tr><td>Peptide</td><td>Genscipt</td><td></td><td>注文をカスタマイズする</td></tr><tr><td>プレシジョンプラスプロテイン デュアルカラー Standarts</td><td>BioRad</td><td>161-0374</td><td></td></tr></tbody></table>

洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

蛋白質蛋白質の相互作用を探索する我々 の能力は、セル内の規制の接続を理解する鍵です。ただし、多くの場合タンパク質-タンパク質相互作用の検出は、重要な実験課題に関連付けられます。特に、並べ替えの受容体は、これらの蛋白質の免疫沈降の co を使用できなくなり、洗剤に敏感なファッション多いの膜区画のルーメン内タンパク質貨物と対話します。グルコーストランスポーター GLUT4 を膜タンパク質相互作用弱い内腔の例として役立つことを並べ替えの受容体ソーティリンの結合。ここでは、ソーティリンと GLUT4 の相互作用を検証するための高速、シンプル、かつ安価な試金を記述します。そのため設計し、GLUT4 の内腔の一部の潜在的なソーティリン-結合エピトープに対応する myc タグ付きペプチドを化学合成した.6 ヒスチジンが付いたソーティリンは、哺乳類細胞で発現され、コバルト ビーズを用いたセル lysates から分離されました。ビーズに固定化したソーティリンが異なる pH 値でペプチド溶液で培養された、溶出の材料は西部にしみが付くことによって分析しました。この試金は簡単に他の洗剤に敏感なタンパク質間相互作用の研究に適応することができます。

Lysates 3T3 L1 細胞安定発現するソーティリン myc/彼5と WT 3T3 L1 細胞、ネガティブ コントロールとして使用からの調製。両方の lysates は pH 6 または 8 の pH でコバルト ビーズをインキュベートされ、徹底的に洗浄します。固定された蛋白質とビーズ、Myc fll Glut4 のソリューションで培養。注意して洗浄後 0.25 M イミダゾールとビーズに結合蛋白質が溶出しました。勾配ゲルが両方の検出ソーティリン myc/彼許可反 Myc 抗体を用いてウェスタンブロッティング続いて 10-20% トリシンの SDS ページに、元の lysates と一緒に、サンプルを受けた (110 kD) と Myc fll GLUT4 (5 kD) (図 1).
Myc fll GLUT4 (10 ng) 参照としてゲ...

洗剤に敏感な例として並べ替え受容体、ソーティリン、GLUT4 グルコース輸送体タンパク質の最初の内腔のループに結合を用いた膜タンパク質相互作用の検出のためのプロトコルについて述べる。

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

この手順の全体的な目標は、膜タンパク質または他のタンパク質との間の界面活性剤感受性相互作用を検出することです。この手順では、1つのタンパク質がヒスチジンタグ付きで細胞内で過剰発現し、もう1つのタンパク質がmycタグ付きペプチドである必要があります。この方法は、生化学の重要なタンパク質相互作用研究の分野における質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、界面活性剤に敏感な方法で膜タンパク質間の相互作用を検出できることです。手続きは迅速かつ簡単です。この方法は、膜タンパク質相互作用に関する洞察を提供しますが、弱いタンパク質相互作用の研究にも使用できます。この方法を思いついたのは、膜タンパク質であるサルティリンとGLUT4の間の相互作用を調べたいと思ったときでしたが、哺乳類の溶解からそれらを共免疫沈降させる試みは成功していません。ペプチドを注文するには、相互作用に重要なペプチドの標的配列を選択し、配列の末端またはC末端にmycエピトープを追加します。ペプチドが到着したら、超純水中のペプチドの作業溶液1ミリリットルあたり100マイクログラムをpepareします。3つの3T3-L1前脂肪細胞を4つの10cm培養皿に播種し、インキュベーターに保管します。次に、2つの培養皿に6X histodynで標識した標的タンパク質をトランスフェクションし、他の2つの皿に2つのコントロールプラスミドでHISPとして標識し、WTとして標識します。トランスフェクション後、細胞をインキュベーターに48時間放置して、80〜90%の密度に達します。細胞ライセートを調製するには、4°Cに冷却した1X緩衝生理食塩水10ミリリットルで細胞を氷上で3回洗浄します。次に、それぞれに500マイクロリットルの溶解バッファーを追加します。次に、細胞スクレーパーを使用して細胞を皿から分離し、ライセートを調製します。各培養皿から調製した細胞溶解物を4本の別々の1.5mmチューブに移し、すべてのチューブに標識します。次に、細胞溶解物を26ゲージの針で上下に5回シリンジに通し、細胞全体を溶解します。次に、細胞ライセートを16000xgで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を同じラベルの付いた4つの新しいチューブに移します。将来のトラブルシューティングおよび制御実験のために、20マイクロリットルの細胞溶解物を分注し、摂氏20度で保存します。後で使用する場合は、洗浄バッファーを塩酸でPH8で滴定してPH6を取得し、バッファーを摂氏4度で保存します。次に、コバルトビーズの均質な懸濁液を調製するために、ボトルを慎重に渦巻かせます。次に、40マイクロリットルのコバルトビーズ懸濁液を、個別にマークされた4本のチューブすべてに移します。コバルトビーズを加えた後、チューブに1ミリリットルの溶解緩衝液を加えます。次に、チューブを1000xgで5秒間遠心分離します。上清を捨て、沈殿したビーズに40マイクロリットルの溶解緩衝液をピペットで移します。次に、細胞ライセートを対応するチューブに移し、チューブローテーター上で摂氏4度で90分間インキュベートします。90分後、サンプルを1000xgで5秒間遠心分離します。次に、Flowthrough-1とラベル付けされた上清を回収し、摂氏20度で保存します。次に、PH8を含む500マイクロリットルの洗浄バッファーを個々のチューブに加え、ビーズを穏やかに再懸濁します。チューブを1000xgで5秒間遠心分離し、上清を排出します。次に、ラベルに従ってPH8または6の洗浄バッファーをチューブに加え、ビーズをしっかりと懸濁します。チューブを1000xgで5秒間遠心分離し、上清を排出します。ペプチドと水緩衝液の1ミリリットルあたり1マイクログラムの作業溶液をPH6または8で調製します。次に、100マイクロリットルのペプチド溶液を、同様のPHに対応する洗浄したビーズに加えます。その後、ビーズを4°Cでチューブローテーターに30分間インキュベートします。次に、4つのマイクロカラムを取り、それらを標識し、Flowthrough-2とラベル付けされたコレクションチューブにカラムを配置します。インキュベーションが終了したら、インキュベーション混合物をカラムに加えます。溶液を重力で通過させ、流れからサンプルを収集します。カラムを新しいコレクションチューブに入れ、摂氏20度で保管します。次に、PH6またはPH8のいずれかを含む500マイクロリットルの洗浄バッファーを重力流で個々のカラムに通し、フロースルーを廃棄します。この手順を 4 回繰り返します。チューブを1000xgで5秒間遠心分離します。Elutionとラベル付けされた新しい収集チューブにカラムを置きます。結合していないペプチドを取り除くために、すべてのチューブ内のビーズを非常に注意深く均等に洗浄することが重要です。洗浄したビーズに、ベータメルカプトエタノールを含む40マイクロリットルのトリシンサンプルバッファーを加えます。室温で20分間放置します。カラムを8000xgで2分間遠心分離します。カラムを廃棄し、収集チューブを摂氏100度で10分間加熱します。その後、1000xgで5秒間遠心分離します。あるいは、洗浄したビーズに40マイクロリットルの溶出イミダゾール緩衝液を加え、室温で20分間インキュベートします。インキュベーション終了後、チューブを8000xgで2分間遠心分離します。カラムを廃棄し、40マイクロリットルのトリシンサンプルを追加します。収集チューブを摂氏100度で10分間加熱し、次に1000xgで5秒間遠心分離します。市販の10-20%トリシングラジエントゲルを使用してください。Tris/Tricine/SDSランニングバッファーを使用し、溶出したサンプルと全ライセートをそれぞれ20マイクロリットルずつゲルにロードし、電気泳動ユニットの運転を開始します。電気泳動が終了したら、20%メタノールを添加した転写バッファーを使用して、ゲルから0.45μmのニトロセルロース膜に材料を移します。メンブレンを塞いだ後、水平にカットします。次に、膜下部に抗His P抗体を付着させた膜上部を、抗myc抗体を塗布した膜下部をプローブします。GLUT4のコバルトビーズ上の固定化ソーチリン間の相互作用を研究するために、イムノブロット分析を行いました。細胞ライセートと溶出液を野生型およびSortilin-myc/Hisタグ付きトランスフェクト3T3-L1細胞から入手し、SDSページにロードしました。ブロットを抗myc抗体でプローブしました。ブロットは、トランスフェクションされた溶出液から110 kilodotin Sortili-myc/Hisタグと5 kilotin myc-first luminal loop-GLUT4を示しています。次に、PHの重要性と、コバルトビーズに固定化されたSortilinとGLUT4との間の相互作用を研究するために、イムノブロット分析を行いました。このアッセイでは、Mycファースト管腔ループGLUT4を、PH6およびPH8の両方でSortilin-myc/Hisタグ付きタンパク質を固定化したビーズとインキュベートしました。このブロットは、Sortilin-myc/Hisタグトランスフェクトされた3T3-L1細胞から得られた溶出液のPH6および8つで、Sortilin-myc/Hisとmyc-first管腔ループGLUT4との間の明確な相互作用を示しています。この手法を習得すると、サンプルが西洋の血液分析の準備が整うまで、3〜4時間で完了します。この手順を試行する際には、できれば水に溶けるペプチドを設計することを忘れないでください。結果を強化するために、架橋後の免疫沈降などの他の方法を実行することができます。このビデオを見れば、界面活性剤に敏感な手順で膜タンパク質、タンパク質相互作用を検出する方法について十分に理解できるはずです。また、タンパク質断片間の相互作用を探索することもできます。ソフトなリズミカルなジャズ。

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生物化学

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膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

多くのタンパク質は、膜表面に付着するとその機能を果たします。ナノディスク膜上の外因性タンパク質の結合は、透過型電子顕微鏡によって間接的に画像化することができます。我々は、ネガティブ染色のリンスホタングステン酸ナトリウムによって誘発されるナノディスクの特徴的なスタッキング(rouleau)が、外部タンパク質の結合によって防止されることを示す。...

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タンパク質-脂質相互作用を測定するためのマイクロスケール熱泳動の使用

膜タンパク質の精製と再構成を1つのクロマトグラフィー工程でペプチディスに組み合わせる方法を提示する。ビオチン化足場は、バイオレイヤー干渉法を介したタンパク質リガンド相互作用の直接表面付着および測定に使用されます。...

PeptiQuick、合理化されたタンパク質結合アッセイのためのバイオチン化ペプチドディスクへの膜タンパク質のワンステップ組み込み

ここで提示される電子顕微鏡法と組み合わせてネイティブ細胞膜ナノ粒子系を利用する膜蛋白質のオリゴマー状態の決定のためのプロトコルです。...

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

この論文は、脂質近位環境におけるin vitroでの内在性膜タンパク質とさまざまなパートナー因子との相互作用と集合を評価する方法を説明しています。...

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成しますインビトロ

学ぶ膜タンパク質相互作用の検出法。ソルチリンとGLUT4の結合を例に、洗剤に敏感な条件下でヒスチジンタグとマイクタグを用いて膜タンパク質間の相互作用を検出する生化学的手法です。

洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出

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