タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出

キャピラリー等電集中はタンパク質と非常に小さい試料からアイソ フォームの詳細な特性解析を有効に、抗体を用いた、超高感度、高スループット手法です。次に、自動化・ ロボット化の方法で特定の蛋白質とアイソ フォームの検出と定量のためのプロトコルについて説明します。

この方法は、バイオマーカー発見、創薬、診断、薬物や抗体のスクリーニングなど、生物医学の研究分野における重要な質問に答える手助けとなります。この技術の主な利点は、高スループットであり、非常に再現性の高い方法でタンパク質アイソフォームを検出できることです。この技術の意味は、影響を受けたタンパク質またはそのアイソフォームを測定することができるため、多くの疾患の診断にまで及びます。

この方法は、細胞シグナル伝達経路に関する洞察を提供することができますが、特定のタンパク質を分析する必要がある他のシステムにも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、気泡の除去、プレートのローディング、エトセトラなどのトリックのためにアッセイのステップを学ぶのが難しいため、非常に重要です。まず、DMSO阻害剤の1マイクロリットルとプロテアーゼ阻害剤の2マイクロリットルを47マイクロリットルのサンプル希釈剤に加えてサンプル希釈剤混合物を調製し、DMSOおよびプロテアーゼ阻害剤の最終濃度が1つのX.希薄化したタンパク質溶解物となるように、所望の濃度を得る。

次に、3.325マイクロリットルの標準ラダー、6マイクロリットルのプロテアーゼ阻害剤、および3マイクロリットルのDMSO阻害剤を137.675マイクロリットルのアントライトプレミックスに加えます。サンプルを少なくとも15秒間渦し、氷の上に置いておく。DMSOプロテアーゼ阻害剤と等電点標準ラダーの最終的な濃度が1つのXであり、毛細管内のタンパク質が最終的な所望の濃度に達するように、2つの調製された溶液を1〜3つの比率で混合します。

タンパク質をサンプル混合物に添加した後、すべてのステップは氷の上または摂氏4度で行われます。氷の上に384ウェルプレートを置きます。自動ウェスタンブロッティングシステムソフトウェアで設計されたアッセイテンプレートレイアウトに従って、サンプルミックスの10マイクロリットルをプレートの適切なウェルにロードします。

これに続いて、一次および二次抗体を希釈する抗体希釈剤を用いた。次いで、10マイクロリットルの一次抗体と15マイクロリットルの二次抗体を各ウェルにピペットします。次に、ルミノールと過酸化物XDRを1対1の比率で混合する。

15マイクロリットルのルミノール過酸化物のピペットを各ウェルに混合する。サンプルとレーガンがプレートに加えられたら、遠心分離機は2500倍Gで10分間、摂氏4度で液体を回転させ、泡を取り除きます。それでも気泡が残っている場合は、薄いピペットチップを使用して手動で取り外します。

自動ウェスタンブロッティングシステムソフトウェアを開き、ファイルメニューからnew'をクリックします。レイアウト ペインに移動し、384 ウェル プレートのレーガンとサンプルの場所を割り当てます。ブロック内の任意のウェルをクリックして、レーガンの割り当てを行います。

各 12 ウェルの行ブロックを選択します。次に、レイアウト ペインのツールバーに移動し、サンプル、プライマリ、セカンダリ、またはルミノール行ブロックを挿入します。プロトコル ペインに移動し、プレート内のレーガンの場所を選択します。

次に、サンプル列のセルをクリックし、ドロップダウンメニューからレーガンを選択します。同じ方法で、各サイクルのプライマリ、セカンダリ、およびルミノールのレーガンの場所を選択します。一次抗体または二次抗体カラム内の細胞を 1 つずつクリックし、必要に応じてインキュベーション時間を変更します。

次に、プロトコルセクションの[追加]ボタンをクリックしてサイクルを追加します。テンプレート ペインに、一次抗体と二次抗体の同一性、カタログ番号、希釈などのサンプルに関する情報を入力します。新しいアッセイファイルを保存します。

スタートボタンをクリックする前に、レイアウトを素早くチェックして、すべてが正しいことを確認してください。さて、実行を開始するには、[開始]をクリックします。ソフトウェアは、廃棄物を取り除き、水と毛細血管ボックスを補充し、リソーストレイにアノライトとカホライトを追加し、洗浄バッファを追加し、冷却されたサンプルトレイにプレートをロードするようにユーザーに促します。

計測器のステータスバーは、実行開始後数分後にコンピュータ画面に表示されます。[概要の実行] 画面をクリックして、ステータス ペインと分離ペインを表示します。毛細管内の電気泳動分離を観察するには、目的のサイクルをクリックし、コントロールパネルの再生ボタンをクリックして、その毛細血管の分離ムービーを再生します。

実行ファイルを開き、分析画面タブを選択します。[編集]をクリックし、次に解析を行って等電点範囲を変更します。適切な等電点規格を適用します。

ピークフィットを追加し、ピーク名を追加します。最後に、[ピーク]タブで使用するデータを選択し、さらに分析するためにデータをエクスポートします。血管内皮増殖因子刺激性ライセート由来のリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼの電界球造図をここに示す。

血管内皮増殖因子で観察されるリン酸化タンパク質の誘導が非常に高い。インセットは、内因性負荷制御HSP 70を示し、未処理および処理されたサンプルの両方に対するサンプルの同様の負荷を示す。従来のイムノブロットでは、リン酸化された細胞外シグナル調節キナーゼタンパク質が毛細管等電体集光解析によって4つのピークに分解されたにもかかわらず、2つのバンドしか検出されなかった。

血管内皮増殖因子刺激性ライセート由来の細胞外シグナル調節キナーゼの電解液球をここに示す。差し込みでは、並列で使用されるのと同じ負荷制御が表示されます。従来のイムノブロットは、細胞外シグナル調節キナーゼ1つと細胞外シグナル調節キナーゼ2に対応する2つのバンドのみを示す。

毛細管等電体の焦点合わせに対して、細胞外シグナル調節キナーゼタンパク質は6つのピークに分解され、4つの異なるリン酸化ピークと2つの非リン酸化ピークに対応した。一度習得すると、この技術は、サイクルの数に応じて、それが適切に実行されている場合、数時間で行うことができます。この手順を試みている間、従来の免疫ブロットと比較して、より高い抗体濃度を使用することを覚えておくことが重要です。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、気泡の除去、プレートのローディング、エトセトラなどのトリックのためにアッセイのステップを学ぶのが難しいため、非常に重要です。このビデオを見た後、アッセイの設計、サンプルの準備、アッセイの実行、データの分析を行い、タンパク質のさまざまなアイソフォームを観察する方法をよく理解する必要があります。