Name: 透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学ぶ 透過型電子顕微鏡を用いた膜相互作用タンパク質の視覚化手法。ナノディスク膜への外在性タンパク質結合を観察し、タンパク質-膜相互作用の理解と創薬研究への応用に貢献します。

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著者は彼らのサポートのためにスウェーデンの研究評議会、ストックホルム郡評議会、およびKI資金に感謝します。 MSPの発現および精製は、カロリンスカ研究所/ SciLifeLabタンパク質科学基盤施設（http://PSF.ki.se）で行いました。また、作者は彼らの技術的な専門知識を共有するため、それらのタイムリーな支援のために博士パシPurhonen博士マチルダスエルバーグに感謝したいと思います。

ナノディスクの調製<ol><li>膜足場タンパク質8、35の発現および精製<ol><li>フラスコ中の大腸菌 BL21（DE3）T1R pRARE2株にHisタグMSP1E3D1を発現します。 37℃で50μg/ mlのカナマイシンを補充したLB培地で50 mLの一晩スターター培養を準備します。 50μg/ mLのカナマイシンを補充した素晴らしいブロス培地の2 Lで一晩スターター培養物を希釈します。 </li><li> 600ナノメートル（OD 600）での光学密度が約3 18℃で3時間、0.5 mmのタンパク質発現イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を誘導に達するまで37℃で細胞を増殖させます。 </li><li>溶解バッファー（; 100mMのNaCl、10％グリセロール、100mMのトリス-HCl、pH8.0）に調製します。使用直前に1 mMのTCEPを追加します。 </li><li> 18℃での誘導の3時間後、4,500×gで10分間の遠心分離により細胞を回収4°C。 、上清を捨て採取した細胞を比較検討し、細胞のグラム当たりの溶解緩衝液を2mLの割合で溶解緩衝液中で再懸濁それら。 </li><li> 80％の振幅で3分間（ON 4秒、4秒OFF繰り返し率）、パルス超音波処理によって溶解細胞。 </li><li> 49,000×gで、4℃で20分間溶解物を遠心分離します。この遠心分離からのペレットを捨てます。 </li><li>好ましくは4℃に保っ自動液体クロマトグラフィーシステムに接続された5ミリリットルのNi +キレートカラムに上清を注入します。 </li><li> Hisタグ化MSP以外のすべてのタンパク質を除去するために、次の3 - 溶出工程（ステップ1.1.9）の前に、バッファ1でカラムを洗浄します。精製プロセスを追跡する280 nmでのタンパク質含有量を監視します。 280nmでのUV記録は、各洗浄後にベースラインに戻る行く必要があります。 <ol><li> 40mMのトリス-HCl、300mMのNaCl、10mMのイミダゾール、1％トリトン、pHが8.0：洗浄緩衝液1で洗浄しました。 </li><li> 40mMのトリス-HCl、300mMの：洗浄バッファー2で洗浄NaCl、20mMイミダゾール、及び50mMコール酸ナトリウム、pHは8.0。 </li><li> 40mMのトリス-HCl、300mMのNaCl、および50 mMイミダゾール、pHは8.0：洗浄緩衝液3で洗浄します。 </li></ol></li><li> 40mMのトリス-HCl、300mMのNaCl、および500mMイミダゾール、pH8.0でMSPを溶出します。 </li><li>ゲルろ過8、35、標準緩衝液（0.5 mMのEDTA; 100mMのNaCl、20mMのトリス-HCl、pHが7.5）MSPするバッファを変更します。バッチあたりの収量は約7ミリグラムLであるべき-1。 </li></ol></li><li>リン脂質原液の調製<ol><li> 1-パルミトイル-2- oleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（POPC）の305μLをガラスビーカーに25ミリグラム/ mLの濃度でクロロホルムに溶解し、窒素の穏やかな流れでそれをパージすることにより、クロロホルムを蒸発させる追加。真空デシケーター中で一晩脂質を乾燥させます。注：このステップは、ガラスビーカーの底部に脂質の薄膜を残す脂質から溶媒を除去します。</li><li>溶液が透明になるまでチューブをボルテックスすることによって100mMのコール酸ナトリウムを含むMSP標準緩衝液200μL中の脂質ケーキを再懸濁し、これを50mMのPOPC濃度を有する溶液を提供します。 注：2（脂質：洗剤）8一般的には、この時点で洗剤に対する脂質のモル比は1でなければなりません。この脂質 - 界面活性剤混合物は、ほぼ2ヶ月間-80℃で保存することができます。 </li></ol></li><li>界面活性剤除去のための疎水性ビーズの作製<ol><li> 50 mLチューブにビーズの5グラム（乾燥重量）を配置します。 </li><li>超純水40mLで、次に100％メタノール30mLでビーズを洗浄し。 </li><li> 10 mLのMSPの標準緩衝液でビーズを洗浄します。最後に、4℃でMSP標準緩衝液15mLでビーズを格納します。 </li></ol></li><li>ナノディスクの再構成<ol><li>マイクロチューブにMSP1E3D1（0.124ミリモル）の190μLを分注し、リン脂質のストック溶液（50mMのPの61.5μLを追加同じチューブにOPC）。 1時間氷上で再構成混合物をインキュベートします。注：130（MSP1E3D1：POPC）これは1のモル比に等しいです。 </li><li>自己組織化プロセスを開始するために再構成液1mL当たりのビーズ0.5gの濃度で疎水性ビーズを加えます。 4℃で16時間、ロータリーインキュベーターでインキュベートします。 </li><li>インキュベーションの後、沈殿物や凝集物を除去するために13,000×gで、4℃で10分間遠心操作します。ペレットを捨て、上清を保存します。 </li><li> 280 nmでの吸光度が安定するまでMSP標準緩衝液（自動液体クロマトグラフィーシステムに搭載された）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを平衡化します。カラムに上清を注入し、ピーク画分を集めます。 </li><li> 280nmでのピーク画分にナノディスクの濃度を測定します。ナノディスク濃度の計算のためにMSP1E3D1のモル吸光係数（ε= 29910センチメートル-1 M -1）を使用します。注記：ナノディスクあたりの脂質の数は、放射標識脂質およびリン分析4の組み合わせによって単独リン酸分析によって測定することができます。 </li></ol></li></ol> Monotopicタンパク質の調製5-リポキシゲナーゼ35 <ol><li>一晩スターター培養物を準備します。 100μg/ mLのアンピシリンを含むLB培地50mlを補います。 5-リポキシゲナーゼ遺伝子（ALOX5）のプラスミドを含む大腸菌 BL21（DE3）で培地に接種。 42ミリモルのNa 2 HPO 4、24 mMのKH 2 PO 4、9のNaCl、19 mMのNH 4 Cl を 、1mMの硫酸マグネシウム、0.1ミリモルのCaCl 2、0.2％D-グルコース、0.1を含有する発現培地中で一晩スターター培養物を希釈％、5μMのFeSO 4、および100μg/ mLアンピシリン。 OD 600が 〜25℃で0.5になるまで細胞を増殖させます。 C 35 20℃で16時間、0.2mMのIPTGでタンパク質発現を誘導します。 </li><li> 7,000×gで、4℃で10分間の遠心分離により収穫し、上清を捨てます。採取した細胞を含むチューブの下部にあるペレットを秤量し、溶解緩衝液中に回収した細胞を再懸濁（100mMのトリス-HCl、pH8.0の、100mMのNaCl、10％グリセロール、及び1mMのTCEP）、プロテアーゼ阻害剤および0.5を含みますmg / mlで細胞の1gあたりの溶解緩衝液を2mLの割合で35リゾチーム。 </li><li>溶解80％の振幅で5×15秒間超音波処理により細胞。 7,000×gで、4℃で10分間の遠心分離により細胞破片を除去します。ソリューション35中のタンパク質を沈殿させるために60％飽和- 30に硫酸アンモニウム沈殿を実行します。 16,000×gで4℃で15分間遠心分離します。注：5LOペレットを急速凍結し、最長6ヶ月間-80℃で保存することができます。 </li><li> 40,000×gで4℃で15分間、溶解緩衝液および遠心20mLでペレットを再懸濁します。 </li><li>上の上澄み液をインキュベート<html> 30分間、4℃でATPアガロースカラム。 0.5 M NaClを含む溶解緩衝液の1カラム容量で一回カラムを洗浄。 10μMのFeSO 4および20μg/ mLのカタラーゼを含有する溶解緩衝液中20mMのATPと5LOを溶出します。 ATP 35を除去するために、ゲルろ過クロマトグラフィーを行います。 注：5LOが不安定で、すぐに精製した後に使用する必要があります。それ以外の場合は、硫酸アンモニウム沈殿の段階（ステップ2.1.3の後の注を参照）で停止することをお勧めします。 </li></ol>ナノディスク - タンパク質複合体の調製<ol><li>複合体の100μLの総容量を準備します。 MSP標準緩衝液中の1mM の Ca 2+存在と0.8μMNDと0.8μM5LOミックス（20 mMトリス-塩酸、pHが7.5; 100mMのNaCl; 0.5mMのEDTA、および1.5 mMのCaCl 2を）とは、10分間インキュベート冷やして。注：サンプルは、C 35 4℃で1ヶ月まで保存することができます。 </li></ol>サンプルのove_title &quot;&gt; 4。分析<ol><li>ゲル電気泳動<ol><li>非変性電気泳動<ol><li>ローディングバッファーの5μL（50mMのビストリス、6NのHCl、50mMのNaCl、10％（w / v）のグリセロール、および0.001％ポンソーS、pH7.2）で49でサンプルの15μLを混合し、4にそれを読み込みます - 16％のBis-Trisゲルで電気泳動を行います。 </li><li>光陰極バッファと陰極タンクを埋める（50mMのビストリス、50mMのトリシン、pHが6.8、および0.002％クマシーG-250）及び緩衝液（50mMビストリスおよび50mMのトリシン、pHは6.8）を実行すると、アノードタンク。 150 Vで一定の電圧を使用して分離を開始します</li><li>クマシーフロントがゲルの終わりに到達した電気泳動分離を停止します。 </li><li>標準クマシーブループロトコルを用いてゲルを染色。 </li></ol></li><li>変性電気泳動<ol><li> （（SDSを含むローディング緩衝液の10μLで0.05パーセントを、サンプルの40μLのミックス/ v）のブロモフェノールブルーワット; 0.2 Mトリス塩酸、pHが6.8; 20％（v / v）グリセロール。 10％（W / V）SDS。電気泳動を行うために20％トリスグリシンゲル - 及び10mM 2-メルカプトエタノール）とは4でそれをロードします。 </li><li>ランニング緩衝液で陰極と陽極とタンクを記入（25 mMトリス - 塩酸、pHが6.8; 200 mMグリシン、および0.1％（w / vで）SDS）。 150 Vで一定の電圧を使用して分離を開始します</li><li>ローディング色素フロントがゲルの終わりに到達した電気泳動分離を停止します。 </li><li>標準クマシーブループロトコルを用いてゲルを染色。 </li></ol></li></ol></li><li> NAPT溶液の調製<ol><li>酸性溶液（w / v）の2％を与えるように、室温で攪拌することにより水50mL中のリンタングステン酸ナトリウム塩1gを溶解します。 </li><li> 1 M NaOHでpHを7.4に調整します。 0.22μmのシリンジフィルターを使用して粒子を除去します。室温または4℃で溶液を保管してください。 </li></ol></li><li> TEM分析用のサンプルの調製<ol><li>グロー放電炭素被覆銅グリッド（430ミリアンペアで20秒間の00メッシュ）は、試料の吸着前親水性グリッドをレンダリングします。グリッド上のサンプル（ナノディスクに対して0.8μM）の3.5μLを置き、30秒間インキュベートします。注：適用量は、サンプル濃度に応じて、2.5〜5μLを変えることができます。 1μM - ナノディスクに適した濃度範囲は0.5です。 </li><li>濾紙を用いて余分な溶液をオフブロット。 </li><li>すぐに30秒間2％NAPTの低下にグリッドを染色します。過剰の溶液をオフにブロットし、空気乾燥さグリッドを残します。 </li><li> TEMによるグリッドを評価します。 120-200 keVの加速電圧を持つ顕微鏡は、スタッキングの度合いを推定するのに十分です。注：本プロトコルでは、較正透過型電子顕微鏡を用いた、200 keVの電界放出銃を備えました。 </li><li> TEM画像を記録します。長いスタックを示す画像については、さらに処理されません。画像は、いくつかを含有することができる外因性タンパク質と、ナノディスクの複合体を示しますショートスタックが、ほとんどの粒子が複雑です。録音複数の画像処理クラス平均と低解像度、複合体の3次元モデルを得るための標準的な方法に従って、これらの。 注：ネガティブ染色データの収集のために、グリッドが少なくとも三つの異なる日に行きました。ネガティブ染色が適用される前、毎日のために、新鮮なサンプルのインキュベーション（ステップ3.1のように）が行われました。 </li></ol></li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

空のナノディスクの再構成、タンパク質ナノディスク複合体の調製、およびこれらの複合体のTEMについて陰性染色：この方法は、3つの部分に分離することができます。各部分は技術の限界、重要なステップ、および有用な修飾に関する個別に対処されることになります。 空のナノディスクの再構成。ナノディスクの製造と使用における重要なステップと制限。 空のナノディスクの製造のためには、MSP対脂質比を最適化することが必須です。最も一般的なMSP及び（洗剤としてコール酸を使用して）、脂質については、最適な比率のための提案が文献に見出すことができる（ 例えば、125 -現在のプロトコルで使用されるMSP1E3D1 8、51あたり130 POPC）。公開された比と比較して得られた差異は、タンパク質濃度の決意、Lの効率のための方法に依存してもよいですIPID洗剤で溶媒和、および溶液からの界面活性剤除去の方法。 <p cl...

医学研究では、多くの注意が脂質相互作用の様々な関与、内因性または外因性のいずれかの、膜タンパク質に焦点を当てています。脂質相互作用タンパク質を操作するような洗剤、amphipols 1、または小さいタンパク質2などの脂質への代替を選択する、または可溶性および活性タンパク質を保持する膜の代用品を見つけるのいずれかが含まれます。リポ膜代替物は、リポソームおよびナノディスク（ND）3、4を含みます。 ナノディスクは、天然に血液中に発生する高密度リポタンパク質（HDL）のタンパク質部分、アポA-1を操作することによって開発され、ネイティブに近い膜のプラットフォームです。アポA-1は、短い両親媒性αヘリックスの243残基長鎖状であり、無脂質可溶性コンホメーションを持っています。 in vitroでの脂質の存在下で、タンパク質アポA-1の2つのコピーが自発的にhydrを取り囲むように並べ替えるとき脂質二重層のパッチ5のophobicアシル鎖部分。アポA-1の操作されたバージョンは、一般的に、膜足場タンパク質（MSP）と呼ばれ、数は増加し、プラスミドとして、または精製されたタンパク質として市販されています。 6長いか短い7膜足場タンパク質中のアポA-1、結果の繰り返しまたはαヘリックスの欠失を有します。これにより、直径が17ナノメートル〜8 6nmで7の周りにディスクを形成することができます。ナノディスク3,9のためのアプリケーションの種類があります。最も一般的に使用されるアプリケーションは、以前に3,9レビュー内在性膜タンパク質8の安定化のために、ネイティブに近い膜環境を提供することです。あまり探求使用は、研究のためのナノスケールの膜表面を提供することを目的とします周辺膜タンパク質10、11、12、13、14、15、16、17。プロトコルの第1節は、以下のリン脂質や膜骨格タンパク質から構成されるナノディスクを作成するための手順を可視化します。 サンプル調製は、ほとんどのメソッドのボトルネックです。メソッド固有のサンプルは、特定の情報を追加することができ、彼らはまた、結果の比較が困難になります。試料がマルチモーダルであり、いくつかの異なる方法で直接使用することができる場合したがって、簡単です。ナノディスクを用いて一つの利点は、リポソーム（ 例えば、サンプルは直接本プロトコルのように、TEMおよび非変性ゲル電気泳動の両方のために使用することができる）と比較して、ナノディスクの小さいサイズです。 、18利用可能です。しかし、リポソーム膜に埋め込まれたmonotopic膜タンパク質のない高解像度の3D構造は、我々の知る限りでは、まだ公開されていません。金ナノ粒子または抗体は、TEM 19を用いてリポソームまたは小胞に結合するタンパク質を可視化するために使用することができます。これらのプローブは、非常に特異的であるにもかかわらず、彼らは膜結合部位をベーリングしたり、柔軟な部品で関心のある分野をマスキングすることにより、膜結合タンパク質を妨害する可能性があります。金標識又は抗体複合体を形成するタンパク質は、おそらくゲル上で分析することができ、これは実験のコストを増加させます。 リポソームは優れたプラットフォームであるが、一つはポップと確信することはできませんピュレーションは、リポソームあたりのタンパク質の特定の比率、ナノディスク20を使用することによって探索することができるという特徴を持っています。リポソームでは、補因子および基質は可溶性の内部に捕捉することができます。膜溶解性である物質は、膜模倣体の両方のタイプのための同じ運命を共有します。二重層領域がナノディスクに小さくなるようにもかかわらず、物質の少量を、ナノディスクの膜を飽和させるのに必要とされます。 原子構造の決意を介してタンパク質の機能を理解することは、研究の多くの分野のために不可欠となっています。タンパク質構造決意するための方法は、X線21を含みます。核磁気共鳴（NMR）22、23。透過型電子顕微鏡（TEM）極低温で24、cryoEM。 cryoEMによって解像度が最近大幅に主に起因する直接電子デの使用に、改善されました26、25 tectors。巨大分子は、ネイティブに近い状態で薄く、ガラス質氷27に結像されます。 200 kDaの - しかし、生体分子の低コントラストのために、彼らは100のサイズ範囲で検出が困難になります。適切なサイズのサンプルについては、データ収集を行うことができ、単一粒子の再構成の方法は、構造体28を得るために適用することができます。 しかし、TEMによるタンパク質構造の決意は、多段階プロセスです。これは通常phosphotungstenのような重金属の塩を使用して負染色TEM 29（PT）30やウラン31によるサンプル単分散性の評価から始まります。ネガティブ染色高分子の低解像度モデルの再構築は、通常行われ、分子構造29に関する重要な情報をもたらすことができます。並行して、cryoEMを使用してデータ収集を開始してもよいです。アーチファクト形成の誤解を避けるために、ネガティブ染色TEMデータを評価する際には注意が必要です。一つの特定のアーチファクトは、側面33から見たコインのスタックに似た長い棒の形成をもたらし、リン脂質およびリポソーム32にPTの汚れの影響です。 （以下、「スタック」と表記）は、このような「連銭」または「スタック」は、HDL 34早期に観察し、それ以降もナノディスク35のためにしました。 膜の積層と整形は多くの理由で発生することがあります。例えば、モリブデン酸アンモニウム染色36でTEM画像で示される銅のような補因子によって誘導することができます。リポソーム中の膜脂質の割合は、このように銅イオンを添加した後、リポソームを積層し、EDTAによって金属錯体を模倣イミノジ酢酸頭部基を含有しました<sクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 36アップ。スタッキングも（使用ステインが言及されていない）脂質二重層内または上のタンパク質によって37タンパク質間相互作用に起因する可能性があります。 PTによるリン脂質のスタック形成は早い段階で観察されました。しかし、それ以降の作業は、このアーティファクト形成38を削除するか、廃止に焦点を当てています。 ここでは、TEMによる膜結合タンパク質の研究のために積み重ねNAPTによって誘発されるナノディスクを利用する方法を提案します。要するに、ナノディスクに結合タンパク質が積み重ねからナノディスクを防止するであろう。スタッキングの理由は明らかではないが、それはお互いに（ 図1A）に固執するディスクを引き起こし、リン脂質およびPTのホスホリル基との間の静電相互作用があることが39提案されました。私たちのプロトコルの背後にある仮説は、タンパク質は、ナノディスクに結合すると、リン脂質表面の大部分はご利用できないということです<html>タンパク質による立体障害によりPTとの相互作用についてBLE。これは、スタックの形成（ 図1B）を防止するであろう。二つの結論を引き出すことができます。まず、積層の予防は、対象のタンパク質が膜に結合したことを意味します。第二に、タンパク質ND複合体は、複合体の大まかな形態を得るために、標準的な単一粒子処理方法24、40で処理することができます。また、非変性ゲル電気泳動または動的光散乱のような方法によって分析を行うことができます。 この仮説を実証するために、我々は、多くの炎症性疾患41,42に関与する膜結合タンパク質5-リポキシゲナーゼ（5LO）を使用しました。この78-kDaのタンパク質は、その膜43にバインドするためにカルシウムイオンを必要とします。この膜結合は、リポソームを用いて広く研究されているもののS = &quot;外部参照&quot;&gt; 44、45、46、膜画分47、これらは、TEM分析および構造決意するために使用することができません。 ナノディスクの調製は、界面活性剤コール酸ナトリウムに再懸濁脂質とMSPを混合することによって開始されます。 1時間氷上でインキュベートした後、界面活性剤をゆっくりと吸着樹脂を使用して再構成混合物から除去されます。この種の材料は、しばしば小さなビーズに成形ポリスチレンで作られています。彼らは比較的疎水性であり、脂質の48に比べて洗剤を結合するための強力な好みを持っています。疎水性ビーズを除去し、遠心分離を用いて説明を行った後、ナノディスクは、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により精製します。精製されたナノディスクは、（滴定用またはいくつかの比率）等モル比でmonotopic膜タンパク質（および可能な補因子）と混合されているとrに残っていますEACT（15分）。 TEMによる分析は、グロー放電、炭素被覆グリッド上に試料をμL-量を適用することによって、その後、NAPTでネガティブ染色を行うことによって行われます。アリコートをTEMグリッドに適用した場合の同じサンプルは大きな変化で、非変性またはSDS PAGEゲル電気泳動によって、並びに活性測定の各種による分析のために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>透過型電子顕微鏡:JEOL2100F</td><td>日本電子</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>Tiez Video and Imaging Processing System GmbH(ドイツ</td><td></td><td></td>)</tr><tr><td>グローディスチャーシャ</td><td>Baltec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM grid:400メッシュ</td><td>TAAB</td><td>GM016/C</td><td></td></tr><tr><td>サイズ排除クロマトグラフィー:Agilent SEC-5</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2526</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド:MSP1E3D1</td><td>Addgene</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>バクテリア:BL21DE3</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>バクテリア:BL21 (DE3) T1R pRARE2</td><td>Protein Science Facility, KI, Solna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精製マトリックス:ATPアガロース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2767</td><td></td></tr><tr><td>精製マトリックス:HisTrap HP-5 mL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>脂質:POPC</td><td>Avanti極性脂質</td><td>850457C</td><td>クロロホルム中 25 mg/mL</td></tr><tr><td>疎水性ビーズ:バイオビーズ、SM-2 樹脂</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>13 mm シリンジ フィルター:0.2 &mu;m</td><td>Pall life sciences</td><td>PN 4554T</td><td></td></tr><tr><td>染色剤: リンタングステン酸ナトリウム 三塩基性水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31648</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>洗剤: チョル酸ナトリウム水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445-10G</td><td></td></tr><tr><td>チョル酸</td><td></td><td></td>ナトリウム <td>500 mM チョル酸ナトリウム。ミリQ水に再懸濁し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>脂質ストック</td><td></td><td></td><td>50 mM POPC, 100 mM cholate ナトリウム, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. <bt /> 4 °C;Cは一週間。または ストア-80&deg;窒素で溶液をパージした後、1ヶ月間C。</td></tr><tr><td>MSP標準バッファー</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl、pH 7.5、100 mM NaCl、0.5 mM EDTA. 4°Cで保存。</td></tr><tr><td>非脱繊性電気泳動アノードバッファー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BN2001</td><td>50 mM ビストリス、50 mM トリシン、pH 6.8</td></tr><tr><td>非脱繊性電気泳動カソードバッファー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BN2002</td><td>50 mM ビストリス、50 mM トリシン、pH 6.8、0.002% クーマシー G-250</td></tr><tr><td>非脱繊性電気泳動 4x サンプルローディングバッファー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BN2003</td><td>50 mM Bis-Tris、pH 7.2、6 N HCl、50 mM NaCl、10% (w/v) グリセロール、0.001% Ponceau S</td></tr><tr><td>Denaturaing Electrophoresis Running Buffer</td><td></td><td></td><td>社内レシピ: 25 mM Tris-HCl、pH 6.8, 200 mM グリシン、0.1% (w/v) SDS</td></tr><tr><td>Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer</td><td></td><td></td><td>社内レシピ: 0.05% (w/v) ブロモフェノールブルー、0.2 M Tris-HCl、pH 6.8、20% (v/v) グリセロール、 10% (w/v) SDS、10 mM 2-メルカプトエタノール</td></tr><tr><td>Terrific ブロス</td><td></td><td></td><td>トリプトン - 12.0 g、酵母抽出物 - 24.0 g、100 mL 0.17 M KH2PO4 および 0.72 M K2HPO4、 グリセロール-4 mL. トリプトン、酵母抽出物およびグリセロールを900 mLまで調製し、別々にオートクレーブ保存した。KH2PO4とK2HPO4を調製し、別々にオートクレーブしました。メディウムを使用する前に両方を混合しました。</td></tr></tbody></table>

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

モノトピックタンパク質は、膜表面に付着したときにその機能を発揮し、そのような相互作用は特定の脂質組成と機能を果たすのに十分な面積の利用可能性に依存します。ナノディスクは、制御されたサイズと脂質含有量の膜表面を提供するために使用されます。結合した外因性タンパク質がない場合、透過型電子顕微鏡(TEM)で側面から見ると、リンタングステン酸ナトリウムで染色されたナノディスクはコインの束として現れます。したがって、このプロトコルは、意図的にスタッキングを促進するように設計されています。したがって、スタッキングの防止は、膜結合タンパク質がナノディスクに結合すると解釈できます。さらに、タンパク質-ナノディスク複合体のTEM画像を標準的な単粒子法で処理し、高分解能のクライオ電子顕微鏡研究の基礎として低分解能の構造を得ることができます。さらに、ナノディスクは、TEMまたは非変性ゲル電気泳動のいずれかに適したサンプルを提供します。この方法を説明するために、ナノディスク上の5−リポキシゲナーゼのCa2+誘導結合を示す。

私たちが提案する方法はmonotopic膜タンパク質が結合するための膜表面を提供するために、ナノディスクの作成に依存します。ナノディスクの脂質二重層に埋め込まない膜貫通タンパク質が存在しないように、ナノディスクは、ここでは「空のナノディスク」（ 図2A）と表記されています。これらは、2 MSP1E3D1の足場タンパク質とPOPC 8の約260分子の組成物のために256キロダルトンの計算分子量を有します。このタンパク質の使用：再構成のための脂質比、一つの大きなピーク（ 図2A）は、ゲルろ過中に溶出しました。 9mLの（ 図2A）付近のピーク画分を一つのバンド（ 図2B、レーン1）を示す、青ネイティブゲル電気泳動49により検査しました。バンドが計算された256 kDaのよりもやや大きいサイズに対応するが、TEM像で測定されたナノディスクの直径はに対...

多くのタンパク質は、膜表面に付着するとその機能を果たします。ナノディスク膜上の外因性タンパク質の結合は、透過型電子顕微鏡によって間接的に画像化することができます。我々は、ネガティブ染色のリンスホタングステン酸ナトリウムによって誘発されるナノディスクの特徴的なスタッキング(rouleau)が、外部タンパク質の結合によって防止されることを示す。

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

本手順の全体的な目的は、タンパク質の高分解能構造決定への第一歩として、ネガティブ染色透過電子顕微鏡を用いて、ナノディスク膜表面への外在性膜タンパク質の結合を可視化することです。この手法は、細胞膜内および膜上で起こるタンパク質の活性に関わるため、いくつかの研究分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法の主な利点は、タンパク質が膜に結合できない場合に、ナノディスク形態が特徴的な積層構造を形成することにあります。これらの積層構造は、透過電子顕微鏡によって明確に観察することができます。この手法の有用性は薬剤開発にも及び、化合物をスクリーニングすることで、膜タンパク質間の相互作用を阻害または促進する能力を容易に評価できます。本手法は、膜へのモノトピックタンパク質結合における最適条件についての知見を提供できるだけでなく、タンパク質・ナノディスク複合体の低解像度構造をも提示します。手順を開始するために、MSP1E3D1などの膜スキャフォールディングタンパク質を発現および精製します。次に、金属針付きのガラスシリンジを用いて、クロロホルムに溶解した25 mg/mLのPOPCを305 µL、ガラス製丸底フラスコに分注します。ドラフト内で窒素ガスを緩やかに流し、クロロホルムを蒸発させます。真空デシケーター内で、残りの脂質を一晩乾燥させる。次に、乾燥した脂質ケーキを、界面活性剤として100 millimolarのコール酸ナトリウムを添加したMSP標準バッファー200 microlitersに溶解させる。混合液が透明になるまでボルテックスし、バッファー中に50 millimolarのPOPCを含む懸濁液を得る。次に、5 gの疎水性ビーズを30 mLの100%メタノールで洗浄し、続いて40 mLの超純水で、最後に10 mLのMSP標準バッファーで洗浄します。ビーズは15 mLの標準バッファーに浸し、4 °Cで保存します。その後、0.124 mMのMSP1E3D1溶液190 µLと、バッファー中の50 mM POPC懸濁液61.5 µLを混合します。これにより、MSPとPOPCのモル比が1:130となり、デオキシコール酸ナトリウム濃度が25 mMになります。MSPあたりの脂質の最適比率は、選択する脂質の種類およびMSPレンズによって異なり、ナノディスクの均一な調製を得るために最適化する必要があります。混合物を濡れた氷上で1時間インキュベートします。その後、再構成混合物1 mLあたり0.5 gの洗浄済み疎水性ビーズを含むチューブに溶液を加え、ナノディスクの自己組織化を開始させます。混合液を4 °Cで16時間、毎分7〜8回転でインキュベートします。インキュベート後、ビーズを重力で沈降させます。上清を除去し、サイズ排除クロマトグラフィーを行うまで4 °Cで保存します。サイズ排除クロマトグラフィーを行う前に、混合物を 13,000 g で 10 分間、4 °C で遠心分離します。上清をデカンテーションにより回収し、ペレットは廃棄します。280 nm におけるベースラインが安定するまで、MSP 標準バッファーを用いてサイズ排除クロマトグラフィーカラムを平衡化します。上清をカラムに注入し、製品を0.5 mLずつ分画して回収します。UV-vis分光光度計を用いて、各分画の280 nmにおける吸光度を測定します。選択したMSPのモル吸光係数を用いて、ナノディスクの濃度を算出します。非変性ゲル電気泳動を行うには、まず15 µLのサンプルを5 µLの適切なローディングバッファーと混合します。陰極タンクにライトカソードバッファーを、陽極タンクにランニングバッファーを満たします。サンプルを4〜16% Bis-Tris ゲルにロードし、泳動を開始します。ゲルの製造元の指示に従って、ゲルを染色します。5-リポキシゲナーゼをタンパク質とするナノディスク単一トピックタンパク質複合体の調製を開始するには、1.5 mMの塩化カルシウムを添加したMSP標準バッファーを調製します。5LOタンパク質を発現・精製します。カルシウム強化MSP標準バッファーを用いて、0.8 µMの5LOと0.8 µMのナノディスクを混合した100 µLの溶液を直ちに調製します。本例で用いるモノトピックタンパク質である5-リポキシゲナーゼは、膜への結合にカルシウム量に依存します。5LOは非常に不安定であるため、調製後数時間以内に使用する必要があります。混合物を氷上で10分間インキュベートします。得られたナノディスクタンパク質複合体サンプルは、4 °Cで最大1ヶ月間保存してください。TEM解析の準備を開始するには、1 gのタングステン酸ナトリウム塩を室温で50 mLの超純水に溶解させます。1 Mの水酸化ナトリウム溶液を用いて、溶液のpHを7.4に調整します。ホスフォトングステン酸ナトリウム溶液を0.22 µmのシリンジフィルターでろ過し、室温で保存します。次に、400メッシュのカーボンコート銅グリッドを、30 mAで20秒間グロー放電処理し、グリッド表面を親水化します。2.5～5 µLのナノディスクモノトピックタンパク質複合体サンプルをグリッドに滴下し、30秒間静置します。次に、フィルターペーパーを使用してグリッドから余剰な溶液を吸い取ります。直ちにタングステートナトリウム溶液を1滴滴下し、30秒間静置します。余剰な溶液を吸い取り、グリッドを風乾させます。加速電圧120から200 kilovoltsで透過電子顕微鏡観察を行います。長いスタックが見られる画像は、以降の画像処理から除外してください。選択した画像に対し、標準的な処理手法を用いてクラス平均を決定し、ナノディスクモノトピックタンパク質の低解像度3Dモデルを作成します。この手法を用い、膜足場タンパク質と脂質の比率を1:130として空のナノディスクを調製しました。サイズ排除クロマトグラフィーでは主要なピークが1つのみ観察され、ブルーネイティブゲル電気泳動でもバンドが1つのみ観察されました。空のナノディスクをホスホタングステン酸ナトリウム塩溶液で処理すると、積層が誘導されます。これらの長い積層構造は、TEMによって観察することが可能です。この積層は、ホスホタングステン酸ナトリウム溶液を適用する前にナノディスク溶液にカルシウムイオンを添加しても、妨げられませんでした。5-リポキシゲナーゼのようなモノトピックタンパク質がナノディスク表面に結合すると、タンパク質による立体障害によってスタッキングが阻害されます。ナノディスクの両面が結合に利用可能であるため、1:1および2:1の5LOナノディスク複合体が形成されます。2:1の5LOナノディスク複合体のサンプルは、1:1のサンプルよりもスタッキングが少ないことが示されました。5LOの結合にはカルシウムイオンの存在が必要です。これは、カルシウムを含まない5LOとナノディスクの混合物においてスタッキングが観察されたことで確認されており、5LOが膜表面に結合しなかったことを示しています。モノトピックタンパク質とナノディスクが準備できれば、適切に実施することで、タンパク質の膜への結合評価を午後の時間だけで完了させることができます。この手順を試みる際は、適切なMSPの長さを選択するために、ナノディスク上のタンパク質の面積を推定することが重要です。サイズが適切に一致している場合、最大で2つの外因性タンパク質がディスクの両側に1つずつ結合することができます。また、結合の確認は、モノトピックタンパク質を含まないサンプルの長いスタックと、スタックが消失した状態との比較によって行われるため、最大のスタッキングを確保するために、陰性染色にはホスホタングステン酸ナトリウムを使用することが重要です。リポソームの代わりにナノディスクを使用することで、動的光散乱法や小角X線散乱法を用いた、サンプルの均質性、サイズ、または分子構造に関するさらなる解析が可能になります。ナノディスクに結合した単一トピック膜タンパク質の低分解能3D構造の解明は、それら結合タンパク質の高分解能構造へと至る経路において、容易に達成可能な第一歩となる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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学ぶ 透過型電子顕微鏡を用いた膜相互作用タンパク質の視覚化手法。ナノディスク膜への外在性タンパク質結合を観察し、タンパク質-膜相互作用の理解と創薬研究への応用に貢献します。

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

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