透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法
2017年3月5日
多くのタンパク質は、膜表面に付着するとその機能を果たします。ナノディスク膜上の外因性タンパク質の結合は、透過型電子顕微鏡によって間接的に画像化することができます。我々は、ネガティブ染色のリンスホタングステン酸ナトリウムによって誘発されるナノディスクの特徴的なスタッキング(rouleau)が、外部タンパク質の結合によって防止されることを示す。
この手順の全体的な目標は、タンパク質の高解像度構造決定に向けた最初のステップとして、ネガティブステイン透過型電子顕微鏡によってナノディスク膜表面上の外因性膜タンパク質の結合を視覚化することです。この方法は、細胞膜内および細胞膜上で発生するタンパク質活性に関するいくつかの研究分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質が膜に結合できない場合にナノディスク形態の特徴的なスタックがあることです。
これらのスタックは、透過型電子顕微鏡ではっきりと見ることができます。この技術の意味は、化合物が膜タンパク質相互作用をブロックまたは可能にする能力について簡単にスクリーニングできるため、医薬品開発にまで及びます。この方法は、モノトピックタンパク質がメンブレンに結合するための最適な条件についての洞察を得ることができますが、タンパク質ナノディスク複合体の低分解能構造も提供してくれます。
手順を開始するには、MSP1E3D1などの膜足場タンパク質を発現および精製します。次に、金属針付きのガラス注射器を使用して、クロロホルム中のPOPCの25ミリグラム/ミリグラムの305マイクロリットルをガラスの丸底フラスコに分注します。ヒュームフード内の窒素ガスの穏やかな流れの下でクロロホルムを蒸発させます。
残りの脂質を真空デシケーターで一晩乾燥させます。次に、乾燥脂質ケーキを、洗剤として100ミリモルのチョル酸ナトリウムを豊富に含む200マイクロリットルのMSP標準緩衝液に溶解します。混合物を透明になるまでボルテックスして、バッファー中の50ミリモルPOPCの懸濁液を得る。
次に、5グラムの疎水性ビーズを30ミリリットルの100%メタノールで洗浄し、次に40ミリリットルの超純水で洗浄し、最後に10ミリリットルのMSP標準バッファーで洗浄します。ビーズは、摂氏4度で標準バッファーの15ミリリットル未満で保管してください。次に、190マイクロリットルの0.124ミリモル溶液MSP1E3D1と61.5マイクロリットルの50ミリモル懸濁液のPOPCをバッファーに組み合わせて、MSPとPOPCの1〜130モル比と25ミリモルのナトリウム濃度を実現します。
MSPあたりの脂質の理想的な比率は、脂質タイプとMSPレンズの各選択によって異なり、ナノディスクの均質な調製を得るために最適化する必要があります。混合物を湿った氷の上で1時間インキュベートします。次に、再構成混合物のミリリットルあたり0.5グラムの洗浄された疎水性豆を含むチューブに溶液を加えて、ナノディスクの自己組織化を開始します。
混合物を摂氏4度で16時間、毎分7〜8回転でインキュベートします。インキュベーション後、ビーズが重力によって沈殿するのを待ちます。上清を取り出し、サイズ排除クロマトグラフィーを実行する準備ができるまで、摂氏4度で保存します。
サイズ排除クロマトグラフィーの前に、混合物を13, 000gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清をデカントし、ペレットを捨てます。サイズ排除クロマトグラフィーカラムをMSP標準バッファーで平衡化し、280ナノメートルでのベースラインが安定するまで平衡化します。
上清をカラムに注入し、生成物を0.5ミリリットルの分画で回収します。280ナノメートルのフラクションの吸光度をUV/vis分光光度計で測定します。選択したMSPのモル吸光係数を使用してナノディスクの濃度を計算します。
非変性ゲル電気泳動を行うには、まず15マイクロリットルのサンプルを5マイクロリットルの適切なローディングバッファーと混合します。カソードタンクに軽いカソードバッファーを充填し、アノードタンクにランニングバッファーを充填します。サンプルを4〜16%Bis-Trisゲルにロードし、ランを開始します。
ゲルの製造元の指示に従ってゲルを染色します。タンパク質として5つのリポキシゲナーゼを含むナノディスクモノトピックタンパク質複合体の調製を開始するには、1.5ミリモルの塩化カルシウムを豊富に含むMSP標準バッファーのバッチを調製します。5LOタンパク質を発現および精製します。
カルシウム強化MSP標準バッファーに0.8マイクロモルの5LOと0.8マイクロモルのナノディスクの100マイクロリットル混合物を直ちに調製します。モノトピックプロテイナーゼ5リポキシゲナーゼの例は、膜に結合するカルシウム量に依存します。5LOは感度が高いため、準備から数時間以内に使用する必要があります。
混合物を氷上で10分間インキュベートします。得られたナノディスクタンパク質複合体サンプルは、摂氏4度で最大1ヶ月間保存します。TEM分析の準備を開始するには、1グラムのリンタングステン酸ナトリウム塩を室温で50ミリリットルの超純水に溶解します。
水酸化ナトリウムの1モル溶液で溶液のpHを7.4に調整します。0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを介してリンタングステン酸ナトリウム溶液をろ過し、室温で溶液を保存します。次に、400メッシュのカーボンコーティング銅グリッドを30ミリアンペアで20秒間グロー放電し、グリッド表面を親水性にします。
2.5〜5マイクロリットルのナノディスクモノトピックタンパク質複合体サンプルをグリッド上に置き、サンプルを30秒間放置します。次に、濾紙を使用してグリッドから余分な溶液を吸い取ります。すぐにリンタングステン酸ナトリウム溶液を一滴塗布し、溶液を30秒間放置します。
余分な溶液を吸い取り、グリッドを風乾させます。120〜200キロボルトの加速電圧で透過型電子顕微鏡法を実施します。長いスタックを示す画像を後続の画像処理から除外します。
選択した画像について、標準的な処理方法を使用してクラス平均を決定し、ナノディスクモノトピックタンパク質の低解像度3Dモデルを生成します。この方法を用いて、空のナノディスクを、膜足場タンパク質と脂質の比率が1対130で調製した。サイズ排除クロマトグラフィーでは主要なピークが 1 つだけ観察され、青色のネイティブゲル電気泳動では 1 つのバンドのみが観察されました。
空のナノディスクをリンタングステン酸ナトリウム塩溶液で処理すると、スタッキングが誘導されます。これらの長いスタックは、TEMで観測できます。この積み重ねは、リンタングステン酸ナトリウム溶液を塗布する前にナノディスク溶液中にカルシウムイオンを含有することによって妨げられなかった。
ナノディスク表面に5つのリポキシゲナーゼなどのモノトピックタンパク質が結合すると、タンパク質によるステアリック閉塞によりスタッキングが妨げられます。ナノディスクの両面は結合が可能で、1対1および2対1の5LOナノディスク複合体の形成が可能です。2対1の5LOナノディスク複合体のサンプルは、1対1のサンプルよりもスタッキングが少なかった。
5LO結合にはカルシウムイオンの存在が必要です。このことは、5LOとカルシウムを含まないナノディスクの混合物に積層した観察により確認され、5LOが膜表面に結合していないことが示されました。モノトピックタンパク質とナノディスクを調製したら、メンブレンへのタンパク質結合の評価が適切に行われれば、午後に行うことができます。
この手順を試みる際には、ナノディスク上のタンパク質の面積を推定して、正しいMSPの長さを選択することが重要です。サイズが十分に一致する場合、最大で2つの外因性タンパク質がディスクの両側に1つずつ結合する可能性があります。また、モノトピックタンパク質を含まないサンプルの長いスタックとスタックの不在を比較することで結合が確認されるため、結合が最大限に積み重なるように、ネガティブスタンドにホソホタングステンのナトリウム塩を使用することも重要です。
リポソームの代わりにナノディスクを使用することで、動的光散乱、小角X線散乱を使用して、サンプルの均質性、サイズ、分子構造に関する追加の質問に答えることができます。ナノディスクに結合したモノトピック膜タンパク質の低解像度3D構造は、これらの結合タンパク質の高分解能構造への道筋における容易にアクセスできる第一歩となる可能性があります。
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概要
この研究は、ナノディスク膜への外因性膜タンパク質の結合を可視化する方法を実証し、負染色透過電子顕微鏡法を使用しています。この技術は、タンパク質の結合がナノディスクの特徴的な積層を防ぐ方法を明らかにし、タンパク質-膜相互作用に関する洞察を提供します。
研究の主要な要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- 構造生物学
背景
- 外因性タンパク質は細胞膜機能において重要な役割を果たしています。
- 負染色透過電子顕微鏡法は価値ある画像技術です。
- ナノディスクはタンパク質相互作用を研究するためのモデル膜として使用されています。
- タンパク質結合の理解は医薬品開発と構造生物学にとって不可欠です。
研究の目的
- ナノディスク膜上の外因性タンパク質の結合を可視化する。
- タンパク質相互作用が医薬品スクリーニングに与える影響を探る。
- タンパク質-ナノディスク複合体の低解像度の構造を提供する。
使用した方法
- 負染色透過電子顕微鏡法。
- ナノディスク膜の準備。
- 外因性タンパク質の結合アッセイ。
- ナノディスクの積層パターンの分析。
主要な結果
- 外因性タンパク質の結合はナノディスクの積層形成を防ぎます。
- タンパク質が結合しない場合、特徴的な積層パターンが見られます。
- この方法はタンパク質結合の最適条件に関する洞察を提供します。
- 医薬品開発における潜在的な応用が強調されています。
結論
- この技術はタンパク質-膜相互作用を研究するのに効果的です。
- 高解像度の構造決定への道筋を提供します。
- この発見は膜タンパク質機能の理解に影響を与えます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables visualization of extrinsic membrane protein binding to nanodiscs via negative stain TEM, where protein binding prevents characteristic nanodisc stacking. It provides a rapid, low-resolution structural readout to de-risk target validation and inform early-stage drug screening for membrane-associated proteins. The approach supports go/no-go decisions by confirming binding under defined lipid and ionic conditions before committing resources to high-resolution structural work.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms membrane binding of extrinsic proteins through direct visualization of inhibited nanodisc stacking.
- Operational Value: Enables rapid assessment of protein-lipid interactions in a controlled membrane mimetic system.
- Predictive Value: Supports target validation by demonstrating binding dependence on cofactors such as calcium ions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Allows screening of compounds that modulate protein-membrane binding by measuring changes in nanodisc stacking patterns.
- Operational Value: Uses accessible negative stain TEM infrastructure for high-contrast imaging without cryo-EM requirements.
- Assay Readiness: Generates samples compatible with downstream structural workflows including single-particle analysis and non-denaturing gels.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides low-resolution structural insights that can guide higher-resolution cryo-EM studies of protein-nanodisc complexes.
- Mechanistic De-risking: Clarifies steric and spatial constraints of protein binding on both sides of the nanodisc.
- Disease-Relevant System: Models peripheral membrane protein interactions relevant to signaling pathways in inflammation and lipid metabolism.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical mechanistic studies, offering a bridge between biochemical binding assays and high-resolution structure determination.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by visualizing whether a protein binds to a membrane surface under defined conditions.
- Screening: Produces quantitative imaging readouts (stacking vs. non-stacking) that can be scored for compound effects on membrane binding.
- Analytics: Enables class averaging and 3D modeling of protein-nanodisc complexes to generate low-resolution structural data for target characterization.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical work by providing structural context for protein function in lipid environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing multiple peripheral membrane proteins across different lipid compositions and buffer conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Direct visualization of binding events and low-resolution structural insights reduce ambiguity in mechanistic models.
- Operational Value: Leverages widely available TEM equipment and standard negative staining protocols for broad accessibility.
- Strategic Value: Increases confidence in target engagement data, reducing failure rates in downstream structural and functional validation.
- Portfolio Impact: Enables early triage of targets based on confirmed membrane binding, improving capital efficiency in discovery pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, nanodisc reconstitution, and negative stain TEM sample preparation.
- Dependent on access to transmission electron microscopy and UV-Vis spectroscopy for nanodisc quantification.
- Necessitates optimization of lipid-to-scaffold ratios and buffer conditions for each protein-lipid system.
- Involves handling of air-sensitive lipids and phosphotungstate stain under controlled conditions.
- Limited to proteins that do not induce stacking themselves; binding is inferred from absence of stacks relative to controls.
