Name: タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶタンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソフォームの高感度・定量的検出手法。バイオマーカー発見や創薬研究に有用で、疾患診断におけるタンパク質解析に応用可能です。

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著者教授レナ クラーソン-ウェールズ、ウプサラ大学、スウェーデンはこのプロジェクトを開発するための彼女のサポートのおかげでください。さらに、著者は、ロス スミスとレナ クラーソン-ウェールズ、ウプサラ大学の重要な読書と原稿を改善する提案をありがちましょう。

1. セルの換散、刺激、文化
注: このメソッドは、多くの細胞のタイプで使用できます。このメソッドを示すためには、ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) の使用例が説明されています。
<ol><li>文化 10 cm シャーレをゼラチンでコーティングされた、適切な補充と内皮細胞基本培地での比較 (材料の表を参照)、5% の FCS、表皮の成長因子 (5 ng/mL)、血管内皮増殖因子を含有 (VEGF:0.5 ng/mL) 基本的な FGF (10 ng/mL)、インスリン様成長因子 (20 ng/mL)、ヒドロコルチゾン (0.2 μ G/ml) とアスコルビン酸 (1 μ g/mL)。</li>
	<li>1% の FCS と成長因子のないサプリメントを添加した内皮細胞基本培地で細胞を一晩餓死します。</li>
	<li>すべての培地を吸引、一皿 (コントロール) の成長因子 (飢餓中) することがなく血管内皮細胞培養培地 2 mL を追加し、2 番目の料理は 7 分間の飢餓培養培地 2 mL に 50 ng/mL VEGF を追加します。</li>
	<li>培地を吸引し、10 mL 室温 PBS で 2 回細胞を洗ってください。</li>
	<li>ペトリ皿は氷の上、この手順以降から維持することを確認します。</li>
	<li>氷冷の換散バッファー (ビシン/チャップス; 参照テーブルの材料) 含む水溶液プロテアーゼ阻害剤ミックスと DMSO 阻害剤ミックス (ホスファターゼの抑制剤; 参照テーブルの材料) の 250-400 μ L を各 10 cm プレートに追加します。適切なカバレッジを確保し、10 分間氷の上プレートを旋回します。 注: プロテアーゼと DMSO 阻害剤ミックスの最終濃度は、1 x をする必要があります。</li>
	<li>あらかじめ冷やしておよび microfuge の管にお皿から細胞スクレーパーと転送細胞をこすり。ピペットを上下のセルを示した 5 回。</li>
	<li>4 ° C でセルを簡単に超音波します。超音波発生装置を次のように設定: サイクル数 = 5、電源 = 低、5 秒を =、= 30 s。この手順は含まれている核酸を破るしていない細胞を溶解させます。 注: 超音波処理はタンパク質の変性を防ぐために穏やかなする必要があります。</li>
	<li>渦管 5 s (ない継続的に) 2 時間 (3 回)、し氷の上で s。</li>
	<li>4 ° C で 15 分間 14,000 × g で遠心分離によってライセートを明確し、すぐにきれいな中古冷蔵および microfuge の管に上清を転送します。</li>
	<li>ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイ キット4を使用して蛋白質の集中を測定します。</li>
	<li>作る 10 μ 因数、スナップ ドライアイスまたは液体窒素で凍結し、使用まで-80 ° C で保存します。</li>
</ol>2. 試料ミックス (150 μ L サンプル ミックスの算定)
<ol><li>DMSO 阻害剤ミックスの 1 μ L を追加することによってまず、サンプル希釈ミックスを準備 (50 x 在庫) とプロテアーゼ阻害薬 (在庫 25 x) サンプル希釈液の 47 μ L に 2 μ L (材料の表を参照)、DMSO 阻害剤とプロテアーゼ阻害剤の最終濃度1 倍になります。次に、サンプル希釈ミックスを使用して (手順 2.3 参照) 必要な濃度を取得するタンパク質溶解液を希釈します。</li>
	<li>両性電解質/はしご/プロテアーゼ阻害剤/DMSO 阻害剤ミックスを準備するには、追加し 3.325 μ L 標準はしご (テーブルの材料; 60 倍の在庫を参照)、プロテアーゼ阻害剤 (25 x) 3 μ 137.675 μ L 両性電解質プレミックス (のテーブルを参照する DMSO (50 x) 阻害剤の 6 μ L材料)。渦管少なくとも 15 s、合計 5 時間で s (3-4 回) し、氷の上。</li>
	<li>最終濃度の DMSO、プロテアーゼ阻害剤、および pI 標準はしご 1 X になるし、キャピラリー中でタンパク質最終目的の濃度に達するので、2.1 と 2.2 は比率 1:3 の手順からソリューションをミックス (例えば、50 μ g/mL 用いて図 2)。 注: 蛋白濃度キャピラリーとも、同じです。</li>
	<li>384 ウェル プレート アッセイのテンプレートのレイアウトに応じて適切な井戸にサンプル ミックスの 10 μ L を読み込む (手順 3 と図 1を参照) し、氷の上のプレート。</li>
	<li>希釈するプライマリ (pERK1/2、1:50;ERK1/2、1: 100。HSP 70、1: 500) および抗体希釈液と二次抗体 (1: 300) (材料の表を参照) を各ウェルに二次抗体のプライマリおよび 15 μ L の 10 μ L をピペットと。 注: 一般に、抗体の濃度が高く、従来の西部のしみと比べて代表取締役アッセイに必要です。</li>
	<li>ルミノールをミックスし、XDR (比率 1:1; 参照テーブルの材料) を一緒に過酸化水素を各ウェルに 15 μ L をピペットします。 注: は使用前に毎回これらのソリューションの新鮮なをミックスして、氷の上。</li>
	<li>サンプルおよびすべての試薬は、プレートに戻は、一度は、スピン ・ ダウン液体と気泡を除去するための 4 ° C で 10 分間 2,500 x g でプレートを遠心します。泡がまだ存在する場合は、細いピペット チップを使用して手動でそれらを削除します。 注: 以上 20 μ L のサンプルや試薬によくあたりが読み込まれないそれ以外の場合、計測器ピペットを正しく洗浄できません。すべての試薬製造元の取扱説明書に従うことを確認してください。</li>
</ol>3. システム ソフトウェア (図 1) と新しいアッセイ テンプレートのデザイン
<ol><li>システム ソフトウェアを開き、[ファイル] メニューから「新規」をクリックします。</li>
	<li>レイアウト ペインに移動し、試薬および 384 ウェル プレートのサンプルの場所を割り当てます。96 ウェルの 384 ウェル プレートごとの最大値使用します。</li>
	<li>試薬割り当てをブロックでまあどこでもクリックしてください。12 ウェルの行ブロックを選択します。井戸、例えば1-12 または 13-24 からは既定でブロックとして割り当てられます。</li>
	<li>レイアウト ウィンドウのツール バーに移動し、空の行ブロックまたはサンプル、プライマリ、セカンダリ、またはルミノール行ブロックを挿入します。各ブロックには、区別するためなので別の色が割り当てられます。 注: 井戸をクリックすると、黒い境界線がペインに新しいブロックを挿入、ブロックの周り表示されます。行のブロックを削除することも。</li>
	<li>プロトコル] ウィンドウに移動し、プレートに試薬の場所を選択します。[サンプル] 列のセルをクリックし、ドロップ ダウン メニューから、試薬を選択します。</li>
	<li>この同じ方法では、各サイクルのルミノールおよびプライマリ、セカンダリ、試薬の場所を選択します。</li>
	<li>1 つずつ、プライマリまたはセカンダリの抗体] 列でセルをクリックし、必要に応じてインキュベーション時間を変更します。 注: 各サイクルのエントリについての情報を追加もできます。</li>
	<li>サイクルを追加するには、プロトコルのセクションの追加」ボタンをクリックします。1 サイクル、4 サイクル、またはすべてのサイクル (8 サイクルの最大値は、プロトコルに追加することができます)。 注: この手順でサイクルの情報をコピペすることは: サイクルを選択、コピーして貼り付け、編集に行きます。</li>
	<li>サンプルでは、第一次および二次抗体、カタログ番号と希釈など、テンプレート ペインでの id などに関連する情報を入力します。これは、実行後の分析中にある省略可能な手順です。</li>
	<li>新しい分析ファイルを保存します。「スタート」ボタンをクリックしてする前にすべてが正しいことを確認するレイアウトをすばやく確認します。</li>
</ol>4. 代表取締役計測器の設定のためのプロトコル
<ol><li>キャピラリー等電点電気泳動の分離条件を設定します。これらは 15,000 μ と 40 分をする必要があります、UV 固定時間は 80 にする必要があります s。しかし、紫外線の固定時間 80 140 s の範囲内で設定することができます、興味の蛋白質のために最適化する必要があります。 注: 各毛細血管ではなく、各サイクルの UV 固定の時点を設定できます。</li>
	<li>セットを洗って 1 に 2 洗浄、150 s 各洗浄 (既定値) と 120 分の一次抗体の孵化。</li>
	<li>セットを洗う 2 に 2 洗浄、150 s 各洗浄 (既定値) と 60 分のための二次抗体の孵化。</li>
	<li>洗浄 3、150 の 2 洗浄をする必要がありますを設定 s 各洗浄 (既定値)。</li>
	<li>化学発光が認められるときの露光時間を設定します。30、60、120、240、490、960 これらする必要があります s。(1-8) の手順をすべては単一の毛細血管でわれます。</li>
</ol>5. 分析ファイルを実行します。
<ol><li>すべてが準備ができていると、開始をクリックして実行を開始します。ソフトウェアは、水と洗浄バッファーを追加する、リソース トレイに陽極と陰極を追加する、キャピラリー ボックスを補充するため、廃棄物を削除するよう指示されます、最後に冷却サンプル トレーにプレートを読み込む。 メモ: は、キャピラリーのボックスからふたを外すが、アッセイ プレートから蓋を削除しないでください。プレートから蓋は、必要に応じて計測器によって自動的に削除することができます。これは試薬の蒸発を防ぐのに役立ちます。</li>
	<li>実行後、分のカップルが開始された、楽器のステータスバーは、コンピューターの画面に表示されます。ステータス メッセージと進行状況バーは、計測器の現在のステージに対応する見ることが。 注: 最初に、楽器がチェック、すべてが分離トレイに陽極と陰極をピペットに進む、12 毛細血管の最初のブロックを拾って、プレートの蓋を取り外し、サンプルからサンプルを配置する前に正しいプレート、毛細血管にし、最終的に電気泳動分離室へ。</li>
	<li>2 つのペインを参照してください実行のサマリー画面でクリックして: 状態および分離。ユーザーは、実行の進行状況を表示できます、各サイクルの電気泳動のステップが完了したときに分離 (それぞれのサイクルの 12 毛細血管) の映画を格納できます。キャピラリー電気泳動分離を観察するには、目的のサイクルをクリックし、コントロール パネルの再生ボタン クリックしてでその細管用の分離ムービーを再生します。</li>
	<li>実行ファイルは、実行の完了時に自動的に保存することができます。</li>
</ol>6. 分析データ (図 S1)
<ol><li>実行ファイルを開くし、解析画面のタブを選択します。図 S1Aで (ピーク) をサンプル グラフに表示するデータは、(すなわち1 のサイクルから 4回キャピラリー) 選択した毛細血管からです。</li>
	<li>編集し、分析 (図 S1B) をクリックします。この段階では、pI の範囲を変更、与えられた実験のため適切な pI 基準を適用、ピーク フィットを追加したりできますピーク名を追加します。 注: pH 5-8 両性電解質を用いたプレミックス (ここでの場合と同様)、7.3、7.0 6.4 6.0 4.9 の小僧と蛍光標識ペプチドであるを使用する推奨される標準はしごし推奨のはしご、4.0 の小僧と 1 台で pH 3-10 プレミックスを使用している場合、7.3 6.4,、6.0 4.9。2
</li>
	<li>[ピーク] タブに結果が表示されます。サンプルに表示される値は、位置、pI、ピーク高さとエリア、% 地域、ピーク幅、信号対雑音 (S/N) (図 S1C) です。使用して、データを選択し、詳細な分析データをエクスポートします。 注意: データは、ピーク (図 S1C) にラベリングした後のみエクスポートできます。</li>
</ol>

<ol><li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li>
<li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li>
<li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li>
<li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683(2016).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li>
<li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li>
<li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li>
<li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6(2016).</li>
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<li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li>
</ol>

著者には、開示はしません。

感度と分解能のタンパク質が生体試料のプロテオーム研究のため重要です。細胞内微量に含まれるタンパク質を検出できることに大きな価値があります。代表取締役には、感度の向上と蛋白質とのアイソ フォーム4の検出のための解像度を提供できます。
この技術は、多くプロテオーム研究レポート5,6,7で正常に使用されています。それでも、いくつかの制限が実際に場合でも、彼らは従来の immunoblots でうまく動作しないすべての一次抗体は、信号を与えることができるなど、それに関連付けられました。まだ、このテクニックは非常に新しいので、代表取締役で機能する検証済みの抗体のリストはありません。最後に、楽器は一度により少ない 12 サンプルまたは 96 以上のサンプルを処理できません。
代表取締役は従来法の代替法が、そ...

その電荷1,2,3蛋白を解決する自動、キャピラリーを用いたイムノアッセイ法であるキャピラリー等電集中 (代表取締役)それは高い再現性で迅速かつ定量的に蛋白質とそのファーストクリーニング変更を解決することができます。西部にしみが付くことなど従来の方法に代わるものを提示します。西部にしみが付くことは非常に容易にアクセスできるサンプルの豊富な蛋白質の存在を確認するため良い変動、時間消費、および正確な定量すべての存在の課題、特に生体組織サンプルを調べるとき。確かに、変動は西部にしみが付くことで本質的な問題があると多数手順、読み込みと SDS ページのゲルの実行、膜への蛋白の転送など様々 な試薬と孵化 (e.g、プライマリおよびセカンダリ。ECL 抗体)、x 線フィルム4を開発。現在、西部のしみが付く技術は化学発光信号 (デジタル西部劇) のデジタル録音の実装を改善します。、自動化された西部しみが付くシステムは近年、すなわち毛細血管西部、よりハンズフリーし、ゲル無料システムであります。全体アッセイ システム3,4に次のサンプル プレート (すべての必要な試薬とサンプル) の読み込みを自動化されています。楽器は蛋白質の分離などのすべての手順を実行、抗体の孵化、毛細血管壁へのタンパク質固定化を別の手順と開発化学発光シグナルの定量化と洗います。したがって、ここに示す代表取締役手順は、高い解像度と感度を提供します。
この方法は、機密性の高い信号を生成され、蛋白質1の用いたから定量化することができます。優れた再現性と高感度はこの技術を臨床サンプルの解析に非常に便利になります。それは、検出、蛋白質のポスト並進変更 (例えば、異なるリン酸化タンパク質アイソ フォーム) を区別することができます。この技術は、正常に異なるシグナル伝達経路4,5がん3、新しい治療法を開発することを目指して臨床研究を分析する使用されています、蛋白質バイオ マーカーおよび薬剤の発見のための素晴らしい可能性を持っています。.

<table><tbody><tr><td>NanoPro 1000</td><td>プロテインシンプル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレミックス G2、pH 5&ndash;8(ネスト)分離グラジエント、pH 2&ndash;4 プラグ</td><td>ProteinSimple</td><td>040-972</td><td>Ampholyte premix</td></tr><tr><td>DMSO inhibitor mix</td><td>ProteinSimple</td><td>040-510</td><td>Phosphatase inhibitors; cIEF 1:50 希釈 使用</td></tr><tr><td>水性阻害剤ミックス</td><td>ProteinSimple</td><td>040-482</td><td>プロテアーゼ阻害剤; cIEF 1:25 希釈 使用</td></tr><tr><td>pI 標準ラダー 3</td><td>ProteinSimple</td><td>040-646</td><td>cIEF 1:60 希釈使用</td></tr><tr><td>サンプル希釈剤</td><td>ProteinSimple</td><td>040-649</td><td></td></tr><tr><td>抗体希釈剤&nbsp;</td><td>ProteinSimple</td><td>040-309</td><td></td></tr><tr><td>ウォッシュ濃縮物</td><td>ProteinSimple</td><td>041-108</td><td></td></tr><tr><td>陽極質詰め替え</td><td>ProteinSimple</td><td>040-337</td><td></td></tr><tr><td>陰極液詰め替え</td><td>ProteinSimple</td><td>040-338</td><td></td></tr><tr><td>過酸化物XDR</td><td>タンパク質Simple</td><td>041-084</td><td></td></tr><tr><td>ルミノール</td><td>ProteinSimple</td><td>040-652</td><td></td></tr><tr><td>ビシン/CHAPS 溶解バッファー</td><td>タンパク質シンプル</td><td>040-764</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリー-電荷分離 (1パック) for&nbsp;</td><td>ProteinSimple</td><td>CBS700</td><td></td></tr><tr><td>Assay Plate/Lid Kit</td><td>ProteinSimple</td><td>040-663</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&nbsp;</td><td>ジャクソン・イムノリサーチ&nbsp;</td><td>711-035-152</td><td>cIEF用(1:300)</td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ-アフィニピュアロバ抗マウスIgG(H + L)&nbsp;</td><td>ジャクソン・イムノリサーチ&nbsp;</td><td>715-035-150</td><td>使用される cIEF の場合 (1: 300)</td></tr><tr><td>Phospho-Erk 1/2 一次抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9101</td><td>使用される cIEF の場合 (1: 50)</td></tr><tr><td>Pan Erk 一次抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9102</td><td>使用される cIEF の場合 (1: 100)</td></tr><tr><td>コンパス ソフトウェア</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-010</td><td></td></tr><tr><td>MV2 (EBM-2)</td><td>PromoCell</td><td>&nbsp;C-22221</td><td>内皮細胞基底培地</td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地 MV2 SupplementPack</td><td>PromoCell</td><td>C-39221</td><td></td></tr><tr><td>VEGFA</td><td>PeproTech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Long R3 IGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85580C/I1146</td><td>インスリン様成長因子</td></tr><tr><td>Bioruptor (Sonicator)</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>BCA Proteinアッセイキット&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAG MOPS SDS ランニングバッファー (20X)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NP0006</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブボルテクサー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td><td></td><td></td><td></td></tr>機マイクロ<tr><td>タイタープレートアダプター 遠心分離</td><td></td><td></td><td></td>機用</tr><tr><td>ピペッター用&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>:氷</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

免疫ブロット生体試料中のタンパク質の特徴の多くの実験室のルーチンの技術となっています。次のプロトコルは、代替戦略を提供、従来免疫ブロット キャピラリー等電の多くの利点 (代表取締役) を中心に比べています。完全な西部のしみが付くプロシージャが起こる超毛細血管内抗体ベース、自動化、迅速かつ定量的な方法です。この手法、しみの除去、膜に転送するゲルを必要としないか、または x 線フィルム、通常従来免疫ブロットを必要です。充満 (等電点; pI) によるを使用してより小さい、1 マイクロリットルの蛋白質の分離、ここ (400 nL) 総蛋白ライセートの。電気泳動後のタンパク質はプライマリとセカンダリ (西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 共役) 続いて、紫外光照射による毛細血管壁に固定化抗体の孵化、バインドは検出が強化されました。化学発光 (ECL)、キャプチャおよび電荷結合素子 (CCD) カメラによって記録が可能な光信号を生成します。デジタル画像分析することができ、定量化 (ピーク面積) ソフトウェアを使用しています。この高スループット プロシージャは、同時に 96 のサンプルを処理できます。非常に敏感な picogram の範囲でタンパク質検出自動化のため再現性の高い結果を生成します。すべてのこれらの側面は、試料 (例えば、ティッシュ サンプルおよび生検) の数量が制限要因非常に貴重です。技術がより広いアプリケーションだけでなく、薬や抗体、バイオ マーカーの探索と診断のためのスクリーニングを含みます。

新しいアッセイのデザイン:図 1 aに、アッセイ プレート レイアウトを示します。最大限に、各条件 (抗体) の 12 の井戸のブロックで 384 ウェル プレートから 96 ウェルを使用できます。12 ウェルの各ブロックは A1 A12 または A13 A24 のいずれかから開始できます。色分けされた行は互いのサンプルや試薬を区別すること。分析テンプレート (図 1 b)、それに関連する情報で、結果分析の後の段階で使用できる、特定のアッセイを格納できます。図 1は、プロトコルの概要を示しています。
VEGF 刺激による血管内皮ライセートのリン酸化とペプタイド細胞外規制キナーゼ (pERK1/2、ERK1/2) 蛋白質の検出:...

キャピラリー等電集中はタンパク質と非常に小さい試料からアイソ フォームの詳細な特性解析を有効に、抗体を用いた、超高感度、高スループット手法です。次に、自動化・ ロボット化の方法で特定の蛋白質とアイソ フォームの検出と定量のためのプロトコルについて説明します。

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

この方法は、バイオマーカー発見、創薬、診断、薬物や抗体のスクリーニングなど、生物医学の研究分野における重要な質問に答える手助けとなります。この技術の主な利点は、高スループットであり、非常に再現性の高い方法でタンパク質アイソフォームを検出できることです。この技術の意味は、影響を受けたタンパク質またはそのアイソフォームを測定することができるため、多くの疾患の診断にまで及びます。この方法は、細胞シグナル伝達経路に関する洞察を提供することができますが、特定のタンパク質を分析する必要がある他のシステムにも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、気泡の除去、プレートのローディング、エトセトラなどのトリックのためにアッセイのステップを学ぶのが難しいため、非常に重要です。まず、DMSO阻害剤の1マイクロリットルとプロテアーゼ阻害剤の2マイクロリットルを47マイクロリットルのサンプル希釈剤に加えてサンプル希釈剤混合物を調製し、DMSOおよびプロテアーゼ阻害剤の最終濃度が1つのX.希薄化したタンパク質溶解物となるように、所望の濃度を得る。次に、3.325マイクロリットルの標準ラダー、6マイクロリットルのプロテアーゼ阻害剤、および3マイクロリットルのDMSO阻害剤を137.675マイクロリットルのアントライトプレミックスに加えます。サンプルを少なくとも15秒間渦し、氷の上に置いておく。DMSOプロテアーゼ阻害剤と等電点標準ラダーの最終的な濃度が1つのXであり、毛細管内のタンパク質が最終的な所望の濃度に達するように、2つの調製された溶液を1〜3つの比率で混合します。タンパク質をサンプル混合物に添加した後、すべてのステップは氷の上または摂氏4度で行われます。氷の上に384ウェルプレートを置きます。自動ウェスタンブロッティングシステムソフトウェアで設計されたアッセイテンプレートレイアウトに従って、サンプルミックスの10マイクロリットルをプレートの適切なウェルにロードします。これに続いて、一次および二次抗体を希釈する抗体希釈剤を用いた。次いで、10マイクロリットルの一次抗体と15マイクロリットルの二次抗体を各ウェルにピペットします。次に、ルミノールと過酸化物XDRを1対1の比率で混合する。15マイクロリットルのルミノール過酸化物のピペットを各ウェルに混合する。サンプルとレーガンがプレートに加えられたら、遠心分離機は2500倍Gで10分間、摂氏4度で液体を回転させ、泡を取り除きます。それでも気泡が残っている場合は、薄いピペットチップを使用して手動で取り外します。自動ウェスタンブロッティングシステムソフトウェアを開き、ファイルメニューからnew'をクリックします。レイアウト ペインに移動し、384 ウェル プレートのレーガンとサンプルの場所を割り当てます。ブロック内の任意のウェルをクリックして、レーガンの割り当てを行います。各 12 ウェルの行ブロックを選択します。次に、レイアウト ペインのツールバーに移動し、サンプル、プライマリ、セカンダリ、またはルミノール行ブロックを挿入します。プロトコル ペインに移動し、プレート内のレーガンの場所を選択します。次に、サンプル列のセルをクリックし、ドロップダウンメニューからレーガンを選択します。同じ方法で、各サイクルのプライマリ、セカンダリ、およびルミノールのレーガンの場所を選択します。一次抗体または二次抗体カラム内の細胞を 1 つずつクリックし、必要に応じてインキュベーション時間を変更します。次に、プロトコルセクションの[追加]ボタンをクリックしてサイクルを追加します。テンプレート ペインに、一次抗体と二次抗体の同一性、カタログ番号、希釈などのサンプルに関する情報を入力します。新しいアッセイファイルを保存します。スタートボタンをクリックする前に、レイアウトを素早くチェックして、すべてが正しいことを確認してください。さて、実行を開始するには、[開始]をクリックします。ソフトウェアは、廃棄物を取り除き、水と毛細血管ボックスを補充し、リソーストレイにアノライトとカホライトを追加し、洗浄バッファを追加し、冷却されたサンプルトレイにプレートをロードするようにユーザーに促します。計測器のステータスバーは、実行開始後数分後にコンピュータ画面に表示されます。[概要の実行] 画面をクリックして、ステータス ペインと分離ペインを表示します。毛細管内の電気泳動分離を観察するには、目的のサイクルをクリックし、コントロールパネルの再生ボタンをクリックして、その毛細血管の分離ムービーを再生します。実行ファイルを開き、分析画面タブを選択します。[編集]をクリックし、次に解析を行って等電点範囲を変更します。適切な等電点規格を適用します。ピークフィットを追加し、ピーク名を追加します。最後に、[ピーク]タブで使用するデータを選択し、さらに分析するためにデータをエクスポートします。血管内皮増殖因子刺激性ライセート由来のリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼの電界球造図をここに示す。血管内皮増殖因子で観察されるリン酸化タンパク質の誘導が非常に高い。インセットは、内因性負荷制御HSP 70を示し、未処理および処理されたサンプルの両方に対するサンプルの同様の負荷を示す。従来のイムノブロットでは、リン酸化された細胞外シグナル調節キナーゼタンパク質が毛細管等電体集光解析によって4つのピークに分解されたにもかかわらず、2つのバンドしか検出されなかった。血管内皮増殖因子刺激性ライセート由来の細胞外シグナル調節キナーゼの電解液球をここに示す。差し込みでは、並列で使用されるのと同じ負荷制御が表示されます。従来のイムノブロットは、細胞外シグナル調節キナーゼ1つと細胞外シグナル調節キナーゼ2に対応する2つのバンドのみを示す。毛細管等電体の焦点合わせに対して、細胞外シグナル調節キナーゼタンパク質は6つのピークに分解され、4つの異なるリン酸化ピークと2つの非リン酸化ピークに対応した。一度習得すると、この技術は、サイクルの数に応じて、それが適切に実行されている場合、数時間で行うことができます。この手順を試みている間、従来の免疫ブロットと比較して、より高い抗体濃度を使用することを覚えておくことが重要です。この方法の視覚的なデモンストレーションは、気泡の除去、プレートのローディング、エトセトラなどのトリックのためにアッセイのステップを学ぶのが難しいため、非常に重要です。このビデオを見た後、アッセイの設計、サンプルの準備、アッセイの実行、データの分析を行い、タンパク質のさまざまなアイソフォームを観察する方法をよく理解する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

安定同位体の標準と抗ペプチド抗体（SISCAPA）によって、それぞれのタンパク質の代用物としてのペプチドの定量的な測定を提供するために、安定同位体希釈質量分析法（MRM -...

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

このビデオは、ヒトの血小板から筋萎縮性側索硬化症(ALS)に関連するタンパク質バイオマーカーを検出するための毛細血管電気泳動イムノアッセイプロトコルを示しています。ALSバイオマーカータンパク質の存在の確認は、血小板タンパク質のサイズベースの分離とそれに続く化学発光検出によって達成されます。...

タンパク質バイオマーカー検出のためのキャピラリー電気泳動イムノアッセイ

ここでは、モノクローナル抗体の固有の物理化学的不均一性を品質属性として評価するための包括的な毛細血管ゾーン電気泳動プロトコルを提示します。...

ニュートラルキャピラリーを使用したモノクローナル抗体アイソフォームのキャピラリー電気泳動分離

総蛋白製剤からの薬物の標的タンパク質を測定する商用プラットフォームを用いたキャピラリーを用いた免疫測定法が示されています。さらに、露光時間、タンパク質濃度と抗体希釈アッセイ...

プロシージャおよび自動キャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法のためのキーの最適化戦略

詳細なプロトコルは、分離、同定、キャピラリー ゾーン電気泳動-エレクトロ スプレー イオン化タンデム質量分析法 (CZE-ESI MS/ミリ秒) を使用して蛋白質のサンプルの proteoforms の特性に記述されています。単純な蛋白質のサンプルの proteoforms の高分解能特性と複雑なプロテオーム サンプルで proteoforms...

キャピラリー ゾーン電気泳動タンデム質量分析法による大規模なトップダウン プロテオミクス

目的は、液相等電体集光(IEF)法を用いることによって、生理活性小分子、複雑な植物抽出物からのペプチド、および病原性微生物からのタンパク質を分画し、単離することです。さらに、分離した分子を同定し、その生物活性を確認した。...

生物活性小分子、天然源からのペプチド、微生物からのタンパク質の分離(IEF)法による分離

哺乳類細胞抽出物からのイノシトールピロリン酸の絶対定量のためのキャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化質量分析の手順が記載されている。...

キャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化質量分析によるイノシトールピロリン酸の絶対定量(英語)

このプロトコルは、カスタムメイドのポータブルFRET分析器を用いて蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）センサデータの迅速かつ高感度定量を記載しています。デバイスは、糖度の実用的かつ効率的な評価を可能にする、検出感度を最大臨界温度範囲にマルトースを検出するために使用しました。...

ポータブルFRETアナライザを使用して高感度かつ迅速な蛍光検出

高純度のRNA単離に対する阻害効果を持つ油分、タンパク質、ポリフェノールを多く含む植物種子からのRNA単離方法を確立することに成功しました。私たちの方法は、シード中の低レベルの転写産物を持つ遺伝子の発現を監視するのに適しています。...

定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたRNAの単離のための効率的な方法

多くのタンパク質は、膜表面に付着するとその機能を果たします。ナノディスク膜上の外因性タンパク質の結合は、透過型電子顕微鏡によって間接的に画像化することができます。我々は、ネガティブ染色のリンスホタングステン酸ナトリウムによって誘発されるナノディスクの特徴的なスタッキング(rouleau)が、外部タンパク質の結合によって防止されることを示す。...

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

学ぶタンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソフォームの高感度・定量的検出手法。バイオマーカー発見や創薬研究に有用で、疾患診断におけるタンパク質解析に応用可能です。

タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出

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タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソフォームの高感度・定量的検出