分子インプリントを用いたバイオ マーカーの超高感度検出による静電容量センサー

この技術の全体的な目標は、非常に複雑なサンプル中の低存在量の生体分子を、高感度、簡便、低コスト、高速で、標識を使用せずに検出および定量することです。この方法は、環境モニタリング、食品安全、飲料水の品質、医療診断など、バイオテクノロジー、生化学、生物医学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、その固有の迅速性、シンプルさ、高感度、低コスト、簡単な操作、および標識試薬を使用しないリアルタイム検出です。

この手法は、存在量が少ない生体分子を定量する能力があるため、疾患の診断にも応用できます。たとえば、さまざまなバイオマーカーをリアルタイムで取得できます。ガラスカバースリップを洗浄するには、1.0モルHClの10ミリリットルに室温の超音波洗浄機に10分間浸します。

次に、同じ条件下で脱イオン水と1.0モルの水酸化ナトリウムに浸します。ガラスカバースリップを窒素ガスで乾かします。次に、清潔で乾燥させたカバーガラスを10ミリリットルのAPTES溶液に1時間浸し、室温でカバーガラス表面にアミノ基を導入します。

カバーガラスを脱イオン水ですすいでから、窒素ガスで再度乾燥させます。APTES改質カバースリップを10ミリリットルのグルタルアルデヒド溶液に2時間浸漬し、室温で表面のアミノ基を活性化します。インキュベーション後、カバーガラスを10ミリモルリン酸緩衝液ですすぎ、表面から余分なグルタルアルデヒドを除去します。

カバースリップを窒素ガスで乾かします。次に、10ミリモルリン酸緩衝液中に1.0ミリリットルのテンプレート溶液を0.1ミリグラム/ミリリットルの濃度で調製します。このテンプレート溶液の200マイクロリットルを改質したカバースリップに滴下し、摂氏4度で一晩インキュベートします。

電極を洗浄するには、まず電極を5ミリリットルの70%エタノールを含む小さなビーカーに室温の超音波洗浄機で10分間浸します。次に、電極を同じ条件下で脱イオン水、アセトン、脱イオン水、酸性ピラニア溶液、および脱イオン水に順次浸します。電極を窒素ガスで乾燥させます。

チラミンの電気重合を行うには、2ミリリットルのエタノールを含む10ミリモルリン酸緩衝液に8ミリリットルの10ミリリットルのチラミン溶液を調製します。このソリューションで、0〜1.5ボルトの電位範囲と毎秒50ミリボルトのスキャンレートをカバーするポテンショスタットを使用して、15サイクルのサイクリックボルタンメトリックスキャンを実行します。次に、電極を脱イオン水ですすいでから、電極を窒素ガスで乾燥させます。

電極をトルエンに30ミリモルのアクリロイルクロリドと30ミリモルのトリメチルアミンを含む溶液に室温で一晩浸してから、電極を再度すすぎ、乾燥させます。重合に先立ち、820マイクロリットルの超純水にモノマーと架橋剤を含むモニマー溶液を調製します。次に、超純水で5%の容量to容量TEMEDを調製します。

モノマー溶液に20マイクロリットルのTEMED溶液を加え、窒素ガスで5分間パージします。次に、調製したばかりのAPS20マイクロリットルをモノマー溶液に加えます。1.5マイクロリットルのモノマー溶液を改質金電極表面にピペットで移します。

次に、テンプレートスタンプをモノマー処理表面に接触させて重合を開始し、室温で5時間放置します。重合後、鉗子を使用して、テンプレートスタンプを表面から慎重に取り除きます。次に、電極を脱イオン水ですすぎ、窒素ガスで乾燥させます。

電極表面のピンホールを覆うために、エタノールで調製した1つのドデカンテオールの1ミリリットルの10ミリロマーに電極を20分間浸します。最後に、電極を脱イオン水ですすぎ、窒素ガスで電極を乾燥させてから、走査型電子顕微鏡で表面を特性評価します。刻印された静電容量式金電極を、静電容量式バイオセンサーに統合された電気化学フローセルに挿入します。

100ミリリットルの再生バッファーと1リットルのランニングバッファーを準備します。システムを再生するための再生バッファーと、システムを25分間再平衡化するためのランニングバッファーの注入から分析を開始します。ランニングバッファーで目的の濃度範囲の標準テンプレート溶液を調製します。

次に、これらの標準溶液250マイクロリットルを最適な条件でシステムに順次注入します。金電極の表面特性評価は、走査型電子顕微鏡によって行われます。むき出しの金色の表面が示されています。

また、電極の表面にさまざまな倍率で付着したバクテリオファージも示されています。ここに示されているのは、センソグラムを介してインプリントされた金電極に結合するリアルタイムのバクテリオファージです。安定したベースラインは、サンプルの注入前にシステムの再生と再平衡化の後に確立されます。

電極にはファージ特異的な空洞があります。サンプル誘導バクテリオファージを注入すると、標的バクテリオファージが金電極の表面に刻印された空洞に結合するため、静電容量が減少します。検量線は、バクテリオファージ注入におけるタンパク質注入に対する静電容量の変化を示しています。

これらのグラフの式から、サンプル中のバクテリオファージまたはタンパク質の濃度を計算することができます。このビデオを見れば、超高感度で高速なリアルタイム検出システムの開発方法について十分に理解できるはずです。一度習得すれば、このテクニックは待ち時間を除けば5時間30分で完了します。

この手順を試行している間は、すべての薬剤を同じ日に新鮮な状態で準備することが重要です。この手順に続いて、原子間力顕微鏡、走査型電子顕微鏡、エリプソメータ、量子角度測定などの他の指標を実行して、重合またはインプリンティングが成功したかどうかを判断し、裸の金電極とインプリントされた金電極の表面間の有意な違いを検出することができます。その開発後、この技術は、生化学、バイオテクノロジー、生物医学の分野の研究者が、食品の安全性と医療診断における生体分子の超高感度検出を探求する道を開きました。

機能性モノマー、架橋剤、開始剤、その他の薬剤の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。また、手袋の着用、白衣の着用、ヒュームフード内での重合実験などの予防措置を常に講じて実験を行う必要があります。