カエノラブディティス ・ エレガンスにおける倍数性の操作

この方法論の全体的な目標は、生物学的プロセスにおける全ゲノム倍数化の役割または結果を研究するために、任意の遺伝子型または核型の二倍体から安定した四倍体株を導き出すことです。この方法は、全ゲノム倍数体化が遺伝子投与量、生物学的スケーリング、細胞外シグナル伝達、ゲノム不安定性、薬物耐性の発達、ストレスへの適応、および種分化のメカニズムに及ぼす影響を研究するのに役立ちます。この技術の主な利点は、効率的で、用途が広く、単純であり、多細胞生物で唯一利用可能な技術であり、任意の二倍体株から安定した肥沃な四倍体を生成することです。

私が最初にこの方法を思いついたのは、精母細胞と卵子のrec-8変異体の染色体分配表現型を分析していたときでした。Rec-8変異体は二倍体の精子と卵子を産生し、Rec-8遺伝子の発現レベルを低下させると受精時に四倍体の子孫が産生される可能性があることを示しています。この手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるキャサリン・リベラ・ゴメスです。

大腸菌でrec-8二本鎖RNA発現を誘導するには、1ミリモルのIPTGと1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンを含むNGM寒天プレートを調製します。これらのプレートは、摂氏4度の暗所で最大4週間保管してください。次に、適切なrec-8クローンを運ぶ細菌を準備します。

適切な抗生物質が入ったプレートにそれらを縞模様にし、バクテリアを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、プレートからの単一のコロニーを同じ抗生物質濃度のLBの4ミリリットルに接種し、攪拌しながら摂氏37度で一晩で細菌を増殖させます。翌日、最終濃度が1ミリモルのIPTGになるまでIPTGを添加することにより、二本鎖RNAの産生を誘導します。

その後、インキュベーションを40分間続けます。次に、準備したNGM IPTGプレートに種をまきます。100〜200マイクロリットルの培養物をプレートに加え、室温で暗所で一晩インキュベートします。

翌朝、3〜4匹の若いL4ステージの雌雄同体をrec-8バクテリアプレートに置き、暗闇の中で摂氏15度で成長させます。約3日後、F1雌雄同体がL3からL4の幼虫期になったら、さらにrec-8 RNAiバクテリアプレートを作り始めます。rec-8バクテリアプレートで約4日間過ごした後、F1 L4若年雌雄同体のうち20匹を新たに誘導したrec-8 RNAiプレートに移し、自家受精させます。

また、同じ系統の未処理の雄を4〜6匹含めることも可能である。後で、表現型が長いF2子孫を確認します。彼らは全体的に野生型よりも大きく、前進すると体が余分に回転し、頭から尾まで正弦波の体を曲げる波が発生します。

これらの推定四倍体を通常のOP50またはHB101大腸菌に移します。F3子孫についてもプレートをスクリーニングします。ただし、これらのF3は、同じF2母の兄弟である可能性があるため、独立した系統とは見なされません。

集めた長いワームを自家受精させて繁殖させます。各世代から3〜6匹の長い動物を新しいプレートに移し続け、長い子孫だけが産まれるまで続けます。長い線虫はしばしば不妊であり、子孫を産まないため、これには数世代かかる場合があります。

四倍体株には12の染色体ペアがあり、未受精卵子のDAPI染色体を数えることで検証できます。これを行うには、5〜10マイクロリットルのM9バッファーをスライドにドロップし、6〜10個の推定四倍体をドロップに移します。解剖顕微鏡で、M9の大部分を糸くずの出ないクリーニングティッシュに慎重に吸収します。

次に、10マイクロリットルの90%エタノールをワームに落とし、エタノールが完全に蒸発するのを見ます。蒸発が終わったらすぐに、エタノールを加えて蒸発するのを見るプロセスを繰り返してください。合計で、4つのアプリケーションで10マイクロリットルを追加します。

最後の一滴が蒸発した後、1マイクロリットルあたり2ナノグラムのDAPIを6マイクロリットルまたは同様の染色液で追加します。スライドを長期間保管するには、ワームを市販または自家製の退色防止剤に取り付けます。次に、カバースリップを追加し、マニキュアで端を密封します。

マニキュアが乾いたら、スライドにスコアを付けることができます。蛍光顕微鏡と100倍の倍率を使用してください。まず、精子のすぐ隣接し、まだ精子にも子宮にも入っていない最も成熟した未受精卵子を見つけます。

ここでのDAPI本体は、おそらく単一の染色体ペアです。次に、卵子の核に焦点を合わせ、顕微鏡のファインフォーカスを使用して、DAPI体をカウントしながら上から下にゆっくりとスキャンします。次に、フォーカスを下から上に動かして、同じ核内のDAPI体を数え直します。

野生型の卵子は、平均して6つのDAPI体を持っています。12のDAPI体の存在は、この系統の動物が部分的または完全な四倍体であることを示しています。系統ごとに少なくとも10匹の動物を分析します。

多くの場合、染色体ペアは非常に接近しているか接触しているため、DAPI本体の数は実際の染色体ペアの数よりも少ないことがよくあります。複数の四倍体株は、rec-8二本鎖RNAを発現するC.elegans細菌に供給することにより生成されました。四倍体は、雌雄同体を2〜3世代にわたって自家受精させることによって、または雌雄同体の第一世代と同じ遺伝子型の未治療の男性と交配することによって発生する可能性があります。

後者のシナリオでは、交配中のオスは、交配中にL4段階以降からrec-8 RNAi細菌に曝露されます。四倍体株は、二倍体雌雄同体の卵母細胞に見られる6つの染色体ペアと比較して、四倍体の卵母細胞に見られる12の染色体ペアの存在をスクリーニングすることによって確認されました。2種類の四倍体雌雄同体が同定されました。

1つは二倍体雌雄同体と同様の周波数でオスを産み、もう1つははるかに高い周波数でオスを産みました。前者はすべての染色体で四倍体、後者はすべての常染色体で四倍体ですが、性染色体では三倍体です。四倍体株は成長が遅く、小さな雛を産みます。

四倍体株の表面検査では、異数性卵子の数が十分に増加していることや、観察された雛サイズの縮小を説明するのに十分な異常な卵子または精子細胞の分裂は明らかにされていません。その開発後、この技術は、発生がんおよび進化生物学の分野の研究者が、多種多様な生物学的機能に対する全ゲノム倍数化の役割を探求する道を開きました。この技術を使用する際には、常に新しいNGM IPTGプレートを使用して、二本鎖RNAの細菌発現を誘導することを覚えておくことが重要です。

すべてがうまくいけば、4倍体は3週間以内に製造できます。