Name: 発芽アッセイ回転楕円体を使用して推定される芽新生体外パフォーマンスを評価する包括的な手順 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶスフェロイド発芽アッセイを用いた血管芽細胞腫の新血管形成評価法。in vitroで古典的腫瘍血管新生の役割を解明し、治療戦略への応用可能性を示唆する包括的手順です。

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この作品は、上海科学委員会、技術 (15411951800、15410723200) からの助成金によって支えられました。著者教授 YuMei 温とその技術支援復旦の病原微生物部大学教授・ チャオ趙を感謝したいです。

このメソッドは、承認されたガイドラインや研究倫理委員会の華山病院、復旦大学の規則に従い行った。対応する標準的な安全対策は、各ステップで続いていた。図式、図 1を参照してください。
1. 細胞培養とプラスミド構築
<ol><li>定期的に管理ダルベッコでひと臍帯静脈内皮細胞 (株) のイーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 単位/ml ペニシリン、ストレプトマイシン加湿の 5% の 100 μ g/mL と補われる、変更された CO2インキュベーター37 ° C で</li>
	<li>ShRNA フラグメントの合成の ApaI と EcoRI PLKO.1 プラスミドを消化します。VHL shRNA ベクターのオリゴヌクレオチドのシーケンスが CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14であることを確認します。</li>
	<li>オリゴ、逆オリゴの 5 μ L、NEB バッファー x 10 の 5 μ L、ddH2O 一緒に (総容積は 50 μ L) の 35 μ L の 5 μ L 前方で、20 の µΜ システムを混ぜます。数時間で 4 分、ゆっくりと室温まで冷却 98 ° C で混合物を加熱します。</li>
	<li>一晩焼なまし oligos と一緒に 4 ° C で T4 リガーゼ PLKO.1 プラスミドを縛る。16 時間後、25 μ L の有能な DH5α セルに結紮ミックスの 5 μ L を追加します。正常に結紮プラスミドをスクリーンし、シーケンスによって挿入されたフラグメントを確認します。</li>
</ol>2. レンチ ウイルス パッケージと感染症
<ol><li>合計では、PLKO.1 shVHL または PLKO.1 shScramble のベクトルの 10 μ g、プラスミド psPAX2 のパッキングの 7.5 μ g、500 μ L の 25 分のためのウシ胎児血清 (FBS) なし DMEM メディアで封筒プラスミド pMD2.G の 2.5 μ g を混ぜます。</li>
	<li>FBS なし 7 mLDMEM を上記準備ソリューションに追加します。</li>
	<li>直径 10 cm のティッシュの培養皿で FBS なし DMEM 293 FT 細胞。293 FT 細胞数が 1 × 107セルのカウンターを使用してであることを確認します。</li>
	<li>293 FT 細胞の培地に transfection のため上記準備溶液 1 mL を追加します。 注:293 FT 細胞ラインは、293 f 細胞ラインから派生し、安定 SV40 大きい T の抗原を表現します。そのため、レンチ ウイルスの生産のための適したホストです。</li>
	<li>10% を含む DMEM 培に置き換える 6 h 後 FBS。</li>
	<li>トランスフェクション後 48 h でピペットを使用してメディアを収集します。 注:10% を含む DMEM にウイルスが存在する政府短期証券。死んだ細胞は、培地を浮遊します。0.45 μ m の無菌膜を使用すると、死んだ細胞や不純物をフィルター処理します。一般的に、感染症 (MOI) の多様性をチェックする必要はありません。これは、安定した細胞ラインを確立することです。最後のステップで成功の感染なしすべての生きている細胞は、ピューロマイシンによって死んでしまいます。ShScramble グループと血管内皮細胞は、コントロール グループです。すべての血管内皮細胞が 72 h で使用されるピューロマイシン濃度と死ぬことを確認します。同じ数のセルをすべてきちんと備えています。</li>
	<li>72 h のレンチ ウイルスのメディアで血管内皮細胞を培養します。ピューロマイシンを対照群として治療なし 24 時間使用血管内皮細胞の 2 μ G/ml の濃度で血管内皮細胞のメディアに追加します。この時点でセルは死に、コントロールを確認します。 注:生きている細胞は、VHL ノックダウン細胞と shSramble 細胞の安定したセルラインを表します。メッキ密度で 5,000/ウェルの 96 ウェル プレートであります。</li>
</ol>3. 血管内皮細胞スフェロイドの世代
<ol><li>Huvec 細胞を trypsinize し、10 %dmem 培地で再懸濁します FBS。10 cm 培養皿の細胞の中程度で、typsin EDTA の 1 mL を追加します。</li>
	<li>1 × 103細胞/ウェルの細胞密度で、3 D の丸底 96 ウェル プレートで細胞を播きます。まあ回転楕円体を停止する 0.50 μ L の回転楕円体を収容することができますそれを使用します。製造元の指示に従って細胞カウンター システムを用いた細胞を数えます。</li>
	<li>37 ° C で 5% CO2連続 72 時間のセルを孵化させなさい。これらの条件の下で浮遊細胞は自動的に細胞スフェロイドを形成することを確認します。36 時間後培地の半分を交換してください。</li>
</ol>4.体外血管新生アッセイ
<ol><li>4 ° C でゲル溶液を解凍し、減らされた血清培地で希釈比が 1:5 で割りますと。</li>
	<li>マイクロ ピペットを DMEM 培地から回転楕円体を吸います。減少血清培地 5 mL の回転楕円体を洗浄した後希釈のゲルで、ゆっくりと慎重に、回転楕円体を中止すること。空気の泡がないことを確認します。</li>
	<li>15 ウェル プレートに 300 μ L の混合液を埋め込みます。37 ° C と 1 h の 5% CO2で潜伏後 400 μ L 減少血清培地を各ウェルに追加します。滅菌水を蒸発を妨げる加湿環境を生成する井戸の周りをご記入ください。</li>
	<li>その後、文化で 37 ° C 1 時間の湿度 100% で 5% CO2プレート。</li>
	<li>慎重に古い培地を吸引し、各ウェルで内皮細胞成長サプリメントで 1% 減少血清中の 600 μ L で置き換えます。</li>
	<li>倒立顕微鏡下で撮影後 12 h、24 h (40 *)。</li>
</ol>5. データの解析
<ol><li>スプラウト長さデータ (資材表) を取得するオンライン画像解析プラットフォームに画像をアップロードします。</li>
	<li>Web ページ、メールでアカウントを作成します。</li>
	<li>[アップロード] ボタンをクリックして画像をアップロードします。</li>
	<li>ダウンロード ボタンをクリックして結果をダウンロードします。 注:ソフトウェアは、処理後の画像とデータが生成されます。データに 5 つの部分が含まれている: 累積的な芽の長さ、平均スプラウト長さスプラウト長さ、スプラウト領域と回転楕円体領域の標準偏差。処理後の画像の識別を容易にする別の色では、処理後の画像の各パラメーターの輪郭が表示されたら: 赤い表すもやしスケルトン、芽数を黄色、青い芽構造、白芽エンドとオレンジ回転楕円体。</li>
</ol>

<ol><li>Lonser, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673603136434">von Hippel-Lindau disease.</a> Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).</li>
<li>Hussein, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+capillary+haemangioblastoma%3A+the+pathologist%27s+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint.</a> Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas+might+derive+from+neoplastic+transformation+of+neural+stem+cells%2Fprogenitors+in+the+specific+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche.</a> Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).</li>
<li>Zhuang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+derived+vasculogenesis+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors.</a> Sci Rep. 4, 4102(2014).</li>
<li>Glasker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VHL-deficient+vasculogenesis+in+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma.</a> Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).</li>
<li>Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+and+its+receptors+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+and+sporadic+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.</a> Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).</li>
<li>Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+a+cerebellar+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).</li>
<li>Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+hemangioblastoma%3A+histogenesis+of+stroma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells.</a> Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).</li>
<li>Jurco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas%3A+histogenesis+of+the+stromal+cell+studied+by+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry.</a> Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tumorigenic+cells+and+implication+of+their+aberrant+differentiation+in+human+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas.</a> Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD41+and+CD45+expression+marks+the+angioformative+initiation+of+neovascularisation+in+human+haemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma.</a> Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).</li>
<li>Sharifpanah, F., Sauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Spheroid-Based+Sprout+Assay+in+Three-Dimensional+Fibrin+Scaffold%3A+A+Novel+In+Vitro+Model+for+the+Study+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).</li>
<li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+taurine+upregulated+1+enhances+tumor-induced+angiogenesis+through+inhibiting+microRNA-299+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma.</a> Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Conveniently+Screening+pLKO.1-TRC+Vector+Tagged+with+TurboGFP%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).</li>
<li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li>
<li>D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+Vasculogenesis+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease.</a> Biomed Res Int. 2015, 126582(2015).</li>
<li>Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+in+vivo+vasculogenic+potential+of+endothelial+progenitor+cells+in+comparison+to+human+umbilical+vein+endothelial+cells+in+a+spheroid-based+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model.</a> Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).</li>
<li>Morin, K. T., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+angiogenesis+and+vasculogenesis+in+fibrin+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel.</a> Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).</li>
<li>Blacher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+in+the+spheroid+sprouting+assay%3A+a+spatial+organisation+analysis+adaptable+to+cell+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour.</a> PLoS One. 9 (5), 97019(2014).</li>
<li>Straume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+heat+shock+protein+27+induces+long-term+dormancy+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).</li>
<li>Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+angiogenesis+in+human+tumor+dormancy%3A+animal+models+of+the+angiogenic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch.</a> Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).</li>
<li>Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+due+to+failure+of+angiogenesis%3A+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment.</a> Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+respond+to+cerebral+ischemia+without+susceptibility+to+HB-tumorigenesis+in+VHL+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice.</a> Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).</li>
<li>Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+control+of+angiogenesis+in+hemangioblastomas+by+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).</li>
<li>Correa de Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogeneous+in+vitro+three+dimensional+model+of+tumour-stroma+interactions+regulating+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (2), 30753(2012).</li>
</ol>

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最近では、血管生物学の研究の複数のフィールドが血管内皮15の研究によって刺激されました。この記事での新規候補分子を識別するために操作の血管内皮細胞における機能の VHL 遺伝子の損失に起因する血管の形成を研究する実験モデルとして技術を発芽内皮細胞スフェロイドを開発した、血管新生のカスケード。我々 の知る限り、これは天体の変更された血管内皮細胞の血管新生効果を検討する最初の報告です。
組織 (腫瘍組織を含む) の血管新生は開発時にだけでなく、両方の生理学的および病理学的条件12,15 を介して血管新生と vasculogenic メカニズムで発生する複雑な過程,16. 発芽アッセイ回転楕円体、イベント17,18、発芽の...

血管芽腫 (HBs) は、人間の中枢神経系 (CNS) にのみ見られる血管腫です。フォン ・ ヒッペル-リンダウ (VHL) 病や散発的な病変の患者で開発します。VHL HBs は頻繁に再発のため外科的治療によって治癒が困難とこれに起因する遺伝的多発障害1。VHL 癌抑制遺伝子の不活化は、VHL HBs の腫瘍の根本的な原因と考えられている、(新生血管を含む) 細胞の起源と HBs の進化プロセスのまま大きく物議を醸す2です。したがって、HB 新生血管生物学的メカニズムの理解は、VHL HBs の最も有望な抗血管戦略に有用な洞察を提供可能性があります。
最近の研究では、HB 新生血管が発生学的血管3,4、5と似ていることを示唆しています。古典的な血管内皮増殖因子 (VEGF)-を介した血管新生血管の内皮細胞に由来する、関数の VHL の損失によって牽引されて増殖し、新生血管形成されている6に挑戦します。1965 年 Cancilla とジマーマンは、HBs の由来内皮7電子顕微鏡を使用してください。その後、間質細胞由来 vasoformative エレメント8それが見つかりました。1982 年、Jurcoらは間質細胞が内皮細胞起源9あることを発見しました。したがって、我々 の仮説ひと血管内皮細胞が HB 血管新生10の元の細胞であります。VHL 患者手術から派生した HB 細胞の初代培養を使用することをお勧め、HB からプライマリ カルチャが、安定しない、細胞株の確立された3できませんでした私たちの以前の研究が示されます。また、HB 血管成分10,11の前駆細胞が含まれているために、3 D 環境で初代培養は HB 新生血管の細胞起源を識別できませんでした。したがって、プリミティブと古典的な血管内皮細胞のモデルとしてひと血管内皮細胞 (株) は、HBs の細胞の代替モデルとして役立つことができます。
回転楕円体の発芽アッセイは、組織工学12,13の新しいモデルです。本稿で、3 D コラーゲン ベース共システムの in vitroアッセイを発芽回転楕円体を使用して、開発された HBs に於いての役割と同様、HBs、古典的な腫瘍血管新生が存在するかどうかを評価するための全体的な目標を持つ。

<table><tbody><tr><td>ヒト臍帯静脈内皮細胞</td><td>復旦IBS細胞</td><td>センターFDCC-HXN180</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'修正されたイーグル」s ミディアム&nbsp;</td><td>ギブコ</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ギブコ</td><td>&nbsp;</td><td></td>26400044</tr><tr><td>PLKO.1-puroベクター</td><td>Addgene</td><td>#8453</td><td></td></tr><tr><td>充填プラスミド psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>エンベローププラスミド pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>3D 丸底 96 ウェルプレート</td><td>S-Bio</td><td>MS-9096M</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>reduced serum medium&nbsp;</td></tr><tr><td>15ウェルプレート</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td>ゲル内の気泡は、&mu;&ndash;インキュベーター内で使用する前に血管新生をスライドさせる オーバーナイト</td></tr><tr><td>内皮細胞増殖サプリメント</td><td>Sciencell</td><td>#1052</td><td></td></tr><tr><td>10-cm 培養皿</td><td>Corning</td><td>Scipu000813</td><td></td></tr><tr><td>ピュロマイシン</td><td>Gibco</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>typsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Automated Cell Counter System &nbsp;</td><td>BioTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア&nbsp;</td><td>ウィンマシス</td><td></td><td>http://mywim.wimasis.com&nbsp;</td></tr></tbody></table>

発芽アッセイ回転楕円体を使用して推定される芽新生体外パフォーマンスを評価する包括的な手順

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

・ フォン ・ ヒッペル-リンダウ (VHL) 癌抑制遺伝子の不活化は、人間の中枢神経系 (CNS) 内血管芽腫 (HBs) の開発で重要な役割を果たしています。しかし、細胞の起源と HBs (新生血管を含む) の進化の過程の両方残る物議を醸す、VHL HBs、古典的な HB 新生に基づいての抗血管新生が臨床試験で残念な結果を生成しました。抗血管内治療の臨床成功の翻訳 1 つの主要な障害は、この血管豊富な腫瘍血管新生の徹底的な理解の欠如です。この記事では体外でHBs に於いての役割と同様、HBs、古典的な腫瘍血管新生が存在するかどうかを評価する包括的な手順を提案する.この手順で研究者は正確に HB 血管新生の複雑さを理解し、HBs で血管新生のこの一般的な形式の関数を識別できます。これらのプロトコルは、腫瘍の治療のため、または HBs 抗血管新生治療の最適化で将来の翻訳を支援する並進可能性が高い腫瘍については、最も有望な抗血管治療の評価に使用できます。結果は、HB の血管新生の複雑さを強調表示し、この一般的なフォームの血管新生が HB 血管新生の補完機構のみであることを示唆します。

元の画像は倒立顕微鏡で撮影しました。コントロール グループと VHL グループの典型的なイメージは、図 2に示す-A1および図 2-A2。コントロール グループの発芽の長さは VHL グループのより短いです。
画像をアップロードした後は、オンラインのプラットフォームは、分析結果を直接提供します。出力は、2 つの部分で構成されています: 処理された画像と対応する解析結果。コントロール グループと VHL 遺伝子の沈黙グループの加工画像が異なる色でマークされます (図 2-A3と図 2-A4</stron...

In vitro血管芽腫 (HBs) と HBs におけるその役割の古典的な腫瘍血管新生が存在するかどうかを評価する包括的な手順を提案します。結果は、HB 血管新生の複雑さを強調表示し、血管新生のこの共通の形態の HB 血管新生における補完機構のみが示唆されました。

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

この実験の全体的な目標は、in vitro のスフェロイド発芽アッセイを使用して、推定される血管芽腫の血管新生術の性能を評価することです。この方法は、腫瘍血管新生などの血管新生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、古典的な腫瘍血管新生が血管芽腫に存在し、それが血管芽腫で増殖するin vitroを評価するための包括的な手順の産物であることです。この技術の意味は、血管芽腫および血管系の治療にまで及びます。なぜなら、その結果は血管芽腫の血管新生の複雑さを強調しており、この一般的な形態の血管新生は補完的なメカニズムにすぎないことを示唆しています。したがって、この方法は、血管芽腫または血管新生の研究への洞察を提供することができます。また、ガラス腫瘍における腫瘍血管新生模倣など、一部の固形腫瘍における腫瘍、血管新生、および血管新生に関連するアプリケーションにも適用できます。これらの操作された内皮細胞スフェロイドステップの生成を学ぶのが難しいため、この方法の実際のデモンストレーションは非常に重要です。なぜなら、適切なコンディションが重要だからです。まず、10%のウシ胎児血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したDMEM培養培地でHUVEC内皮細胞を培養します。次に、インキュベーター内の培養物を摂氏37度に維持し、二酸化炭素を5%にします。次に、shRNAフラグメントを合成するために、ApaIおよびEcoRI制限酵素でプラスミドを消化します。次に、消化したプラスミドに、フォワードオリゴとリバースオリゴの両方、10x NEBバッファー、および二重蒸留水を加えて、最終容量50マイクロリットルにします。すべての試薬を加えた後、混合物を摂氏98度で4分間加熱します。その後、数時間で徐々に室温まで冷まします。T4リガーゼを使用して、アニーリングされたオリゴとプラスミドをライゲーションします。チューブを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、25マイクロリットルのDH5alphaコンピテントセルに5マイクロリットルのライゲーションミックスを加えます。500マイクロリットルのDMEM培地に、レンチウイルスベクターまたはスクランブルベクターを他のパッケージングプラスミドとともに添加します。次に、レンチウイルス混合物を摂氏37度で25分間インキュベートします。インキュベーション後、スクランブルまたはレンチウイルス混合溶液に7ミリリットルのDMEM培地を加えます。293FT細胞を、ウシ胎児血清を含まないDMEM培地で10cmの培養皿で培養します。1ミリリットルのレンチウイルス溶液またはスクランブル溶液を培養皿中の293FT細胞に加えます。6時間後、培養皿から古い培地を吸引します。次に、古い培地を10%のウシ胎児血清を含む新しいDMEM培地に交換します。48時間後、培地を回収します。HUVEC内皮細胞をレンチウイルス培地に移し、72時間維持します。次に、ピューロマイシン1ミリリットルあたり2マイクログラムをHUVEC細胞培養培地に加えます。最後に、培養物をさらに24時間インキュベートします。翌日、1ミリリットルのトリプシンEDTAを加えてHUVEC細胞をトリプシン化します。次に、トリプシン化した細胞懸濁液をDMEM培地に10%ウシ胎児血清とともに再懸濁します。セルカウンターを使用してセルの数をカウントします。カウント後、3D丸底96ウェルプレートに細胞を播種します。播種後、細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素と72時間連続してインキュベートします。36時間後、培地の半分を新鮮な培地と交換します。まず、ゲル溶液を摂氏4度で解凍し、次に還元血清培地で1対5の比率で希釈します。マイクロピペットを使用してDMEM培地からスフェロイドを吸引します。次に、スフェロイドを5ミリリットルの還元血清培地で洗浄します。懸濁したスフェロイドと希釈したゲルを慎重に移します。15ウェルプレートに、スフェロイドと希釈ゲルの混合液を300マイクロリットルに埋め込みます。プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。次に、400マイクロリットルの還元血清培地を1つのウェルに加えます。蒸発を防ぐために、井戸の周囲を滅菌水で満たします。次に、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度100%で1時間培養します。インキュベーション後、古い培地を吸引し、1%の内皮細胞増殖サプリメントを含む600マイクロリットルの還元血清培地をウェルに加え、1日間インキュベートします。倒立型光学顕微鏡を使用して画像をキャプチャします。ここでは、細胞のスフェロイド発芽を倒立型光学顕微鏡を使用して捕捉し、VHL遺伝子サイレンシングが内皮細胞の血管新生能に及ぼす影響を研究します。スフェロイドは、レンチウイルス治療の12時間後に、対照細胞とVHLサイレンシング内皮細胞の両方で発芽することが見られます。次に、VHL遺伝子サイレンシングスフェロイドによって生成されたスプラウトの長さを定量化するための統計解析を行います。平均芽の長さは、VHLサイレンサー群で約125マイクロメートルであるのに対し、対照群では約65マイクロメートルであるようです。VHLサイレンシング群の平均累積芽長は約1250マイクロメートルで、対照群の平均スプラウト長は約680マイクロメートルです。これらの結果は、VHLサイレンシング群でスプラウト長が2倍に増加したことを示している。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば48時間で習得できます。この手順およびキャピラリー形成アッセイのような方法に従って、追加の質問に答えるために実施することができる。血管内皮細胞の血管新生能力を探求するようなものです。この開発の後、この技術は、血管新生の分野の研究者が腫瘍の内部血管形成を探求する道を開きました。このビデオを見れば、エクスプローディングアッセイに使用される操作された内皮細胞でどの遺伝子が機能を失うのかを十分に理解できるはずです。

a-comprehensive-procedure-to-evaluate-vitro-performance-putative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。...

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

プロトコルでは、回転楕円体の perfusable...

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

新規体外ビーズ アッセイをこのプロトコルより適切に体内の血管を組み込むことによって血管新生を萌芽の過程をモデル化します。この変更により、血管内皮細胞と血管新生に重要な壁画と有性の細胞間相互作用をより忠実に再現するビーズ...

ペリサイトの発芽アッセイ内皮細胞ビーズを組み込む

この方法は、標準化されたマイクロ流体プラットフォームにおける40の浸透した3Dマイクロ容器としてiPSC由来内皮細胞の培養を記述する。このプラットフォームは、アナストモシスや、スケーラブルで高スループットな方法での血管新芽の安定化を含む、3Dでの勾配駆動血管新生芽芽の研究を可能にします。...

iPSC由来内皮細胞の浸透した3D血管新生発芽をインビトロで研究するための標準化およびスケーラブルなアッセイ

三次元共培養スフェロイド血管新生アッセイシステムは、生理学的血管新生を模倣するように設計されている。共培養スフェロイドは、2つのヒト血管細胞前駆体、CFFCおよびMSCによって形成され、コラーゲンゲルに埋め込まれる。新しいシステムは血管新生調節器の評価に有効であり、生体内研究により関連性の高い情報を提供する。...

内皮コロニー形成細胞と間葉系幹細胞によって形成された共培養スフェロイドを用いた3次元血管新生アッセイ系

このプロトコルは、微小血管増殖の元生体モデルである脈絡芽発芽アッセイを提示する。このアッセイは、脈絡膜微小血管の増殖に関与する経路を評価し、野生型および遺伝子組み換えマウス組織を用いた薬物治療を評価するために使用することができる。...

眼小血管血管新生のエキビボロイド発芽アッセイ

このアッセイは、3Dコラーゲンゲルで培養した胚様体に分化したマウス胚性幹細胞を利用して、 in...

インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

乳腺上皮細胞と内皮細胞との間のクロストークは、乳癌の進行、腫瘍の増殖、転移に重要な貢献をする。本研究では、スフェロイドは、血管および/またはリンパ内皮細胞と共に乳癌細胞から作られ、乳癌研究のための インビトロ...

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

ここでは、腫瘍スフェロイドの迅速、堅牢、低コストな作製とそれに続くハイドロゲルカプセル化を可能にするプロトコルを紹介します。特殊な機器を必要としないため、広く適用できます。特に、スフェロイドとマトリックスの相互作用を探索したり、 in vitro 組織生理学や病理学モデルを構築したりするのに有用です。...

スフェロイド-マトリックス相互作用研究のためのポリエチレングリコールハイドロゲルにおける腫瘍スフェロイドの作製とカプセル化

この研究では、2次元(2D)スクラッチ創傷移動アッセイと3次元(3D)スフェロイドスプラウティングアッセイ、およびRNA抽出や免疫細胞化学などのそれぞれのダウンストリーム分析方法が、 in...

Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

学ぶスフェロイド発芽アッセイを用いた血管芽細胞腫の新血管形成評価法。in vitroで古典的腫瘍血管新生の役割を解明し、治療戦略への応用可能性を示唆する包括的手順です。

発芽アッセイ回転楕円体を使用して推定される芽新生体外パフォーマンスを評価する包括的な手順

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