エタノール固定とDAPI染色:C.エレガンスのDNAを可視化する方法

- 顕微鏡スライド上に緩衝液を滴下することから始めて、無傷の線虫を液滴に移します。線虫が所定の位置に留まったら、糸くずの出ないティッシュを使用してバッファーを吸収して取り除きます。サンプルを90%エタノールで数回浸してサンプルを固定し、各アプリケーション後に蒸発させます。

最終すすぎ後にエタノールが蒸発したら、核酸色素であるDAPIを含む溶液をサンプルに加えます。DAPIは、DNAのマイナーグルーブにあるアデニンとチミン塩基に優先的に結合します。結合すると、DAPI-DNA複合体は紫外線を吸収し、可視の青色光を放出します。

次に、サンプルの保存期間を延ばすために、退色防止防腐剤を追加します。カバースリップを貼り、スライドに密封します。次に、青色フィルター付きの蛍光顕微鏡を使用して、細胞とそのサイクルステータスに応じて、単一染色体、姉妹染色分体対、または全核を表すDAPI体を視覚化します。この実験では、卵子のDAPI染色された姉妹染色分体ペアをカウントし、線虫Caenorhabditis elegansの四倍体株を特定します。

- 四倍体株には12の染色体ペアがあり、未受精卵子のDAPI染色体を数えることで検証できます。これを行うには、5〜10マイクロリットルのM9バッファーをスライドにドロップし、6〜10個の推定四倍体をドロップに移します。解剖顕微鏡で、M9の大部分を糸くずの出ない洗浄ティッシュに慎重に吸収します。

次に、10マイクロリットルの90%エタノールをワームに落とし、エタノールが完全に蒸発するのを確認します。蒸発が終わったらすぐに、エタノールを加えて蒸発するのを見るプロセスを繰り返してください。合計で、4つのアプリケーションで10マイクロリットルを追加します。最後の一滴が蒸発した後、1マイクロリットルあたり2ナノグラムで6マイクロリットルのDAPIを追加するか、または同様の汚れを加えます。

スライドを長期間保管するには、市販または自家製の退色防止剤にワームを取り付けます。次に、カバースリップを追加し、マニキュアで端を密封します。マニキュアが乾いたら、スライドにスコアを付けることができます。蛍光顕微鏡と100倍の倍率を使用します。

まず、精子のすぐ隣接していて、まだ精子にも子宮にも入っていない、最も成熟した未受精卵子を見つけます。ここでのDAPI本体は、おそらく単一の染色体ペアです。次に、卵子の核に焦点を合わせ、顕微鏡のファインフォーカスを使用して、DAPI体をカウントしながら、上から下にゆっくりとスキャンします。次に、フォーカスを下から上に動かして、同じ核内のDAPI体を数え直します。

野生型の卵子は、平均して6つのDAPI体を持っています。12のDAPI体の存在は、この系統の動物が部分的または完全な四倍体であることを示しています。系統ごとに少なくとも10匹の動物を分析します。多くの場合、染色体ペアは非常に接近しているか接触しているため、DAPI本体の数は実際の染色体ペアの数よりも少ないことがよくあります。